禽組織和禽蛋中獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

劉書余，郭亞文，湯亞云，高鵬飛，管凡荀，朱雅麗，謝愷舟,

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

禽肉和禽蛋是人類非常重要的蛋白質(zhì)來源。肉組織和蛋中的獸藥殘留會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響（如抗菌素耐藥性和致癌性）[1]，這使得控制獸藥殘留成為確保消費(fèi)者健康的重要參數(shù)。在家禽生產(chǎn)中常用獸藥主要有生長(zhǎng)促進(jìn)劑[2]、驅(qū)蟲劑[3]和抗生素[4]等，用來提高動(dòng)物機(jī)體免疫力和快速增長(zhǎng)。雖然獸藥在防治禽病、促進(jìn)家禽生長(zhǎng)和提高飼料轉(zhuǎn)化率方面發(fā)揮了一定的積極作用，但伴隨著國(guó)內(nèi)肉雞養(yǎng)殖逐漸向著集約化、規(guī)?；姆较虬l(fā)展，養(yǎng)殖場(chǎng)所產(chǎn)生的污水、禽類糞便都對(duì)周邊的養(yǎng)殖環(huán)境產(chǎn)生了很大影響，所以造成禽類養(yǎng)殖環(huán)境中病原微生物多，禽類抗病力弱，養(yǎng)殖者不得不加大獸藥的使用量，導(dǎo)致獸藥殘留在家禽組織、器官和食用產(chǎn)品中，從而危害消費(fèi)者的健康。目前已經(jīng)報(bào)道了測(cè)定動(dòng)物源性食品中獸藥的分析方法，其中大多數(shù)使用液相色譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[5?9]。然而，盡管這些方法通常被驗(yàn)證用于確證分析目標(biāo)化合物，但這些儀器方法需要昂貴的設(shè)備、耗時(shí)的樣品處理和經(jīng)驗(yàn)豐富的人員，很難滿足食品質(zhì)量安全快速檢測(cè)的需要。因此，為解決畜禽食品安全這一具體問題，開發(fā)簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)禽組織和禽蛋中獸藥殘留物是當(dāng)務(wù)之急。大多數(shù)國(guó)家也開始為食品安全提出更高的要求，檢測(cè)技術(shù)趨于高科技、序列化、快速測(cè)量、便攜式和商業(yè)化[10]。本文綜述了近十年來禽組織和禽蛋中獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，比較了不同快速檢測(cè)技術(shù)在應(yīng)用方面的優(yōu)缺點(diǎn)，探討了多種快速檢測(cè)技術(shù)在禽組織和禽蛋中的未來發(fā)展趨勢(shì)，以期為禽類食品中獸藥殘留評(píng)估、檢測(cè)和監(jiān)管提供理論基礎(chǔ)。

1 獸藥殘留種類及危害

1.1 常見殘留獸藥種類

獸藥殘留是指飼料中添加被攝入后以及用藥后蓄積或存留于畜禽機(jī)體和產(chǎn)品（如雞蛋、肉品等）中原型藥物及其代謝產(chǎn)物，包括與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)殘留。禽組織和禽蛋中常見獸藥殘留種類如表1。畜牧中獸藥主要被用于各種動(dòng)物疫病防治和臨床研究，若過度使用，容易造成藥物在動(dòng)物體內(nèi)殘留，使動(dòng)物具有耐受性，在人體食用這些有藥物殘留的動(dòng)物后，藥物被人體吸收，從而影響人體內(nèi)部環(huán)境[11?12]?！吨袊?guó)食品安全發(fā)展報(bào)告（2019）》指出2018 年食品抽檢中農(nóng)獸藥殘留不符合標(biāo)準(zhǔn)占不合格樣品總量的15.4%，主要是禽類產(chǎn)品和鮮蛋中檢測(cè)出禁用和限用獸藥，其中鮮蛋的不合格率為3.9%[13]。2020 年實(shí)施的GB 31650 2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定，產(chǎn)蛋期禁用達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氟甲喹、噁喹酸這六種喹諾酮類藥物[14]，2021 年江蘇省市場(chǎng)監(jiān)管局通報(bào)1 批雞蛋中恩諾沙星超標(biāo)[15]，同年，山西大同市抽檢出雞肉樣品中恩諾沙星超標(biāo)；山東省和安徽省分別抽檢出2 批次和1 批次雞蛋中氟苯尼考?xì)埩舫瑯?biāo)[16]，由此可見，禽組織、禽蛋中藥物殘留問題嚴(yán)峻，建立快速的檢測(cè)方法用于檢測(cè)禽組織和禽蛋中的藥物殘留迫在眉睫。

