凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 的篩選、鑒定及特性研究

孔素芬，朱明明，朱建國(guó)，方曙光

（武漢微康益生菌研究院有限公司，湖北武漢 430000）

凝結(jié)魏茨曼氏菌（曾用名凝結(jié)芽孢桿菌）是一種既能產(chǎn)乳酸又能產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，最早于1915 年由Hammer[1]分離得到。凝結(jié)魏茨曼氏菌是美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）和歐盟食品安全局（EFSA）共同認(rèn)證的可以安全使用的益生菌。同時(shí)，凝結(jié)魏茨曼氏菌也列入了Generally Recognized As Safe（GRAS 普遍公認(rèn)安全）和Qualified Presumption of Safety（QPS 合格安全推定）菌株名單。此外，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和美國(guó)飼料控制官員協(xié)會(huì)也將凝結(jié)魏茨曼氏菌列入到可用于飼料的安全微生物菌種名單[2?3]。

近年來(lái)，凝結(jié)魏茨曼氏菌作為新型微生態(tài)制劑，由于其益生作用和高抗逆特性，在畜牧[4]、水產(chǎn)養(yǎng)殖[5]、農(nóng)業(yè)[6]和環(huán)境保護(hù)[7]等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。劉彬等[8]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)魏茨曼氏菌增加異育銀鯽幼魚(yú)血液中髓過(guò)氧化物酶和抗超氧陰離子自由基活性，有效緩解宿主重金屬中毒反應(yīng)。苗華彪等[9]研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)魏茨曼氏菌在生豬養(yǎng)殖應(yīng)用中具有改善生豬腸道健康、提高機(jī)體免疫力和抗病能力、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等作用?？梢?jiàn)凝結(jié)魏茨曼氏菌作為一種新的微生態(tài)制劑正在成為一種趨勢(shì)。但是由于菌株的挑選不規(guī)范，菌株配伍不科學(xué)，是否具有耐藥性等依然影響著微生態(tài)制劑的應(yīng)用與發(fā)展。本研究對(duì)一株從仔豬糞便中分離獲得的凝結(jié)魏茨曼氏菌進(jìn)行了形態(tài)特征的觀察，評(píng)價(jià)了該菌株的益生特性和安全性，同時(shí)，初步考察了與其他飼用益生菌的復(fù)配情況，證明其具備開(kāi)發(fā)利用和研究?jī)r(jià)值，為凝結(jié)魏茨曼氏菌進(jìn)一步的功能評(píng)價(jià)、應(yīng)用擴(kuò)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

病原菌：大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、腸炎沙門(mén)氏菌ATCC14028、福氏志賀氏菌ATCC12022、化膿性鏈球菌ATCC19615

購(gòu)于廣東微生物菌種保藏中心；干酪乳桿菌W189、乳酸片球菌W172、嗜酸乳桿菌W211、屎腸球菌W362、糞腸球菌W471 武漢微康益生菌研究院實(shí)驗(yàn)室分離、編號(hào)、保藏；仔豬糞便 采集自湖北省種豬養(yǎng)殖場(chǎng)斷奶仔豬；小鼠 購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(鄂）2020-0084，小鼠實(shí)驗(yàn)倫理審批編號(hào)為HZAUMO-2023-0140；蛋白胨、酵母粉 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、NaCl、CaCO3、硫酸銨（均為分析純?cè)噭⒇i膽鹽（膽酸含量≥60%）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶（1:3000）上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑為分析純?cè)噭?/p>

JY10002 型電子天平 上海衡平儀器儀表廠；SW-CJ-2FD 型雙人單面超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250B-2 型恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CX-23 顯微鏡 奧林巴斯公司；UV-1700 紫外分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；pHS-3C 型pH 計(jì) 上海儀電科股份有限公司公司；D（24 L）型高壓蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；DK-8D 型水浴加熱鍋 常州國(guó)宇儀器制造有限公司；5415D 臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基和溶液配制 MRS 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，檸檬酸氫二銨2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，MgSO40.2 g，MnSO40.6 g，Tween 80 1 mL，蒸餾水1000 mL，pH6.0～6.2，115 ℃，30 min 滅菌。

