TRV病毒誘導(dǎo)大豆基因沉默體系優(yōu)化及應(yīng)用

李文辰 劉鑫 康越 李偉 齊澤錚 于璐 王芳

（1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，齊齊哈爾 161005）

基因沉默是植物界普遍存在的一種防御反應(yīng)，其本質(zhì)是降低或停止植物基因的表達(dá)，根據(jù)基因轉(zhuǎn)錄前后可分為兩種，一是轉(zhuǎn)錄前由于啟動(dòng)子失活或基因片段特異性甲基化產(chǎn)生的基因沉默（transcriptional gene silence，TGS），二是轉(zhuǎn)錄后mRNA被降解導(dǎo)致的基因沉默（post-transcriptional gene silence，PTGS）［1］。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是一種準(zhǔn)確高效的RNA沉默方法，屬于PTGS類型的RNAi技術(shù)，可以在多種植物中精準(zhǔn)沉默植物內(nèi)源基因且在數(shù)周內(nèi)完成對(duì)基因的沉默，不需要轉(zhuǎn)基因植株［2］，廣泛應(yīng)用在植物基因功能研究。該技術(shù)利用病毒載體將待沉默的RNA轉(zhuǎn)移至寄主植物中，病毒雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）被植物的防御機(jī)制所識(shí)別，并被植物體內(nèi)特異性核酸內(nèi)切酶切割成21-23 nt小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），觸發(fā)PTGS反應(yīng)，siRNA與Agronaute（AGO）效應(yīng)復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)復(fù)合物（RNA-inducing silencing complex，RISC），RISC與植物中mRNA和病毒中的mRNA結(jié)合產(chǎn)生沉默，其特點(diǎn)在于依靠植物防御機(jī)制，抵御病毒侵染的同時(shí)完成基因沉默［3］。

目前，已開(kāi)發(fā)出超過(guò)30個(gè)病毒載體被用于VIGS體系構(gòu)建，如煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus, TMV）、大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus, BSMV）、大豆花葉病毒（soybean mosaic virus, SMV）等［4］，廣泛應(yīng)用在茄科、十字花科、禾本科等植物的基因功能研究［5］。

利用VIGS技術(shù)探索大豆基因功能已成為克服大豆基因轉(zhuǎn)化困難的一種有效研究手段。以豌豆早期褐變病毒（pea early-browning virus, PEBV）、普通花葉病毒（soybean yellow common mosaic virus,SYCMV）、菜豆斑駁病毒（bean pod mottle virus,BPMV）、蘋果潛伏球形病毒（apple latent spherical virus, ALSV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus, CMV）為基礎(chǔ)構(gòu)建的沉默載體已被報(bào)道用于沉默大豆基因［6-10］。

煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV）是目前在VIGS系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的病毒載體，該病毒對(duì)植物的毒害作用較輕，避免了對(duì)基因沉默表型影響［11］。TRV由2條單鏈RNA組成，RNA1編碼RNA聚合酶及運(yùn)動(dòng)蛋白，RNA2編碼病毒外殼蛋白和介導(dǎo)線蟲(chóng)傳播蛋白，并接受外源基因插入［12-13］。TRV寄主范圍廣泛，除侵染煙草外，還可以侵染大部分雙子葉植物如番茄、擬南芥、核桃、棉花、穿心蓮、紫羅蘭［14-18］等，以及部分單子葉植物如小麥、玉米［19］。TRV介導(dǎo)的VIGS體系在大豆中報(bào)道較少。劉曉彬等［20］研究了TRV-VISG技術(shù)與大豆花葉病毒（soybean mosaic virus, SMV）的關(guān)系，證明大豆早期接種TRV不影響大豆對(duì)SMV的抗性。諸多研究結(jié)果表明，TRV能夠在不同組織如葉、花、果實(shí)、種子［21-24］使靶基因沉默，但關(guān)于介導(dǎo)植物根部靶基因沉默的報(bào)道較少。病毒存在宿主范圍，大多數(shù)VIGS病毒載體不能侵染植物的生長(zhǎng)點(diǎn)與分生組織。環(huán)境溫度，載體接種部位、方法對(duì)靶基因的沉默效率均有較大影響。有的病毒載體會(huì)對(duì)宿主植物產(chǎn)生嚴(yán)重的病毒癥狀，導(dǎo)致葉片萎黃、變形、壞死等現(xiàn)象，從而掩蓋了基因沉默的表型。因此針對(duì)不同的植物，選擇合適的病毒載體與接種方法極為重要［2］。