表1 禽組織和禽蛋中常見藥物殘留種類Table 1 Types of common drug residues in poultry tissues and eggs

1.2 危害

畜禽養(yǎng)殖中的不合理使用獸藥、不遵守停藥期等濫用現(xiàn)象導(dǎo)致禽組織和禽蛋中藥物殘留超標(biāo)，獸藥殘留會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、導(dǎo)致人體中毒、腸道內(nèi)菌群失調(diào)、發(fā)生過敏反應(yīng)、三致作用以及環(huán)境污染。2016 年，英國(guó)經(jīng)濟(jì)學(xué)家O’Neill 發(fā)表的《全球抗菌藥物耐藥回顧：報(bào)告及建議》中指出細(xì)菌耐藥性導(dǎo)致每年死亡70 萬人[26]。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，每生產(chǎn)1 kg雞肉會(huì)消耗148 mg 抗菌藥物[27]，中國(guó)每年生產(chǎn)的抗菌藥物有近一半都用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[28]，當(dāng)攝入含有抗菌藥物的動(dòng)物源性食品時(shí)，人體內(nèi)腸道菌群與抗菌藥相互作用破壞體內(nèi)菌群的動(dòng)態(tài)平衡，影響腸道吸收，進(jìn)而引發(fā)各種疾病。長(zhǎng)期攝取含有獸藥殘留物的動(dòng)物源性食品，會(huì)在人體內(nèi)不斷蓄積并引起中毒和過敏反應(yīng)，中毒產(chǎn)生的癥狀如頭暈乏力、惡心嘔吐、腹瀉等，嚴(yán)重者呼吸困難、昏迷、休克、骨頭壞死[29]；過敏反應(yīng)如皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹、糜爛，更嚴(yán)重會(huì)出現(xiàn)膿包、水皰等[30]。同時(shí)還會(huì)使人類有致畸、致癌、致突變的風(fēng)險(xiǎn)，硝基呋喃類藥物會(huì)對(duì)人體肝和腎等器官造成損傷，嚴(yán)重危害人們的生活安全，此類藥物已被我國(guó)和其他多個(gè)國(guó)家禁止使用[31]。其次，各種藥物與代謝物會(huì)隨著動(dòng)物的糞便、尿液等排泄物排出體外，一些化學(xué)成分會(huì)對(duì)土壤結(jié)構(gòu)造成破壞，污染水環(huán)境，進(jìn)而威脅當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的穩(wěn)定發(fā)展[32]。

2 快速檢測(cè)技術(shù)的定義及種類

獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)，又稱快檢技術(shù)，是化學(xué)儀器分析和驗(yàn)證檢測(cè)技術(shù)中一種比較簡(jiǎn)單的操作，快速靈敏、檢測(cè)時(shí)間比較短、儀器條件要求不高、易于現(xiàn)場(chǎng)完成目標(biāo)成分分析?？焖贆z測(cè)技術(shù)的目的是從大量具有未知風(fēng)險(xiǎn)的食品樣品中快速篩選可疑樣品。該技術(shù)的特點(diǎn)是快速、靈敏，適合大批量樣品的初步篩選。獸藥殘留檢測(cè)中常用的快檢技術(shù)的特征對(duì)比如表2 所示。

表2 常用獸藥殘留快檢技術(shù)特點(diǎn)Table 2 Characteristics of commonly used rapid detection techniques for veterinary drug residues