平板篩選培養(yǎng)基參考辛國(guó)芹等[10]報(bào)道篩選培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.25% CaCO3和1.5%瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀4 g，水1000 mL，pH6.8～7.0，115 ℃滅菌 30 min。

PCA 培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，胰蛋白胨5 g，酵母浸粉2.5 g，瓊脂粉1.8 g/L，水 1000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌 20 min。

胃液配制[11]：NaCl 0.5%、胃蛋白酶 0.3%，用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至3.0，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后備用。

膽鹽培養(yǎng)基[12]：取一定量的豬膽鹽加入含0.2%（w/v）的巰基乙酸鈉的MRS 培養(yǎng)基中，使膽鹽終濃度（g/mL）分別為0%，0.1%，0.3%，0.5%，1.0%，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后備用。

1.2.2 菌株的篩選與鑒定

1.2.2.1 菌種初篩純化 采集健康仔豬糞便樣品10 份，各取樣品1 g 分別放入裝有 9 mL 無(wú)菌生理鹽水50 mL 離心管中，振蕩15 min，使之充分混勻，靜置20～30 s，每個(gè)樣品吸取2 mL 懸液置于80 ℃水浴處理10 min[13]，分別取1 mL 進(jìn)行10 倍梯度稀釋，再選擇適宜梯度的懸液涂布于含0.25%碳酸鈣的MRS 瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48～72 h。挑取初篩平板不同形態(tài)的單菌落在PCA培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化，單菌落形態(tài)穩(wěn)定后，編號(hào)保存。

1.2.2.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察 平板菌落觀察：觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、凸起有無(wú)等；菌體形態(tài)觀察：觀察油鏡下菌體的形態(tài)、大小、排列等；掃描電鏡觀察：觀察掃描電鏡下放大20000 倍菌體的立體形態(tài)、芽孢著生特點(diǎn)等。

1.2.2.3 16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 使用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：2×Buffer MIX 25 μL，引物27F 和1492R 各2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 °C 3 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR 產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)后，產(chǎn)物送往武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得基因序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，以16S rDNA 序列同源性≥99%為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 生理生化實(shí)驗(yàn) 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

1.2.4 生長(zhǎng)特性的初步探究 將凝結(jié)魏茨曼氏菌單菌落接種至MRS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行二級(jí)活化，按照5%接種量接入裝有30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，250 r/min，搖床培養(yǎng)，以pH、OD 值為指標(biāo)，觀察菌株24 h 的生長(zhǎng)特性。

1.2.5 抗逆性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 培養(yǎng)液制備 取BC66 甘油管接種至30 mL MRS 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)活化，37 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)12～15 h，取一級(jí)培養(yǎng)液按5%接種量接入裝有30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃，250 r/min，搖床培養(yǎng)18～24 h 得到所需培養(yǎng)液。

1.2.5.2 耐酸實(shí)驗(yàn) 取1 mL 培養(yǎng)液10000 r/min 離心1 min 后去上清加入10 mL pH3.0 的模擬胃液，置于37 °C 培養(yǎng)箱恒溫孵育，分別于0、2、3、4 h 不同耐受時(shí)間取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。以0 h 測(cè)定值作為空白對(duì)照，計(jì)算菌株存活率。

其中，N1表示經(jīng)過(guò)處理后菌株體系中的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示菌株體系中初始活菌數(shù)，即0 h測(cè)得的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5.3 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 取1 mL 培養(yǎng)液10000 r/min離心1 min 后去上清分別加入不同膽鹽濃度0.1%、0.3%、0.5%、1.0%（w/v）的10 mL 膽鹽培養(yǎng)基，置于37 °C 恒溫培養(yǎng)，分別于0、2 h 取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。以0 h 測(cè)定值作為空白對(duì)照，計(jì)算菌株存活率。