本研究以八氫番茄紅素去飽和酶基因（GmPDS）及前期cDNA文庫(kù)中篩選到的差異表達(dá)E3泛素連接酶基因（GmATL）為對(duì)象［25］，采用葉片注射、澆灌根部、葉片注射與澆灌相結(jié)合3種接種方法，建立TRV誘導(dǎo)基因沉默體系，評(píng)估不同接種方法、接種部位、靶基因沉默區(qū)域?qū)χ参锊煌M織之間的沉默效率，為今后大豆基因功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆品種選用中黃13（Glycine max_ZH13），由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲(chóng)研究所贈(zèng)送。

根癌農(nóng)桿菌GV3101（pSoup-p19）感受態(tài)細(xì)胞（Cat No.ZC1407）、大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞（Cat No.ZC108）、沉默表達(dá)載體pTRV1（Code No.ZK912）、pTRV2（Code No.ZK914）載體購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物種植及培養(yǎng) 選取飽滿中黃13大豆種子，先后使用70%酒精、0.5% NaClO溶液分別消毒3 min，無(wú)菌水沖洗10 min，直至種子表面無(wú)NaClO殘留。將蛭石與營(yíng)養(yǎng)土按照1∶1混勻并滅菌，種子置于塑料盆（直徑9.5 cm，高12 cm）培養(yǎng)，光周期16 h L/8 h D，25℃恒溫育苗，每盆播種3粒種子，出苗后每一盆保留幼苗一株。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)大豆GmPDS（Gene ID：18G003900）、GmATL3（Gene ID：10079 7420）、內(nèi)參基因EF4（Elongation Factor 1-alpha，Gene ID：110008577）序列，使用SnapGene軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)引物（表1）。GmATL3的沉默區(qū)域設(shè)計(jì)2組引物，GmATL3-1沉默區(qū)域含有ATL基因家族RING-H2保守結(jié)構(gòu)域，GmATL3-2沉默區(qū)域不包含該結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1 GmATL3與GmPDS序列及沉默片段區(qū)域Fig.1 GmATL3 and GmPDS gene sequences and silent fragment regions

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 TRV沉默表達(dá)載體的構(gòu)建 提取中黃13新鮮根部組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、高保真酶25 μL和ddH2O 19 μL；反應(yīng)條件為94℃ 3 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 50 s，34個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后回收并純化，測(cè)定濃度后，與pTRV2載體連接，并轉(zhuǎn)入Stbl3大腸桿菌中，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，提取質(zhì)粒并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果均為100%。將重組質(zhì)粒pTRV2-GmATL3-1、pTRV2-GmATL3-2和pTRV2-GmPDS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，涂布于含50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL利福平LB固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆菌落，菌液PCR驗(yàn)證，-80℃保存菌種。

1.2.4 農(nóng)桿菌侵染液制備及接種 配置1% Silwet-77母液以及MES侵染緩沖液（10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2·6H2O），4℃冷藏。待大豆出苗后3 d，將保存的pTRV1、pTRV2、pTRV2-GmPDS、pTRV2-GmATL3-1和pTRV2-GmATL3-2農(nóng)桿菌菌液劃線于含50 μg/mL卡那霉素與50 μg/mL利福平LB固體培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取單克隆菌于液體LB培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)，將菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，培養(yǎng)至OD=0.5-0.6，4 000 r/min離心10 min，使用MES緩沖液懸浮菌體，再次離心，去除上清液，加