快速檢測(cè)技術(shù)方法根據(jù)分子生物學(xué)原理劃分，主要包括了免疫學(xué)技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)、微生物抑制分析技術(shù)等。檢測(cè)對(duì)象基本上覆蓋了農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、飼料添加劑殘留、生物毒素、違禁化學(xué)添加物、激素、病原與微生物毒素等。根據(jù)產(chǎn)品形式被分為檢測(cè)卡、試紙法、試劑盒、快速檢測(cè)儀等。根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果可以分為定性檢測(cè)、限量檢測(cè)、半定量檢測(cè)以及定量檢測(cè)[33]。

2.1 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)因具有對(duì)抗原抗體交叉結(jié)合酶的高度特異性，因此在抗體分析研究上具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，并且它操作極其簡(jiǎn)便、無須配置昂貴的儀器設(shè)備就可以做到在現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)采樣即時(shí)分析。免疫學(xué)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫技術(shù)、生物芯片技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等[34]。

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是指一種設(shè)備簡(jiǎn)便且易人工操作、檢測(cè)結(jié)果快，靈敏度穩(wěn)定和準(zhǔn)確度高，能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)樣品快速檢測(cè)等一系列特點(diǎn)的新型檢測(cè)方法。其原理是利用抗原抗體分子的特異性結(jié)構(gòu)與蛋白競(jìng)爭(zhēng)性抗原結(jié)合，以其作為反應(yīng)標(biāo)記物并顯示該反應(yīng)后的檢驗(yàn)結(jié)果，從而能進(jìn)行快速定性與定量測(cè)定。其檢測(cè)原理如圖1，檢測(cè)成本較儀器檢測(cè)低，能夠充分彌補(bǔ)沒有大型實(shí)驗(yàn)儀器的空缺，適用于小批量樣品快速篩選檢測(cè)。目前此研究方法已被廣泛應(yīng)用于禽組織和禽蛋中的獸藥殘留快速檢測(cè)。

圖1 酶聯(lián)免疫測(cè)定法原理圖Fig.1 Schematic diagram of ELISA

楊建中[35]用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定雞肉、鴨組織中殘留的金剛烷胺藥物。在雞肉、鴨肉樣品中的檢測(cè)回收率在84%～112%之間，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。為雞肉和鴨肉等肉類中金剛烷胺類藥物及代謝物殘留的鑒別和篩選提供了新的思路。李建鯤等[36]采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，回收率在90.0%～102.0%之間，最低殘留檢測(cè)限為3.2 ng/g。He 等[37]建立了一種靈敏的酶聯(lián)免疫吸附法用于食品樣品中甲苯咪唑的分析，所得雞肉樣品中添加甲苯咪唑的平均回收率為84.31%～104.96%，與高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果一致。基于抗原和抗體的特異性結(jié)合，使得ELISA 法定量檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類藥物特異性極強(qiáng)，且相比其他方法更為簡(jiǎn)單，靈敏度高，檢測(cè)限一般可達(dá)ng 甚至pg 級(jí)別[38]，并且儀器水平要求不高，用酶標(biāo)儀就可以進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)分析結(jié)果相對(duì)可靠、穩(wěn)定，能夠滿足初檢和篩選分析要求，方便生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。目前已研制出多種攜帶方便的ELISA 快速檢測(cè)試劑盒，加快了ELISA 試劑盒商業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，使越來越多的學(xué)者研究改良和完善這種技術(shù)的方法。該試劑盒檢測(cè)速度快，試劑的保存時(shí)間比較長(zhǎng)，自動(dòng)化程度高且使用的有機(jī)溶劑較少，對(duì)環(huán)境造成的污染大大降低。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)已成為一種不可或缺的獸藥殘留檢測(cè)的常規(guī)手段，以確保我們的食品安全。

ELISA 技術(shù)具有多重優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也有一定的局限性，ELISA 法檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到一些其他不明因子的干擾，不可避免地出現(xiàn)定性假陽性與假陰性。對(duì)于不穩(wěn)定的和分子量較小的化合物難以分析，并且不能同時(shí)分析檢測(cè)樣品中多種成分。要實(shí)現(xiàn)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)替代傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，研究者們還需要做大量的工作，相信未來通過與色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合使用來彌補(bǔ)一些局限性，從而提高檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性，繼而使食品安全問題得到有效解決。