其中，N1表示經(jīng)過(guò)處理后菌株體系中的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示菌株體系中初始活菌數(shù)，即0 h測(cè)得的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5.4 耐高溫實(shí)驗(yàn) 將凝結(jié)魏茨曼氏菌菌株接種至PCA 固體斜面培養(yǎng)基上，菌體培養(yǎng)至形成芽孢后，取菌苔制成懸液各2 mL，分別置于70、80、90、100 ℃水浴中處理10 min，處理完后立即冷卻，取0.1 mL 懸液進(jìn)行梯度稀釋活菌計(jì)數(shù)，以未水浴菌液為對(duì)照，培養(yǎng)48 h 后計(jì)算存活率[14]。

其中，N1表示水浴中處理10 min 后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示未水浴菌液的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.6 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 采用瓊脂擴(kuò)散法[15]，按1.2.5培養(yǎng)液制備方法進(jìn)行二級(jí)活化，二級(jí)培養(yǎng)液37 ℃250 r/min 搖瓶培養(yǎng)10～15 h，離心收集上清液。指示菌采用LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在 37 ℃、220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 24 h，制成1×108CFU/mL 菌懸液。指示菌懸液按1:100 的比例加入LB 瓊脂培養(yǎng)基溶液中，充分混勻后傾注加到放置牛津杯的平板中，凝固后取出牛津杯。將200 μL 上清液加入到7 mm 的孔中，以空白LB 培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)適宜時(shí)間后，測(cè)量抑菌圈的大小，檢測(cè)加入培養(yǎng)上清液對(duì)指示菌的抑制作用。

1.2.7 凝結(jié)魏茨曼氏菌與不同菌株的拮抗關(guān)系 參考徐秀偉[16]采用的菌種劃線拮抗方法，分別將凝結(jié)魏茨曼氏菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌，糞腸球菌的甘油管菌種接種至MRS 液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，取不同菌株菌液離心，留菌體。將凝結(jié)魏茨曼氏菌分別和干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌，糞腸球菌在平板上兩兩呈“井”字劃線，觀察交叉菌線生長(zhǎng)狀況，是否出現(xiàn)透明圈，以此判斷兩個(gè)菌株間是否存在拮抗作用。

1.2.8 安全性評(píng)價(jià)

1.2.8.1 溶血性實(shí)驗(yàn) 取1.2.5 離心后的凝結(jié)魏茨曼氏菌菌體以劃線的形式接種在含1.5%瓊脂和5%脫纖維羊血的血液瓊脂（BHI 培養(yǎng)基）中37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察溶血情況。在菌落周?chē)a(chǎn)生綠色帶（α-溶血）或在血平板上不產(chǎn)生任何溶血（γ-溶血）的菌株被認(rèn)為是非溶血的，菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血帶（透明色帶）的菌株被歸類為具有溶血（β-溶血）特性的微生物，出現(xiàn)透明β-溶血環(huán)為溶血表型陽(yáng)性，使用化膿性鏈球菌作為陽(yáng)性質(zhì)控菌株[17]。

1.2.8.2 抗生素敏感實(shí)驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散試驗(yàn)法[18]。將200 μL 含108CFU/mL 的凝結(jié)魏茨曼氏菌發(fā)酵液均勻涂布于MRS 瓊脂平板上，待平板表面稍干后，放入常用抗生素藥敏紙片，貼在培養(yǎng)基表面中央，輕輕按壓紙片使其固定。在37 ℃培養(yǎng)24 h 后，測(cè)量抑制圈直徑大小。

