大豆GmHMGR基因響應外源激素及非生物脅迫功能研究

王帥 馮宇梅 白苗 杜維俊 岳愛琴

（1.山西農業(yè)大學農學院，太谷 030801；2.山西農業(yè)大學林學院，太谷 030801）

萜類化合物是植物中一類重要的次生代謝產物，不僅影響植物的生長發(fā)育，而且在響應逆境脅迫等過程中發(fā)揮積極作用［1］。在高等植物中，萜類化合物主要通過2條途徑合成，即甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和磷酸甲基赤蘚糖（2-C-methyl-D-erythritol-4-phophate，MEP）途徑［2-3］。由3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutary-CoA reductase，HMGR）催化的反應是MVA途徑的主要限速步驟，負責催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMG-CoA）生成MVA，該反應不可逆，是萜類合成的一個重要調控位點［4-5］，影響眾多萜類化合物（包括甾醇、植物激素、三萜皂苷等）的生物合成，進而影響植物與環(huán)境間的相互作用［6-7］。

HMGR基因作為MVA途徑的關鍵酶基因，已在多種植物中被克隆和表征，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）［8］、銀杏（Ginkgo biloba）［9］、甜瓜（Cucum ismelo）［10］、棉花（Gossypium）［11］、人參（Panax ginseng）［12］等。與動物單個HMGR基因相比，植物HMGR基因一般以基因家族的形式存在，其不同的成員在空間和時間上表現(xiàn)出不同的表達模式，并且在響應外源激素誘導以及應對脅迫中發(fā)揮不同功能［12-14］。如擬南芥含有2個HMGR基因，但其表達模式不同，AtHMGR1的表達受光照調控，并且AtHMGR1缺失突變體表現(xiàn)出矮化、早衰等表型，而AtHMGR2缺失突變體在正常生長條件下無異常表型［8,15］。銀杏GbHMGR2與GbHMGR3對冷、暗、茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）和乙烯利（Eth）處理均有響應［9］。蘋果（Malus domestica）MdHMGR2對果實發(fā)育和Eth敏感，而MdHMGR5的異源表達激活了擬南芥抗氧化系統(tǒng)，增強了植物對氧化應激的耐受能力［13,16］。此外，外源MeJA誘導青蒿（Artemisia annua）AaHMGR1的表達，而對AaHMGR2和AaHMGR3影響較小［17］。

課題組前期從大豆（Glycine max）中成功克隆了8個HMGR基因，命名為GmHMGR1-GmHMGR8，它們在大豆各個組織表達不同，并且GmHMGR基因的啟動子中具有多種脅迫及激素響應元件［18］。但是關于大豆GmHMGR基因家族成員是否響應外源激素及非生物脅迫還不清楚。

本研究分析GmHMGR1-GmHMGR8在大豆不同逆境脅迫及外源激素誘導下的表達模式；在釀酒酵母中異源表達分析該基因家族的不同成員，在鹽脅迫與氧化脅迫下的抗逆能力；并研究擬南芥過量表達GmHMGR4與GmHMGR6株系在氧化脅迫與鹽脅迫下的抗逆表型，為大豆抗氧化、抗鹽機制解析和分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以山西農業(yè)大學大豆遺傳與種質創(chuàng)新課題組提供的武鄉(xiāng)小黑豆為供試材料。pYES2載體購自北京華越洋生物科技有限公司；pC3300s載體購自武漢天問生物科技有限公司。INVScI酵母菌株購于上?？吕咨锟萍加邢薰荆粩M南芥哥倫比亞生態(tài)型（Col-0）購自武漢天問生物科技有限公司；限制性內切酶購于NEB有限公司；甲基紫精（MV）購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 方法

