脂肪干細(xì)胞外泌體抑制TGF-β1促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的研究

宋培軍 梁秋 周丹蓮 周濤 徐靜

【摘 要】目的 檢測脂肪干細(xì)胞外泌體（ADSC-Exos）對糖尿病創(chuàng)面愈合、瘢痕形成的影響，并以TGF-β1信號為靶點，探討ADSC-Exos發(fā)揮作用的分子機制。方法 分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，收集外泌體進(jìn)行鑒定。并在糖尿病大鼠創(chuàng)面多點注射外泌體，通過計算創(chuàng)面面積、組織學(xué)染色以及Western Blot檢測，評估外泌體對創(chuàng)面愈合、TGF-β1信號通路的影響。結(jié)果 獲取的ADSC-Exos符合典型的外泌體特征；ADSC-Exos可提高創(chuàng)面愈合率和血管化、抑制瘢痕，并抑制TGF-β1信號通路。結(jié)論 ADSC-Exos促進(jìn)了大鼠糖尿病創(chuàng)面愈合，在創(chuàng)傷后期可抑制關(guān)鍵纖維化信號TGF-β1，減少瘢痕形成。

【關(guān)鍵詞】脂肪干細(xì)胞；外泌體；糖尿病創(chuàng)面；成纖維細(xì)胞

中圖分類號：R587.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）13-0048-05

Study on Adipose-derived Stem Cell Exosomes Inhibiting TGF-β1 to Promote Diabetic Wound Healing

SONG Pei-jun1， LIANG Qiu1，2， ZHOU Dan-lian1，2， ZHOU Tao2， XU Jing1

（1.Department of Plastic Surgery and Burns， the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu 233000， Anhui， China； 2.Key Laboratory of Tissue Transplantation in Anhui Province， Bengbu Medical College， Bengbu 233000， Anhui， China）

【Abstract】Objective To detect the effect of adipose-derived stem cell exosomes （ADSC-Exos） on diabetic wound healing and scar formation， and to explore the molecular mechanism of ADSC-Exos with TGF-β1 signal as the target. Methods Adipose-derived stem cells were isolated and cultured， and exosomes were collected for identification. Exosomes were injected into the wounds of diabetic rats， the effects of exosomes on wound healing and TGF-β1 signaling pathway were evaluated by calculating wound area， histological staining and Western Blot detection. Results The obtained ADSC-Exos conformed to the typical characteristics of exosomes； ADSC-Exos could improve wound healing rate and vascularization， inhibit scar formation， and inhibit TGF-β1 signaling pathway. Conclusion ADSC-Exos promotes wound healing in diabetic rats， inhibits the key fibrosis signal TGF-β1 and reduces scar formation in the later stage of trauma.

【Key words】Adipose-derived stem cell； Exosomes； Diabetic wounds； Fibroblasts

基金項目：1.蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究重點項目（編號：2021byzd044）；2.2022年省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（編號：12110110447）

糖尿?。╠iabetic wounds，DM）創(chuàng)面具有遷延不愈、高致殘率等特點，給患者帶來極大的痛苦及沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。持續(xù)高血糖環(huán)境易導(dǎo)致微血管病變、慢性炎癥反應(yīng)、高氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)病變等病理過程，導(dǎo)致治療效果并不理想[1]。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs），具有較強的增殖和多向分化能力，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著極高的應(yīng)用價值[2]。與其他干細(xì)胞相比，ADSCs儲量豐富、易獲取、創(chuàng)傷小、適宜自體移植，成為臨床上用于治療難愈性創(chuàng)面、組織重建、神經(jīng)修復(fù)等疾病的優(yōu)先選擇之一[3]。外泌體是細(xì)胞從內(nèi)部釋放到外部的膜狀囊泡，具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，直徑范圍約為40～160 nm，其攜帶有多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸，可在細(xì)胞間傳遞信息，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能及生物學(xué)過程[4]。與細(xì)胞相比，外泌體具有更小的分子結(jié)構(gòu)，易于轉(zhuǎn)運；生物相容性強，無成瘤風(fēng)險，安全性高；且可體外大量制備。因此，利用脂肪干細(xì)胞的外泌體（ADSC-Exos）來修復(fù)缺損組織，富有良好的應(yīng)用前景[5]。TGF-β1是組織損傷后愈合過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，但慢性損傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷或感染卻會引起的TGF-β1的過度激活，導(dǎo)致生理性修復(fù)轉(zhuǎn)向病理性修復(fù)，造成纖維化和膠原組織的過度沉積，損害器官的正常功能[6]。本研究通過體外實驗和體內(nèi)實驗觀察ADSC-Exos處理后真皮成纖維細(xì)胞增殖、遷移，以及糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合情況，并以TGF-β1為靶點，探討ADSC-Exos促糖尿病傷口愈合的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 實驗動物：8周齡雄性SD大鼠20只，體重（280±20）g，孕鼠1只，由山東省實驗動物中心提供。動物實驗方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫理編號：倫動科批字〔2022〕第289號）。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基（BiosharP）、胎牛血清（Lonsera）、Ⅰ型膠原酶（Solarbio）、鏈脲佐菌素（Yeasen）、外泌體專用無血清培養(yǎng)基（Umibio）、抗體TGF-β1、α-SMA、COL Ⅰ、CD31、Vimentin、P53（Affinity）。