1.2.8.3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 安全性評(píng)價(jià)采用急性毒性實(shí)驗(yàn)，參照GB15193.9-2014 最大耐受劑量法進(jìn)行。取體重18～22 g 的小鼠雌雄各15 只，觀察3 d 后，1 日內(nèi)分2 次經(jīng)口給予0.2 mL 注菌液（按小鼠體重20 g計(jì)算相當(dāng)于每千克體重20 mL），連續(xù)灌胃14 d，觀察小鼠是否有中毒和死亡現(xiàn)象。注菌液使用0.85%生理鹽水制成含量為1×109CFU/mL 的凝結(jié)魏茨曼氏菌懸液[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。原始數(shù)據(jù)用Excel 2010 整理后采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS statistics 21.0 進(jìn)行差異顯著性分析，比較實(shí)驗(yàn)中不同處理間差異。P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征及鑒定結(jié)果 對(duì)獲取的10 份仔豬糞便樣品進(jìn)行熱處理，并利用菌株的耐高溫特性獲取芽孢桿菌4 株，經(jīng)鑒定分別為凝結(jié)魏茨曼氏菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，具體結(jié)果見(jiàn)表1 和圖1。

圖1 不同芽孢桿菌的單菌落形態(tài)Fig.1 Single colony of different Bacillus

表1 不同芽孢桿菌菌落形態(tài)Table 1 Morphological characteristies of different Bacillus

2.1.2 形態(tài)特征觀察 將獲得的凝結(jié)魏茨曼氏菌在PCA 平板上進(jìn)行稀釋涂布，得到純化后的菌株并編號(hào)為BC66，菌落形態(tài)如圖2 所示。對(duì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，10×100光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)呈桿狀，芽孢端生。20000 倍掃描電鏡狀態(tài)下觀察，芽孢一端膨大，呈鼓槌狀。菌株個(gè)體形態(tài)如圖3 所示。

圖2 菌落形態(tài)Fig.2 The morphology of the colony

圖3 BC66 細(xì)胞形態(tài)Fig.3 The cellular morphology of BC66

2.1.3 16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 使用通用引物對(duì)BC66 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)后，產(chǎn)物送往武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得基因序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，通過(guò)比對(duì)確定菌株BC66 為凝結(jié)魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans），曾用名為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。比較分析同源性較高的序列，構(gòu)建出凝結(jié)魏茨曼氏菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖4。以Paenibacillus agarexedensDSM 1327（MT568608）為外枝構(gòu)建的Neighbor-Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，BC66 與凝結(jié)魏茨曼氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7050的16S rDNA 序列同源性99.68%，使用MEGA Ⅹ 對(duì)菌株與其他菌株進(jìn)行16S rDNA 序列一起構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，可以看到BC66 與凝結(jié)魏茨曼氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株親緣關(guān)系較近，處于同一分支。

圖4 基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 The results of gene sequence alignment

2.1.4 生理生化實(shí)驗(yàn) 生理生化指標(biāo)是進(jìn)行細(xì)菌分類的重要依據(jù)，BC66 菌株主要依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[20]的分類原則進(jìn)行，菌株的生理生化特征如表2 所示。

表2 BC66 的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of BC66

從表2 可以看出菌株BC66 能利用葡萄糖產(chǎn)酸，尿酶反應(yīng)陰性，不產(chǎn)H2S，吲哚實(shí)驗(yàn)陰性。

2.2 生長(zhǎng)特性初步探究

將篩選到的BC66 菌株進(jìn)行初步的生長(zhǎng)特性研究，分別在0、3、9、15、18 及24 h 取樣測(cè)定OD 值和pH，觀察菌株培養(yǎng)24 h 的生長(zhǎng)特性。

微生物的生長(zhǎng)繁殖分為4 個(gè)時(shí)期，分別為停滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期[21]，從圖5 可以看出，活化后的菌株轉(zhuǎn)入到新鮮培養(yǎng)基后停滯期較短，18 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。從pH 變化曲線來(lái)看，菌株BC66 的發(fā)酵液pH 在15 h 達(dá)到最低點(diǎn)4.61，辛國(guó)芹等[10]研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)魏茨曼氏菌在代謝中產(chǎn)生有機(jī)酸，主要為乳酸和乙酸。乳酸和乙酸對(duì)于提高飼料消化率，降低胃部及后腸道pH，抑制有害菌及腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，維持腸道有益微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制腸道致病菌，改善腸道環(huán)境具有重要作用[22]。