1.2.1GmHMGR基因對非生物脅迫和外源激素處理的表達分析 大豆材料種植于Hoagland & Arnon營養(yǎng)液中，置于光照培養(yǎng)箱中（光照16 h，黑暗8 h，25℃）培養(yǎng)15 d，至三葉完全展開后，選取生長狀態(tài)一致的大豆幼苗進行非生物脅迫及外源激素處理。將幼苗分別置于含100 mmol/L PEG6000、150 mmol/L NaCl、330 mmol/L H2O2的營養(yǎng)液中模擬干旱、鹽及氧化脅迫；將450 μmol/L MeJA、200 μmol/L ABA溶液噴施在幼苗葉片至充分濕潤進行外源激素誘導。以上各組處理均在處理后0、3、6、12、24和48 h取大豆幼苗根、葉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取大豆幼苗總RNA，并反轉錄獲得cDNA。根據(jù)前期獲得的GmHMGR1-GmHMGR8序列設計特異性引物（表1），以GmActin作為內參基因。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用全式金公司TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒進行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量，數(shù)據(jù)為3個生物學重復平均值±標準誤差。

表1 實時熒光定量引物序列Table 1 Primers sequences by real-time quantitative PCR

1.2.2 pYES2重組表達酵母的構建與抗逆分析 根據(jù)GmHMGR1-GmHMGR8序列，分別設計帶有酶切位點的引物進行擴增，產物經酶切后分別與pYES2表達載體連接，經過測序驗證后，轉化至野生型INVScI酵母菌株。將轉化成功的酵母菌株培養(yǎng)至OD600=1時，稀釋10、100、1 000和10 000倍，分別吸取5 μL菌液點樣至YPDA培養(yǎng)基（分別含H2O2濃度為7.0和8.0 mmol/L，NaCl濃度為0.9和1.0mol/L），30℃倒置培養(yǎng)3-5 d，觀察酵母生長狀況。

1.2.3 擬南芥的遺傳轉化與抗逆分析

1.2.3.1 擬南芥遺傳轉化 構建重組質粒pC3300s:GmHMGR4與pC3300s:GmHMGR6，隨后轉化農桿菌菌株GV3101，通過浸花法侵染擬南芥Col-0，單株收取T0種子，利用含有草銨膦的培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)獲得T3。提取幼苗葉片基因組DNA為模板，利用引物Bar F（5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'）與Bar R（5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'）進行PCR檢測；同時提取幼苗葉片RNA，利用引物qPCR-GmHMGR4與qPCR-GmHMGR6進行qPCR檢測。

1.2.3.2 轉基因擬南芥中萜類合成相關基因的表達分析 根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢擬南芥萜類合成相關基因1-脫氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）基因AtDXS、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，DXR）基因AtDXR、角鯊烯合酶（Squalene synthase，SQS）基因AtSQS1和AtSQS2、環(huán)阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase，CAS）基因AtCAS、異戊烯基焦磷酸異構酶（isopentenyl diphosphate isomerases，IPI）基因AtIPI的序列設計特異性引物（表1），以AtActin為內參基因，以T3轉基因擬南芥株系cDNA為qPCR模板進行實時熒光擴增，數(shù)據(jù)為3個生物學重復平均值±標準誤差。

1.2.3.3 轉基因擬南芥的抗逆分析 在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，將擬南芥幼苗移栽至土壤基質中。生長發(fā)育4周后，選取生長狀態(tài)一致的幼苗分組進行氧化及鹽脅迫處理。氧化脅迫處理組每隔24 h噴施5 μmol/L甲基紫精（MV）至葉片充分濕潤，24 h后取葉片進行NBT染色，72 h后拍照觀察表型。鹽脅迫處理組澆灌300 mmol/L NaCl進行一周脅迫處理，拍照觀察表型，并對葉片進行NBT染色。使用Image J 1.53軟件測量每株擬南芥蓮座葉直徑，并統(tǒng)計NBT染色面積百分比［19］。根據(jù)Zhang等［13］方法，取擬南芥葉片測定相對電導率，計算葉片損傷度，葉片損傷度計算方法為：（Lt-Lck）/（1-Lck）×100%，其中，Lt和Lck分別為處理（t）和對照（ck）葉片的相對電導率。使用丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）測定試劑盒（南京建成有限公司）測定葉片的MDA含量以及CAT、POD的活性。各組設3次生物學重復。