2.1.2 免疫層析技術(shù) 免疫層析技術(shù)法（Immunoch-romatographic assay，ICA）是由分子色譜層析技術(shù)和現(xiàn)代免疫診斷技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的一項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)。該方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)速度快、成本較低、高通量等優(yōu)點(diǎn)[39?40]，其中膠體金技術(shù)已被廣泛應(yīng)用[41]。

膠體金免疫技術(shù)是指一種以膠體金顆粒為特異性標(biāo)記物，基于抗原抗體特異性反應(yīng)的快速檢測(cè)方法，可以通過人工目測(cè)的方式判斷試驗(yàn)結(jié)果的有效性[42]。其原理是利用化學(xué)還原法將氯金酸溶液制備成粒子直徑從幾納米擴(kuò)大至幾十倍納米半透明性膠體溶液，膠體溶液電荷一般帶負(fù)電，能均勻穩(wěn)定并迅速吸附蛋白質(zhì)，且不需要改變蛋白質(zhì)粒子的生物活性，并制成金標(biāo)抗體或抗體蛋白，當(dāng)這些特殊金標(biāo)蛋白粒子迅速大量聚集載體時(shí)，使待檢樣品中相應(yīng)的抗體或抗原在載體的特定部位發(fā)生特異性反應(yīng)而顯色。膠體金免疫層析條是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的固相標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，有效解決了傳統(tǒng)檢測(cè)方法在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)、動(dòng)植物病毒檢測(cè)、農(nóng)藥殘留檢測(cè)等領(lǐng)域檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備不便、專業(yè)性要求高的缺點(diǎn)。其免疫層析試紙條檢測(cè)如圖2，利用這一特性制備的膠體金免疫層析試紙條被廣泛應(yīng)用，可現(xiàn)場(chǎng)定性和半定量檢測(cè)，重復(fù)性好，可用于藥物殘留的快速初篩，適合臨床及大規(guī)模樣品檢測(cè)[43]。孫曉崢等[44]開發(fā)了一種能夠檢測(cè)氟喹諾酮類化合物及其它類抗生素的試紙條，檢測(cè)了河北省的雞肉樣品3414 份，所得樣品平均陽性檢出率約占0.76%，有10 種氟喹諾酮類抗生素殘留檢測(cè)出陽性，該試紙條可實(shí)現(xiàn)對(duì)氟喹諾酮類化合物的快速篩選。高素敏[45]建立了一種膠體金免疫層析新方法，用于檢測(cè)雞肌肉中的磺胺嘧啶，在100 份雞肉樣品共檢出3 份陽性樣品，采用高效液相色譜法進(jìn)行了逐一復(fù)檢，各項(xiàng)結(jié)果保持一致，該方法準(zhǔn)確穩(wěn)定。栗慧等[46]研制出的土霉素膠體金免疫層析試紙條，5～10 min 內(nèi)即可得出檢測(cè)結(jié)果，極大地縮短了現(xiàn)場(chǎng)樣品的檢測(cè)時(shí)間，加快了現(xiàn)場(chǎng)分析的效率，適合國(guó)內(nèi)相關(guān)執(zhí)法部門對(duì)土霉素藥物殘留問題的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。膠體金標(biāo)記免疫層析技術(shù)作為一種新型的免疫學(xué)快速診斷和檢測(cè)技術(shù)，由于成本低、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適合基層和現(xiàn)場(chǎng)使用。從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展來看，膠體金試紙條作為一種快速篩查手段，對(duì)建立更敏感、更快捷的獸藥檢測(cè)方法將起到積極的促進(jìn)作用，為畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留的監(jiān)測(cè)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，該技術(shù)將在動(dòng)物源性食品安全與質(zhì)量控制方面發(fā)揮越來越重要的作用，實(shí)現(xiàn)其理想的價(jià)值。

圖2 免疫層析試紙條檢測(cè)示意圖Fig.2 Detection schematic diagram of immunochromatographic test strip