圖5 BC66 生長(zhǎng)趨勢(shì)圖Fig.5 The growth trend of BC66

2.3 抗逆性研究

2.3.1 耐酸特性 菌株的耐酸特征決定其通過(guò)胃液在腸道中的存活能力。正常情況下，胃酸 pH2.0～3.0，食物通過(guò)胃排空時(shí)間一般在2～4 h[23]。實(shí)驗(yàn)研究了菌株在pH3.0 酸性條件下的存活情況。圖6 顯示了不同耐受時(shí)間凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 菌株生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，該菌株在pH3.0 的模擬胃液中處理2 h時(shí)，菌株存活率可達(dá)98%；處理4 h 時(shí)，菌株存活率還保持在60%以上。說(shuō)明菌株BC66 具有較強(qiáng)的耐酸能力，在通過(guò)胃液時(shí)，能有足夠數(shù)量的活菌在胃腸道中發(fā)揮益生作用。

圖6 BC66 在pH3.0 酸性條件下的耐受情況Fig.6 Tolerance of BC66 in pH3.0 acidic condition

2.3.2 耐膽鹽特性 膽鹽是腸道中參與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)消化和吸收的主要成分。益生菌在腸道中存活和定殖，必須能對(duì)小腸中的膽汁有抗性。腸道中的膽鹽濃度不是固定不變的，膽鹽濃度主要在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)[24]。若菌株在該條件下能存活才有可能正常生長(zhǎng)代謝[25]，菌株耐膽鹽的特性決定了其在腸道中的存活能力。實(shí)驗(yàn)研究了菌株對(duì)不同濃度膽鹽的耐受能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示，在0.3%膽鹽濃度下，菌株存活率為79%，在0.5%膽鹽濃度下其存活率保持在63%。說(shuō)明菌株BC66 具有較好的膽鹽耐受性，能在腸道中生長(zhǎng)，并發(fā)揮益生作用。

圖7 BC66 在不同膽鹽濃度中存活情況Fig.7 Survival of BC66 in different bile salt concentrations

2.3.3 耐高溫實(shí)驗(yàn) 高溫在實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)影響產(chǎn)品的活性，同時(shí)也是影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要因素，凝結(jié)魏茨曼氏菌由于其芽孢具有良好的抗逆性，能耐受工業(yè)生產(chǎn)中的高溫高壓等不利環(huán)境[26]，本研究對(duì)BC66的耐高溫特性進(jìn)行考查，將芽孢菌懸液分別置于不同溫度水浴中處理10 min 后，進(jìn)行梯度稀釋活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖8，水浴溫度90 ℃處理10 min 菌體存活率達(dá)到92%，水浴溫度為100 ℃時(shí)，菌體存活率還保持約50%，金迅等[27]研究顯示凝結(jié)魏茨曼氏菌13002 在80 ℃條件下存活率可達(dá)到72%，遠(yuǎn)低于本研究中的80 ℃高溫處理后的存活率96%，表明凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 具有較強(qiáng)的耐高溫特性，在益生菌產(chǎn)品加工應(yīng)用領(lǐng)域具有更大的多樣性[28]。

圖8 BC66 耐高溫存活率情況Fig.8 High temperature survival rate of BC66

2.4 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

有動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)顯示，飼料中添加凝結(jié)魏茨曼氏菌能抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等腸道主要有害菌，顯著改善畜禽生長(zhǎng)性能[29?31]，本研究對(duì)凝結(jié)魏茨曼氏菌進(jìn)行常見(jiàn)病原菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，菌株BC66 對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，腸炎沙門(mén)氏菌，福氏志賀氏菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌能力，與陳宇等[32]報(bào)道一致，凝結(jié)魏茨曼氏菌可分泌多種凝固素、雙乙酰、L-乳酸等抑菌物質(zhì)，能抑制腸道內(nèi)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、變形桿菌等有害菌。