2 結(jié)果

2.1 中黃13 GmATL3與GmPDS的克隆

以中黃13 cDNA為模板，使用GmATL3-1/GmATL3-1-R、GmATL3-2-F/GmATL3-2-R、GmPDSF/GmPDS-R引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得374、296和218 bp靶基因片段（圖2）。

圖2 GmATL3-1、GmATL3-2、GmPDS PCR凝膠電泳檢測(cè)Fig.2 GmATL3-1, GmATL3-2 and GmPDS PCR electrophoresis detection

入MES緩沖液測(cè)定OD=0.5-0.6，將pTRV1與重組質(zhì)粒的MES侵染液等比混合，每毫升侵染液加入1 μL AS母液與0.1 μL Silwet-77母液，室溫暗處?kù)o置3 h，該過(guò)程需要4 d。此時(shí)大豆的真葉完全展開(kāi)，按照3種方法進(jìn)行接種，第一種方法葉部注射，使用滅菌針頭吸取侵染液于大豆真葉背部葉脈處注射侵染；第二種為灌根法，使用滅菌槍頭吸取5 mL侵染液插入土壤中，貼近根部澆灌侵染［26］；第三種為注射加灌根同時(shí)侵染接種。每隔7 d接種一次，每種方法共接種3次。

1.2.5 大豆全植株基因沉默效果檢測(cè) 侵染后28 d，提取3種處理大豆的第四輪復(fù)葉以及根部RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，將第四輪復(fù)葉及根部cDNA作為模板，熒光定量PCR檢測(cè)GmATL3與GmPDS表達(dá)量，反應(yīng)體系為上下游引物各0.8 μL、cDNA 1 μL、2×TB Green Premix Ex Taq II（TaKaRa）10 μL、ROX Reference Dye（50x）0.4 μL、ddH2O 7 μL。RT-qPCR程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，根據(jù)Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR基因相對(duì)表達(dá)量［27］，以EF-4為內(nèi)參基因，3次生物學(xué)重復(fù)和3技術(shù)性重復(fù)。

2.2 GmPDS基因沉默表型觀察

接種28 d后，分別取TRV-GmPDS基因沉默體系的第二、三、四輪復(fù)葉觀察沉默植株葉片表現(xiàn)癥狀（圖3）。與對(duì)照CK（pTRV1-pTRV2空載農(nóng)桿菌混合液的植株）相比，注射接種葉片出現(xiàn)了由葉邊緣到葉內(nèi)的黃化褪綠現(xiàn)象，灌根接種與注射加灌根接種的葉片表現(xiàn)褪綠黃化以及褶皺褪綠現(xiàn)象。灌根與注射加灌根接種方法的沉默表型更明顯。

圖3 不同接種方法GmPDS沉默葉部表型觀察Fig.3 Phenotypic observations of the leaves after GmPDS silenced via different inoculation methods

分別提取注射接種、灌根接種、注射加灌根接種方法中沉默GmATL3-1、GmATL3-2、GmPDS植株的第四輪葉片與根部RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用qATL3-F/qATL3-R、qPDS-F/qPDS-R引物以及內(nèi)參基因EF-4引物進(jìn)行RT-qPCR，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算出基因相對(duì)表達(dá)量。

注射接種，根部GmATL3-1、GmATL3-2相對(duì)表達(dá)量為35.5%和57.9%，葉部GmATL3-1、GmATL3-2相對(duì)表達(dá)量為4.1%和19.8%，表明注射接種方法在葉部沉默效率較根部高出25%-30%（圖4-A）。

圖4 3種接種方法GmATL3-1、GmATL3-2、GmPDS在根與葉中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expressions of GmATL3-1, GmATL3-2 and GmPDS in the roots and leaves by three inoculation methods