雖然膠體金免疫層析技術(shù)具有檢測(cè)準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，但其自身仍有一些方面不足而亟待改善。如簡(jiǎn)單快速的市售膠體金試紙只能進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)，檢測(cè)能力弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陰性[47]。面對(duì)此問題，Wang 等[41]建立了將試紙與便攜式光熱讀卡器相結(jié)合的光熱試紙測(cè)定法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)13 種獸藥和農(nóng)藥的定量檢測(cè)，具有優(yōu)異的檢測(cè)能力，有著較好的發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景。

2.1.3 生物芯片技術(shù) 生物芯片（Biochip）技術(shù)根據(jù)抗原識(shí)別和特異性抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫學(xué)原理，采用熒光標(biāo)記免疫競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定樣品中的獸藥殘留含量。該分析方法具有高通量、高靈敏度等特性。近幾年，我國(guó)研究者在此特性方面又取得了一系列的技術(shù)進(jìn)步，已經(jīng)自行研發(fā)并成功應(yīng)用了獸藥殘留分析的生物芯片技術(shù)平臺(tái)[48]。生物芯片技術(shù)分別包括為生物基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片技術(shù)等[49]。其中蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)結(jié)果靈敏度更高，滿足歐盟和世界大多數(shù)國(guó)家及組織對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)要求。圖3為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測(cè)步驟圖，蛋白試劑盒還可以直接實(shí)現(xiàn)對(duì)各種食用動(dòng)物如雞肉、雞肝等食品中的獸藥殘留檢測(cè)，如磺胺類、鏈霉素、恩諾沙星以及氯霉素等快速檢測(cè)。

圖3 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)原理示意圖Fig.3 Protein chip technology principle diagram

生物芯片技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品前處理程序簡(jiǎn)單，檢測(cè)分析更為快速等一系列優(yōu)點(diǎn)，還能同時(shí)對(duì)體內(nèi)多種獸藥進(jìn)行連續(xù)分析，有效地節(jié)省了檢測(cè)費(fèi)用，縮短了整個(gè)檢測(cè)過程的時(shí)間，提高了檢測(cè)效率[50]。陳愛亮等[51]開發(fā)了一種晶芯獸藥殘留蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)，可在3～5 h 內(nèi)完成雞肉和雞肝中恩諾沙星、鏈霉素等獸藥的快速檢測(cè)。郭志紅等[52]應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)建立了雞肉和雞肝中磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、鏈霉素的高通量篩選方法，各藥物在雞肉和雞肝中的回收率均在80%～106%之間，與色譜法作比較分析，結(jié)果表明蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)前處理方法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果可靠，可用于這兩種組織中對(duì)應(yīng)獸藥的殘留檢測(cè)。

博奧生物芯片公司開發(fā)了一個(gè)獸藥殘留蛋白芯片檢測(cè)平臺(tái)，通過此平臺(tái)能夠在幾小時(shí)內(nèi)完成肉食品中10 種獸藥殘留的定量分析[53]，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

2.1.4 化學(xué)發(fā)光免疫分析法 化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Chemiluminescent immunoassay，CLIA）分為化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法，是在近20 年來發(fā)展起來的另一種新型免疫技術(shù)，其原理圖見圖4。該方法能將原來具有高靈敏度特點(diǎn)的傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光分析法與具有高特異性的生物免疫熒光分析法有機(jī)結(jié)合起來，這種新型技術(shù)具有多種優(yōu)點(diǎn)，如檢測(cè)范圍寬、檢測(cè)特異性高、操作與過程簡(jiǎn)單易學(xué)等，對(duì)于提高免疫分析法的靈敏度方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并且它不存在放射性污染，是一種有潛力的實(shí)驗(yàn)室免疫學(xué)檢測(cè)方法[54]。