2 結果

2.1 大豆GmHMGR基因的表達分析

2.1.1 大豆GmHMGR基因對非生物脅迫的響應 將大豆葉和根進行PEG6000、NaCl和H2O2非生物脅迫處理，運用RT-qPCR分析GmHMGR1-GmHMGR8的表達情況。結果顯示，在PEG6000脅迫處理下，GmHMGR1-GmHMGR8在葉中的相對表達量均呈先上升后下降的趨勢，而在根中，PEG6000脅迫6和12 h后，GmHMGR2和GmHMGR6的表達量顯著上調并達到峰值（圖1-A）。在NaCl脅迫處理下，GmHMGR1和GmHMGR4的相對表達量在葉與根均受到顯著上調，NaCl脅迫24 h后，GmHMGR4的相對表達量達到峰值（圖1-B）。在H2O2脅迫處理下，葉與根中GmHMGR基因表達量變化趨勢不同，在葉中，GmHMGR1-GmHMGR8在H2O2處理后3 h均顯著上調，H2O2脅迫48 h后，GmHMGR8的相對表達量達到最高；在根中，GmHMGR基因整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中，GmHMGR4的相對表達量達在H2O2處理后24 h達到峰值（圖1-C）。結果表明，GmHMGR基因對PEG6000、NaCl和H2O2脅迫處理均有響應。

圖1 非生物脅迫下大豆GmHMGR基因的表達模式分析Fig.1 Expression patterns of GmHMGR gene in response to abiotic stress in soybean

2.1.2 大豆GmHMGR基因對外源激素的響應 將大豆葉進行噴施外源植物激素MeJA和ABA處理，運用RT-qPCR分析GmHMGR1-GmHMGR8的表達情況。在噴施外源植物激素MeJA后，GmHMGR1-GmHMGR6在葉中的表達量顯著上調，在3 h表達水平達到最高值，而GmHMGR7和GmHMGR8的表達量在6 h后顯著降低。而在根中，除GmHMGR1和GmHMGR5外，其余GmHMGR基因的表達出現(xiàn)先升高后降低趨勢（圖2-A）。在ABA處理下，除GmHMGR8外，其余GmHMGR基因在葉中的表達量均顯著上調，其中GmHMGR4的表達量在6 h時達到最高水平，約為對照的8.1倍，差異顯著；在根中GmHMGR基因的表達均受到一定程度抑制，其中GmHMGR8在ABA處理3 h后顯著上調，隨后又顯著下調并低于對照（圖2-B）。結果表明，GmHMGR基因對MeJA和ABA激素處理有響應。

圖2 激素處理后大豆GmHMGR基因的表達模式分析Fig.2 Expression patterns of GmHMGR gene in response to hormone treatment in soybean

2.2 GmHMGR基因在轉基因酵母中的抗逆性分析

為了檢測轉GmHMGR基因酵母的抗氧化能力，將轉基因酵母點樣至YPDA培養(yǎng)基（7.0和8.0 mmol/L H2O2），觀察酵母生長狀況。在7.0 mmol/L H2O2濃度下，與對照相比，過量表達GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR6和GmHMGR7的酵母長勢好；在8.0 mmol/L H2O2濃度下，對照酵母已經不再生長，而過量表達GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR6和GmHMGR7的酵母還可以繼續(xù)生長（圖3-A）。將轉基因酵母點樣至YPDA培養(yǎng)基（0.9和1.0 mol/L NaCl），觀察酵母生長狀況。在0.9 mol/L NaCl脅迫下，除過量表達GmHMGR8的酵母外，其余轉基因酵母均比對照長勢好，當NaCl濃度增至1.0 mol/L時，對照酵母已不能生長，而過量表達GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR4、GmHMGR5、GmHMGR6和GmHMGR7酵母則仍能生長（圖3-B）。結果表明，過量表達GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR6和GmHMGR7可以增加酵母的抗氧化和抗鹽能力，并且不同的GmHMGR基因，其抗氧化與抗鹽能力也有差異。