灌根接種，根部GmATL3-1、GmATL3-2相對(duì)表達(dá)量為35.6%和66.7%，在葉部測(cè)定GmATL3-1、GmATL3-2基因相對(duì)表達(dá)量為50.8%和81.1%，表明灌根接種方法在根部基因沉默的效率較葉部高出15%-20%（圖4-B）。

注射加灌根接種，根部GmATL3-1、GmATL3-2相對(duì)表達(dá)量為10.8%和29.2%，葉部GmATL3-1、GmATL3-2相對(duì)表達(dá)量為70.9%和85.7%，表明注射加灌根接種方法在根部基因沉默的效率較葉部高出50%-60%（圖4-C）。

在RT-qPCR結(jié)果中，3種接種方法GmPDS的CT值均為0，表明基因在葉片與根部沉默效果均接近100%，使用半定量RT-PCR檢測(cè)GmPDS沉默情況（圖4-D）。對(duì)照組均有條帶，而處理組（3種接種方法）均無(wú)條帶，進(jìn)一步表明3種接種方法中GmPDS被完全沉默。

綜上所述，在注射接種、灌根接種、注射加灌根接種中，無(wú)論在葉部還是在根部，沉默包含保守結(jié)構(gòu)域GmATL3-1的沉默效果均比沉默不包含保守結(jié)構(gòu)域的GmATL3-2效果好。

3 討論

3.1 TRV介導(dǎo)的大豆PDS沉默表型分析

八氫番茄紅素去飽和基因（PDS）作為VIGS沉默的指示基因在植物中被廣泛使用，將攜帶PDS的病毒載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后侵染植物組織，病毒會(huì)在侵染部位積累，并逐步向整個(gè)植株擴(kuò)散侵染，沉默PDS植物產(chǎn)生葉片白化褪綠的可視表型。本研究不同接種方法產(chǎn)生的植物沉默表型存在差異，灌根接種與雙重接種葉片出現(xiàn)了褪綠斑點(diǎn)以及褶皺褪綠現(xiàn)象，注射接種出現(xiàn)葉片邊緣黃化現(xiàn)象，并且與葉片注射法相比，灌根方法引起更為嚴(yán)重的表型，這與Ryu等［28］的結(jié)論相似。所以根據(jù)不同的試驗(yàn)要求需要選擇合適的接種方法，避免出現(xiàn)因?yàn)閂IGS病毒掩蓋沉默表型的現(xiàn)象。在煙草中，使用TRV-VIGS技術(shù)沉默NbPDS，其沉默效果達(dá)到100%，沉默植株的葉片出現(xiàn)了白化褪綠的現(xiàn)象［29］。而在本研究沉默GmPDS，發(fā)現(xiàn)3種處理下根部與第四輪復(fù)葉GmPDS被完全沉默，葉片產(chǎn)生嚴(yán)重褪綠黃化的現(xiàn)象，但葉片并未出現(xiàn)白化現(xiàn)象。劉曉彬等［20］使用TRV載體通過(guò)葉片注射的方法沉默GmPDS發(fā)現(xiàn)，在第二輪、第三輪復(fù)葉產(chǎn)生明顯褪綠現(xiàn)象，也未出現(xiàn)白化現(xiàn)象。Constantin等［6］使用PEBV沉默PsPDS，豌豆葉片出現(xiàn)褪綠白化現(xiàn)象。Schachtsiek等［30］使用CLCrVVIGS技術(shù)沉默大麻PDS，觀察到葉子出現(xiàn)白化斑點(diǎn)。以上研究結(jié)果表明，不同病毒載體介導(dǎo)不同植物PDS沉默產(chǎn)生表型存在差異。