圖4 CLIA 技術(shù)原理圖Fig.4 Technical schematic diagram of CLIA

呂月霞[55]建立了一種化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測(cè)雞肉中的硝基呋喃類藥物，試驗(yàn)回收率在79%～106%之間，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高。陶曉奇[56]建立了一種用于定量檢測(cè)雞肉樣品中的氯霉素的化學(xué)發(fā)光免疫法，其檢測(cè)限為0.0010 μg/kg，回收率87.6%～118.8%，還建立了雞肉樣品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的化學(xué)發(fā)光免疫分析法，其檢測(cè)限分別為1.63 和1.18 μg/kg，回收率在70.3%～102.0%范圍內(nèi)，該檢測(cè)分析方法靈敏度高，檢測(cè)限、回收率以及穩(wěn)定性等指標(biāo)均滿足我國(guó)和歐盟獸藥殘留分析的要求。Tao 等[57]基于化學(xué)發(fā)光酶免疫分析建立了對(duì)雞肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢測(cè)方法，雞肉中提取的氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢測(cè)限分別為0.526 和0.453 ng/mL，回收率為71.8%～102%和70.3%～100%?；瘜W(xué)發(fā)光免疫法在畜禽產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)中有良好的應(yīng)用潛力，是一種優(yōu)秀的快檢方法。

2.2 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器技術(shù)（Biosensor）是指?jìng)鞲衅髂軌驅(qū)⑸锓肿芋w內(nèi)分離的某些酶、組織、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞凋亡等過程傳導(dǎo)下的一些生化反應(yīng)迅速轉(zhuǎn)化為電、熱或光信號(hào)，并同時(shí)通過這種信號(hào)的細(xì)微變化來檢測(cè)各種目標(biāo)化合物的智能設(shè)備[58]。如圖5 所示，其技術(shù)主要原理是先將一個(gè)抗原片段或一組抗體片段固定插入到適當(dāng)?shù)膫鞲衅魃?，利用其抗?抗體反應(yīng)的特異性和在抗原抗體片段上的標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)放大等機(jī)制來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[59]?？乖涂贵w在結(jié)合過程中會(huì)發(fā)生物理化學(xué)參數(shù)間的變化，這種變化實(shí)時(shí)通過傳感器被轉(zhuǎn)換和放大，從而提供了更高的檢測(cè)靈敏度和高選擇性。

圖5 生物傳感器技術(shù)原理圖Fig.5 Technical schematic diagram of biosensor

生物傳感器技術(shù)操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好、易于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，且檢測(cè)成本低，在禽類食品安全檢測(cè)方面有著廣泛的應(yīng)用前景。李孝君等[60]制備了一種高靈敏電流型青霉素免疫傳感器，對(duì)雞肉中殘留的青霉素進(jìn)行定量檢測(cè)，該傳感器對(duì)雞肉中青霉素的最低檢出限為1.90 ng/g，可用于青霉素在實(shí)際雞肉樣品的檢測(cè)。Chen 等[61]開發(fā)了一種基于熒光的復(fù)合生物傳感器，用于檢測(cè)雞肉和雞肝中殘留的恩諾沙星，每個(gè)組織樣品中平均回收率在77%～99%范圍內(nèi)。Karaseva等[62]研制了一種基于電生聚合物的壓電免疫傳感器，用于檢測(cè)雞蛋中微量的氯霉素，使用半抗原-蛋白偶聯(lián)物和單克隆抗體以競(jìng)爭(zhēng)形式進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.2 ng/mL。Stevenson 等[63]開發(fā)設(shè)計(jì)了一種直接檢測(cè)肉類樣品中的頭孢噻呋殘留的新型電化學(xué)生物傳感器方法，在15 min 內(nèi)自動(dòng)完成檢測(cè)，在火雞肉樣品分析中的最高檢測(cè)限為約10 ng/mL?；谀撤N特異性反應(yīng)的生物傳感器，保持了生物活性物質(zhì)的特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，并且極大地簡(jiǎn)化了禽肉中獸藥殘留分析過程，提升了檢測(cè)通量；傳感器體積小，便于攜帶，有利于野外作業(yè)和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)，這些特征都使生物傳感器技術(shù)在獸藥檢測(cè)領(lǐng)域有了較為深入的研究。未來，食品中獸藥殘留生物傳感檢測(cè)技術(shù)的研究仍將集中在納米技術(shù)的應(yīng)用、換能檢測(cè)方法的創(chuàng)新和改進(jìn)，多通路自動(dòng)化檢測(cè)方案的實(shí)現(xiàn)等方面。

2.3 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)