1.2 ADSCs分離培養(yǎng) 將SD大鼠用10%水合氯醛麻醉后頸椎脫臼法處死，分離出腹股溝下脂肪，剪成1 mm大小的顆粒，加入等體積0.2%Ⅰ型膠原酶37 ℃消化1～2 h。1000 xg，10 min，4 ℃離心去上清，重懸沉淀，再次離心，重懸后培養(yǎng)在T25培養(yǎng)瓶中，每3 d換液1次，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第3代細(xì)胞用于實驗。

1.3 ADSC-Exo分離提取及鑒定 取三代脂肪干細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清，進(jìn)行梯度離心：300 xg，10 min，4 ℃，取上清；3000 xg，10 min，4 ℃，取上清；10 000 xg，30 min，4 ℃，取上清。經(jīng)0.22 μm濾嘴過濾后進(jìn)行超速離心，100 000 xg，70 min，4 ℃，棄上清液，PBS重懸沉淀，再次100 000 xg，70 min，4 ℃，棄上清液，用適量PBS重懸沉淀，放入-80 ℃冰箱保存。通過透射電鏡觀察形態(tài)和大??；Western Blot檢測外泌體表面標(biāo)志物；納米顆粒跟蹤分析粒徑分布。

1.4 動物實驗

1.4.1糖尿病大鼠造模及分組 8周齡雄性SD大鼠12只，給予高脂肪飼料喂養(yǎng)4周，第5周在腹膜內(nèi)注射鏈脲佐菌素（35 mg/kg）。注射1周后監(jiān)測大鼠空腹血糖水平，空腹血糖>11.1 mmol/L定義為糖尿病大鼠造模成功。將12只糖尿病大鼠隨機分成兩組：糖尿病對照組、糖尿病ADSC-Exos組，每組6只；另取6只健康大鼠作為健康對照組。大鼠麻醉后背部剃毛，在背部正中線兩側(cè)，距兩耳連線中點6 cm處，制作兩個直徑10 mm大小的圓形全層皮膚缺損的創(chuàng)面，用外科縫線將內(nèi)徑12 mm大小的塑膠圓環(huán)固定在創(chuàng)面上3 d，減少皮膚皺縮的影響。糖尿病ADSC-Exos組分別在0、3、6、9點方向及基底注射0.2 ml ADSC-Exos（100 μg/ml），空白對照組和糖尿病對照組注射同等量PBS，凡士林紗布覆蓋創(chuàng)面，醫(yī)用紗布包扎固定。觀察創(chuàng)面愈合情況并拍照，以Image J軟件測量創(chuàng)面面積。

1.4.2組織學(xué)染色 第14天處死所有大鼠，每組隨機選取6個創(chuàng)面皮膚，用4%多聚甲醛固定24 h后經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋，制作成4 μm厚石蠟切片。分別行H&E染色、Masson染色，TGF-β1、CD31免疫組化染色。

1.4.3 Western Blot實驗檢測相關(guān)蛋白 使用RIPA裂解液從第14天切取下的皮膚中提取總蛋白，并用BCA試劑盒測定濃度，按照相同的濃度上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，與一抗（稀釋比例1∶1000）在4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗（稀釋比例1∶5000）室溫?fù)u床孵育2 h后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計學(xué)意義顯著；P<0.001表示統(tǒng)計學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 ADSC-Exos促進(jìn)了大鼠糖尿病創(chuàng)面的愈合 取P3代ADSCs，通過梯度離心得到ADSC-Exos，在透射顯微鏡下可見：外泌體呈圓形或橢圓形，茶托狀形態(tài)，符合外泌體典型的磷脂雙層結(jié)構(gòu)的特征（圖1a）。Western Blot實驗結(jié)果顯示：本試驗提取的ADSC-Exos高度表達(dá)外泌體marker蛋白CD9、CD63；且不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的marker蛋白Calnexin（圖1b）。納米顆粒跟蹤分析檢測結(jié)果顯示：ADSC-Exos的峰值直徑為152.0 nm；中位數(shù)為165.6 nm；濃度為2.0 E+11 Particels/ml（圖1c），符合典型的外泌體特征，可以用于后續(xù)實驗。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)：健康對照組（NC+PBS）大鼠的創(chuàng)面愈合率顯著高于糖尿病對照組（DM+PBS）（P<0.01）；ADSC-Exos治療組創(chuàng)面愈合率顯著高于糖尿病組（P<0.01）（圖1d）。14 d時傷口處皮膚的H&E染色結(jié)果顯示：與健康對照組相比，兩個糖尿病組的新生血管較少，膠原組織排列紊亂，炎性細(xì)胞增多；但與糖尿病對照組（DM+PBS）相比，ADSC-Exos治療組的新生血管增多，膠原排列較整齊，炎性細(xì)胞減少。同時，Masson染色結(jié)果顯示：健康對照組的膠原纖維沉積較少，平行排列；糖尿病對照組的膠原纖維沉積增加，排列紊亂；ADSC- Exos治療組的膠原纖維沉積較糖尿病對照組顯著減少（P<0.01）（圖1e）。免疫組化染色結(jié)果顯示：在傷口愈合的后期（14 d）糖尿病顯著誘導(dǎo)了纖維化標(biāo)志基因TGF-β1的表達(dá)（P<0.001），同時極顯著減少了血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子CD31的表達(dá)（P<0.001）；而經(jīng)ADSC-Exos治療，可以極顯著“挽救”糖尿病誘導(dǎo)的纖維化基因上調(diào)（P<0.001）；與糖尿病對照組相比，ADSC-Exos治療組中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子CD31上調(diào)（P<0.05）（圖1e）。