圖3 不同脅迫下過量表達酵母的生長情況Fig.3 Growth of overexpressed yeast under different stress

2.3 轉GmHMGR4與GmHMGR6擬南芥的抗逆性分析

2.3.1 轉GmHMGR4與GmHMGR6植株的獲得 在非生物脅迫處理后，GmHMGR4和GmHMGR6的表達水平均有不同程度的升高，并且GmHMGR4和GmHMGR6編碼的蛋白具有HMGR的典型結構，通過對轉GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥純合株系進行抗逆性鑒定。結果表明，轉基因株系中均擴增出約270 bp的Bar條帶，而野生型（WT）和陰性對照均無相應的擴增產物（圖4-A）。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，GmHMGR4和GmHMGR6在5個轉基因株系中均有不同程度的表達，且表達水平顯著高于野生型對照植株（圖4-B-C）。因此，分別選取OE4-1、OE4-2、OE4-3以及OE6-1、OE6-2、OE6-3株系進行后續(xù)表型觀察與分析。

圖4 T3代轉基因擬南芥的鑒定Fig.4 Identification of T3 transgenic A.thaliana

2.3.2 轉GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥中萜類代謝途徑關鍵酶基因的表達分析 為了研究過量表達GmHMGR4和GmHMGR6對擬南芥植物萜類代謝途徑中相關基因表達水平的影響，測定轉基因擬南芥株系中MEP途徑基因關鍵酶基因AtDXS和AtDXR，MVA途徑關鍵酶基因AtSQS1、AtSQS2、AtCAS，以及AtIPI的表達水平。結果表明，除OE6-3株系外，所有轉基因植株中AtDXS、AtDXR、AtCAS、AtSQS1、AtSQS2表達量均顯著高于野生型植株。而在OE4-1、OE4-2株系中，AtIPI的表達量顯著高于野生型，其余株系無顯著變化（圖5）。結果表明，GmHMGR4與GmHMGR6的過表達增加了擬南芥中萜類代謝途徑相關基因的表達水平。

圖5 萜類化合物合成相關基因在轉基因擬南芥中的表達分析Fig.5 Expression analysis of terpenoid synthesis-related genes in transgenic A.thaliana

2.3.3 不同脅迫下轉GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥的表型分析 在正常培養(yǎng)條件下，野生型與轉GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥生長狀況一致，蓮座直徑大小無顯著差異（圖6-A-B）。在氧化脅迫（5 μmol/L MV）處理后發(fā)現(xiàn)，野生型植株葉片發(fā)生萎蔫失綠，而轉基因植株葉片發(fā)生輕微卷曲，生長狀態(tài)良好（圖6-A）。在鹽脅迫（300 mmol/L NaCl）處理后，野生型與轉基因擬南芥葉片的發(fā)育均受到一定程度抑制，但野生型植株的葉片較轉基因株系發(fā)育緩慢（圖6-A），轉基因擬南芥株系的蓮座直徑大小均顯著高于野生型（圖6-B）。此外，與對照組相比，在脅迫處理后野生型與轉基因擬南芥相對電導率與MDA含量均發(fā)生上調。在氧化脅迫處理后，過量表達GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥株系的相對電導率和葉片損傷度均顯著低于野生型（圖6-C-D），且轉基因擬南芥株系的MDA含量也顯著低于野生型（圖6-E）。在鹽脅迫處理后，與野生型擬南芥相比轉基因株系的相對電導率與葉片損傷度差異不顯著（圖6-C-D），而轉基因擬南芥中，除OE4-1外，其余株系的MDA含量均顯著低于野生型（圖6-E）。結果表明，過量表達GmHMGR4與GmHMGR6增強了擬南芥抗氧化與抗鹽能力。2.3.4 不同脅迫下轉基因擬南芥ROS的積累與抗逆性分析 對氧化脅迫24 h與鹽脅迫一周后的擬南芥葉片進行NBT染色，結果顯示，與氧化脅迫下的野生型植株相比，轉基因植株的葉片顏色較淺，染色面積百分比均低于野生型，而在鹽脅迫處理后，過量表達GmHMGR4擬南芥株系的染色面積百分比低于野生型（圖7-A-B）。進一步對轉基因擬南芥CAT與POD的活性進行分析，在正常條件下轉基因植株和野生型植株的CAT與POD活性無顯著差異；在氧化脅迫下，轉基因擬南芥株系的CAT的活性均上升并顯著高于野生型，而POD活性沒有差異（圖7-CD）。在鹽脅迫處理后，只有過量表達GmHMGR6株系的CAT活性顯著高于野生型（圖7-C），而OE4-1、OE6-1與OE6-3的POD活性顯著低于野生型，其余過表達株系無顯著變化（圖7-D）。說明過量表達GmHMGR4與GmHMGR6提高了擬南芥ROS的清除能力。