表3 BC66 抑制病原菌作用Table 3 Antigonistic acticity of BC66

2.5 BC66 與其他乳酸菌的拮抗關(guān)系

凝結(jié)魏茨曼氏菌對(duì)腸道有害菌及飼料源有害菌[33]抑制作用的研究較多，對(duì)多種商業(yè)飼用益生菌的研究報(bào)道較少，考慮到商業(yè)復(fù)合飼用益生菌在凝結(jié)魏茨曼氏菌與其他飼用益生菌菌株之間可能的拮抗效應(yīng)[34]，本研究初步考查了BC66 和干酪乳桿菌W189、嗜酸乳桿菌W211、乳酸片球菌W172、屎腸球菌W362、糞腸球菌W471 的拮抗作用，結(jié)果如圖9所示，橫向劃線的菌株為BC66，縱向劃線的菌株為不同的益生菌，從圖中可以看出BC66 與干酪乳桿菌W189、嗜酸乳桿菌W211、乳酸片球菌W172 不存在拮抗關(guān)系，和糞腸球菌W471、屎腸球菌W362 存在較弱拮抗作用。

圖9 BC66 與幾株常規(guī)益生菌之間的拮抗作用Fig.9 The results of antagonism between BC66 and several strains of probiotics

2.6 安全性評(píng)價(jià)

2.6.1 溶血性實(shí)驗(yàn) 如圖10 所示，BC66 周?chē)闯霈F(xiàn)透明溶血圈，而作為陽(yáng)性質(zhì)控菌株的化膿性鏈球菌在血瓊脂平板上出現(xiàn)了透明的溶血圈，表明凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 沒(méi)有溶血活性。

圖10 溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.10 The results of the hemolytic test

2.6.2 抗生素敏感性評(píng)價(jià) 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)是考察益生菌安全性的重要檢查指標(biāo)，如果菌體對(duì)抗生素敏感，說(shuō)明細(xì)菌細(xì)胞中不存在抵抗這種抗生素的基因。參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗微生物藥物敏感實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[35]，對(duì)15 種抗生素進(jìn)行了耐抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)研究，由表4 可知，凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 對(duì)15 種抗生素均處于敏感狀態(tài)，此菌株不具有耐藥性，可認(rèn)為是安全菌株。

表4 BC66 對(duì)常用抗生素的敏感程度Table 4 The antibiotic susceptibility of BC66

2.6.3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 觀察飼喂后的小鼠活力情況，所有小鼠生命體征活躍，未見(jiàn)不良反應(yīng)，均未出現(xiàn)中毒和死亡現(xiàn)象，說(shuō)明菌株BC66 在GB15193.9-2014推薦劑量下進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)無(wú)顯性致死作用。此外，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)和大量臨床觀察表明凝結(jié)魏茨曼氏菌是安全菌種，沒(méi)有致突變性、致畸性和遺傳毒性[36]。

3 結(jié)論

本研究從健康仔豬糞便中分離篩選到一株耐高溫，產(chǎn)乳酸的凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66，并對(duì)其作為益生菌的潛力和安全性進(jìn)行了初步研究和評(píng)價(jià)。結(jié)果表明該菌株在胃腸道苛刻條件（pH3.0；膽鹽 0.3%）下具有較強(qiáng)的生存能力，表現(xiàn)出良好的抗病原菌活性和抗生素敏感性，且沒(méi)有溶血活性。此外，該菌株產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的芽孢，在90 ℃下處理10 min 還能保持較高的活性，能夠抵御高溫食品和飼料生產(chǎn)的工業(yè)化過(guò)程，可作為潛在的益生菌產(chǎn)品應(yīng)用于食品、飼料等領(lǐng)域。綜上所述，本研究從自然界分離到的新菌株凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 具有在飼料工業(yè)中應(yīng)用的明顯優(yōu)勢(shì)和潛力。然而，進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)基因功能分析仍然需要開(kāi)展，以期對(duì)該菌株的優(yōu)良性狀進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，為芽孢益生菌的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。