2.2 ADSC-Exos抑制了創(chuàng)傷后期皮膚中的TGF-β1信號通路 在創(chuàng)面修復(fù)后期，高水平的TGF-β1是引起纖維化導(dǎo)致瘢痕的關(guān)鍵。為探究ADSC-Exos促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，減少瘢痕的分子機制，本研究通過WB檢測14 d創(chuàng)口處皮膚的TGF-β1信號通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：糖尿病創(chuàng)口后期皮膚中TGF-β1及其下游α-SMA高表達(dá)，并且纖維化標(biāo)志基因Vimentin、以及凋亡相關(guān)蛋白P53表達(dá)上調(diào)；而ADSC-Exos治療能抑制后期創(chuàng)口中的TGF-β1通路、成纖維標(biāo)志基因和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)（圖2）。

3 討論

糖尿病創(chuàng)面是臨床常見的疾病，其中糖尿病足部潰瘍最有代表性，據(jù)統(tǒng)計，糖尿病患者一生中發(fā)生足部潰瘍的風(fēng)險高達(dá)34%，其中約20%的足潰瘍患者需要截肢[7]。傷口愈合是一個動態(tài)復(fù)雜的過程，分為時間重疊的止血期、炎癥期、增殖期、重構(gòu)期，在這4個時期出現(xiàn)問題均會影響傷口愈合。據(jù)報道[8]，糖尿病創(chuàng)面的促炎細(xì)胞因子增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞減少，上皮細(xì)胞增殖和遷移能力受損，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重構(gòu)紊亂。因此本研究假設(shè)，從抗炎、促血管化、增強上皮細(xì)胞功能、調(diào)整ECM重構(gòu)等幾個方面對創(chuàng)面采取干預(yù)措施，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合。有研究報道[9]，ADSC-Exos能改善胰島素敏感性，推動M2巨噬細(xì)胞極化，減少炎癥，減弱瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖能力，減少纖維化[10]，還可以促進(jìn)脂肪移植物的血管生成[11]。

本研究從大鼠脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞，在體外擴(kuò)增后用超速離心法分離出外泌體，并通過透射電鏡、納米顆粒追蹤、蛋白印記實驗鑒定，證明該方法可以獲取較純的外泌體。通過創(chuàng)面的拍照觀察、HE染色、Masson染色、免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，ADSC-Exos可以促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合，減少炎癥浸潤，促進(jìn)新生血管形成。這些結(jié)果表明ADSC-Exos可以通過抗炎、增強成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力、促血管化促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。既往研究表明[12]，TGF-β1的異常高表達(dá)可以導(dǎo)致各種纖維化，包括肝臟、心臟、肺部纖維化和病理性瘢痕。病理性瘢痕形成的過程涉及膠原蛋白過度沉積，細(xì)胞外基質(zhì)重塑過程失調(diào)，有膠原纖維排列紊亂、肌成纖維細(xì)胞增多，血管生成減少等特點。有研究表明[13-15]，TGF-β1刺激的成纖維細(xì)胞，α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平以劑量依賴方式上調(diào)，本研究假設(shè)，調(diào)控TGF-β1信號通路，可以抑制膠原蛋白過度表達(dá)，減少瘢痕形成。為了進(jìn)一步探討ADSC-Exos影響創(chuàng)面纖維化的機制，本研究過蛋白印記實驗檢測了纖維化相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，ADSC-Exos可以下調(diào)糖尿病創(chuàng)面組織的TGF-β1表達(dá)量，減少肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、Vimentin的表達(dá)和減少膠原蛋白過度沉積，這說明ADSC-Exos在創(chuàng)傷后期可以抑制纖維化TGF-β1信號通路，從而減少瘢痕的形成。但ADSC-Exos調(diào)控TGF-β1的具體分子機制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，ADSC-Exos可以促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合，加速血管新生，減少瘢痕，該功能可能是通過TGF-β1信號發(fā)揮作用，從而可為糖尿病創(chuàng)面的治療提供證據(jù)。

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編輯 扶田