圖6 氧化和鹽脅迫后轉基因擬南芥的表型分析Fig.6 Phenotypic analysis of transgenic A.thaliana after oxidative treatment and salt stress

圖7 氧化和鹽脅迫處理后擬南芥的抗逆能力分析Fig.7 Stress-resistant ability analysis of transgenic A.thaliana after oxidative treatment and salt stress

3 討論

萜類化合物，也稱為類異戊二烯，是存在于植物中的一類天然產物，在大多數(shù)植物中可以調節(jié)植物與環(huán)境相互作用［20］。大豆中倍半萜、三萜皂苷、甾醇等的異戊二烯單元通常由MVA途徑產生。HMGR作為MVA途徑中的主要限速酶，在植物的發(fā)育及響應逆境脅迫中發(fā)揮積極作用。根據(jù)相關報道，HMGR基因的轉錄水平影響植物的株高、根長、雄配子體發(fā)育、種子的萌發(fā)、豆莢大小及根瘤的形成等［8,21-25］，此外，煙草過量表達杜梨PbHMGR提高了轉基因煙草種子的耐鹽性［26］，蘋果MdHMGR5在擬南芥中的過表達增強了擬南芥的抗氧化能力［13］。許多HMGR基因的啟動子區(qū)域包含多個順式作用元件，在應對生物和非生物脅迫的調控中發(fā)揮重要功能。如在蘋果HMGR基因家族各成員的啟動子中存在各種順式作用元件，Eth、MeJA和SA顯著誘導MdHMGR2和MdHMGR4的表達［27-28］，而AtHMGR受蛋白磷酸酶2A（PP2A）的調控從而在擬南芥植物應對脅迫中發(fā)揮重要作用［29］。以上結果表明，不同物種中HMGR基因在逆境響應過程中存在差異。山西農業(yè)大學大豆遺傳與種質創(chuàng)新課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆中具有8個HMGR基因，分別命名為GmHMGR1-GmHMGR8。本研究表明GmHMGR基因家族的各成員在PEG6000、NaCl和H2O2脅迫處理后的葉與根中表達量發(fā)生了不同程度的上調，其中，GmHMGR4在NaCl脅迫處理后的葉與根中相對表達量的均顯著上調，并且在H2O2處理后根中其相對表達量是對照的65倍。此外，GmHMGR2、GmHMGR4、GmHMGR6受到MeJA的誘導，而ABA處理后的葉中GmHMGR1-GmHMGR7的表達顯著上調。以上結果表明，GmHMGR基因在響應非生物脅迫及外源激素誘導中發(fā)揮重要功能。另外，過量表達GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR6、GmHMGR7酵母在脅迫條件下生長情況良好。表明GmHMGR基因家族不同成員在大豆抵抗逆境脅迫中發(fā)揮的功能不同。