3.2 不同接種方法對(duì)大豆不同組織的沉默效果

常用的植物病毒接種方法包括摩擦接種（friction inoculation）、噴霧接種（spray inoculation）、葉片注射接種、真空注射接種、灌根接種等［5］。VIGS技術(shù)通常利用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒將病毒載體中靶基因T-DNA整合到宿主植物基因組中，產(chǎn)生內(nèi)源性基因沉默，常采取注射以及灌根接種方法侵染植物。注射方法是接種在植物的莖部與葉部，但是此方法較難浸潤(rùn)玉米等植物葉片，且操作步驟繁瑣，耗費(fèi)大量的人力物力，因此，該方法無(wú)法應(yīng)用田間試驗(yàn)。灌根接種是利用含有二元載體T-DNA病毒載體的根瘤菌侵染植物根際來(lái)完成接種，方法相對(duì)方便快捷。

孫天杰等［26］使用TRV-VIGS技術(shù)沉默大豆內(nèi)源基因發(fā)現(xiàn)，XTH平均沉默效率為93%，TLP平均沉默效率為44%，確定不同基因的沉默效率存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)TRV介導(dǎo)的PDS在根部與葉部沉默效率均接近100%，GmATL3最高沉默效率為96%。接種方法影響不同組織的基因沉默效率。注射接種在根部及葉部的平均沉默效率分別為53%和88%；灌根接種方法對(duì)根部及葉部的平均沉默效率分別為50%和35%；注射加灌根接種方法對(duì)根部及葉部的平均沉默效率為80%和22%。結(jié)果表明，注射方法對(duì)葉片沉默效率最高，注射加灌根結(jié)合方法對(duì)根部沉默效率最高。接種位置影響病毒擴(kuò)散的速率，因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的選擇適宜的接種方法。

3.3 基因沉默片段的選擇

基因沉默效率受到沉默片段的長(zhǎng)度及位置影響，因此選擇合適的沉默片段極為重要。VIGS技術(shù)通常選用200-400 bp的基因序列作為沉默片段。本研究的3個(gè)沉默片段長(zhǎng)度為186、264和342 bp，均具有較好的沉默效果。如果選擇的沉默片段與其他基因同源性較高，會(huì)導(dǎo)致沉默脫靶現(xiàn)象［31］。為了避免沉默的脫靶效應(yīng)，本研究將GmATL3分為2條沉默片段，結(jié)果表明，二者均能夠沉默靶基因，且發(fā)現(xiàn)沉默片段包含保守結(jié)構(gòu)域的基因相對(duì)表達(dá)量在根部及葉部均低于不包含結(jié)構(gòu)域的相對(duì)表達(dá)量，沉默效果無(wú)論在根部還是葉部比均不包含結(jié)構(gòu)域高出20%左右，含有結(jié)構(gòu)域的基因沉默片段具有較高的沉默效率。Chen等［32］發(fā)現(xiàn)沉默牽?；ǜ叨缺Ｊ鼗蛐蛄锌梢猿聊摶蚣易宓亩鄠€(gè)成員。Zhou等［33］沉默本氏煙E2基因高度同源序列，最終沉默E2基因家族大部分基因，且3 nt錯(cuò)配的基因片段會(huì)提高沉默的效果。選擇基因家族的保守區(qū)可能會(huì)沉默一個(gè)基因家族中的多個(gè)基因；如果目標(biāo)基因是某一基因家族中的單個(gè)基因，插入片段應(yīng)是該基因的特異序列，避免有超過(guò)23個(gè)核苷酸序列與其他家族成員相同［34］。大豆RING-H2 ATL家族是多基因家族，結(jié)構(gòu)域序列是否會(huì)對(duì)該家族其他基因產(chǎn)生沉默效果還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

建立了大豆TRV-VIGS體系，可實(shí)現(xiàn)TRV介導(dǎo)的大豆基因沉默，并產(chǎn)生葉片基因沉默表型。不同接種方法均可產(chǎn)生葉片沉默表型，主要表現(xiàn)褪綠黃化及褶皺。接種方法影響植株不同組織的基因沉默效率，注射方法對(duì)葉片沉默效率最高，注射加灌根結(jié)合方法對(duì)根部沉默效率最高。相同接種方法對(duì)根及葉部的基因沉默效率也存在差異。