前人研究表明HMGR表達水平的改變通常會導致類異戊二烯的含量變化，進而影響植物的發(fā)育及其對逆境的耐受能力［30-31］。如在丹參（Salvia miltiorrhiza）毛狀根中過量表達SmHMGR2增加了毛狀根中丹參酮和角鯊烯的含量［32］，煙草中過量表達HbHMGR導致煙草種子中總甾醇的積累增加了2.5倍［33］。根據(jù)前期試驗結果，進一步在擬南芥中過量表達GmHMGR4與GmHMGR6，研究其在植物抗逆過程中的作用機制。RT-qPCR結果表明，過量表達GmHMGR4與GmHMGR6不僅提高了擬南芥AtSQS1和AtSQS2的表達水平，而且也顯著提高了甾醇代謝的關鍵酶基因AtCAS的表達量，表明GmHMGR基因的過量表達激活了類異戊二烯途徑中的下游基因轉錄，繼而共同調節(jié)擬南芥萜類的代謝通量。此外，MEP途徑AtDXR基因的表達也顯著提高，表明擬南芥MVA途徑與MEP途徑間可能存在串擾，與之前的研究結果相同［34］。相對電導率、葉片損傷度與MDA含量是植物反應細胞膜損傷程度的重要指標［35］，轉GmHMGR4與GmHMGR6擬南芥植株在氧化脅迫下的相對電導率、葉片損傷度與MDA含量均顯著低于野生型，表明GmHMGR4與GmHMGR6在擬南芥中過量表達可以緩解氧化脅迫過程中細胞膜的損傷，增強植株的抗氧化能力。而在NaCl處理后，轉基因擬南芥的相對電導率、葉片損傷度與野生型無顯著差異，但MDA含量低于野生型擬南芥，差異顯著。說明GmHMGR4與GmHMGR6參與轉基因擬南芥鹽脅迫響應過程。植物在脅迫條件下會產生ROS，而ROS過量積累會破壞細胞膜，導致細胞發(fā)生損傷，進而影響植物生長發(fā)育［35］。毛果楊（Populus trichocarpa）中PtHMGR的過表達上調了ROS清除相關基因的表達，并且提高了ABA合成相關基因的轉錄水平和ABA的含量，進而影響了毛果楊的抗逆能力［36］。芥菜MVA途徑相關基因BjHMGS的過表達增加了轉基因擬南芥甾醇的含量并提高了其脅迫耐受性［37］。并且一些研究表明揮發(fā)性類異戊二烯可以通過調節(jié)植物的氧化狀態(tài)來減輕氧化應激的影響［38-40］。在本研究中，過量表達GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥類異戊二烯途徑重要酶基因的表達水平高于野生型，差異顯著。在氧化脅迫后轉基因擬南芥的ROS積累量低于野生型，并且其CAT活性顯著高于野生型植株。推測轉基因擬南芥中GmHMGR4和GmHMGR6的過表達通過影響激素代謝水平以及抗逆相關異戊二烯產物的代謝通量，進而激活擬南芥抗氧化系統(tǒng)，避免了ROS過量產生引起的嚴重氧化損傷，具體機制還有待于進一步研究。而在NaCl脅迫下，僅轉GmHMGR6株系的CAT活性顯著高于野生型，這可能是不同GmHMGR基因在不同脅迫下發(fā)揮的功能上的差異，說明GmHMGR6在擬南芥抵抗鹽脅迫中發(fā)揮更重要的功能。

4 結論

大豆GmHMGR基因對不同非生物脅迫以及激素處理均有響應；不同的GmHMGR基因在酵母中的抗氧化與抗鹽能力有差異；過量表達GmHMGR4與GmHMGR6增強擬南芥的抗氧化與抗鹽能力；表明GmHMGR基因家族可能在大豆響應氧化和鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。