隨著光電技術(shù)的迅速發(fā)展，拉曼檢測(cè)技術(shù)也有長(zhǎng)足的進(jìn)步，結(jié)合納米技術(shù)，傳統(tǒng)的拉曼檢測(cè)技術(shù)已逐步開始向表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)領(lǐng)域邁進(jìn)。如圖6 所示，表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）的工作基本原理是將一些表面粗糙金屬經(jīng)過特殊處理后作為活性基底，受測(cè)的物質(zhì)分子或官能團(tuán)直接地吸附到該金屬表面，使得被測(cè)的物質(zhì)分子或者官能團(tuán)所發(fā)射來的拉曼散射信號(hào)提高105～106倍[64]。

圖6 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)原理圖Fig.6 Technical schematic diagram of SERS

表面增強(qiáng)拉曼光譜在食品安全領(lǐng)域具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力和實(shí)用價(jià)值，因?yàn)樗哂锌焖贆z測(cè)、抗水干擾以及提供目標(biāo)指紋結(jié)構(gòu)信息的能力等技術(shù)優(yōu)勢(shì)[65?66]。彭義杰[67]基于納米金膠的SERS 快速檢測(cè)技術(shù)分別對(duì)鴨肉中萘夫西林、阿莫西林的殘留進(jìn)行初步定性檢測(cè)與定量分析。研究表明，藥物的最低檢測(cè)限為0.2 mg/L，平均回收率為90%～139%，建立的快速定量檢測(cè)方法基本上是穩(wěn)定可行且有效的，能夠?qū)崿F(xiàn)快速準(zhǔn)確測(cè)定鴨肉中的青霉素類的殘留，可為SERS 快速檢測(cè)技術(shù)在定量檢測(cè)禽組織中的抗生素殘留的實(shí)際應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。王婷[68]采用SERS技術(shù)進(jìn)行雞肉和鴨肉中的強(qiáng)力霉素、泰樂菌素、氧氟沙星和諾氟沙星抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè)，在雞肉樣本建立了PCA-LDA 鑒別模型，鴨肉樣本建立了PCA-SVM鑒別模型，經(jīng)過預(yù)測(cè)集驗(yàn)證兩個(gè)模型的分類準(zhǔn)確率，其準(zhǔn)確率達(dá)到93%以上。以上結(jié)果說明了利用SERS技術(shù)結(jié)合多種化學(xué)計(jì)量學(xué)法可以快速、準(zhǔn)確地鑒別出禽肉中強(qiáng)力霉素、泰樂菌素、氧氟沙星和諾氟沙星抗生素殘留。該方法具有很好的效果，已被應(yīng)用于禽組織中相關(guān)藥物殘留快速檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。

郭紅青[69]應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)雞肉、鴨肉中殘留的兩種硝基呋喃類代謝物進(jìn)行快速檢測(cè)研究，所得雞肉、鴨肉中硝基呋喃及代謝物回收率為75%～122%，說明應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)可以有效地對(duì)禽組織中殘留的兩種硝基呋喃類代謝物進(jìn)行檢測(cè)。Muhammad 等[70]制備SiO2@Au 核殼納米顆?；?，可用于雞蛋中氟蟲腈的簡(jiǎn)便和無標(biāo)記快速檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了基于SERS 的雞蛋中氟蟲腈的檢測(cè)，為快速檢測(cè)雞蛋或其他食品中的氟蟲腈污染提供了一種實(shí)用的解決方案。

2.4 微生物抑制分析技術(shù)

微生物活性抑制測(cè)定法是指根據(jù)一種藥物本身能夠直接抑制的特異微生物數(shù)量來對(duì)生物樣品中出現(xiàn)的藥物殘留進(jìn)行定性評(píng)價(jià)分析。培養(yǎng)皿法和試管法是微生物抑制方法的兩個(gè)子類型。與培養(yǎng)皿法相比，試管法更適合于動(dòng)物食品中抗菌藥物殘留的高通量篩選，因?yàn)樗炔缓臅r(shí)也不費(fèi)力。微生物顯色法檢測(cè)步驟如圖7 所示，當(dāng)樣品中沒有抗生素殘留或殘留量低于檢出限時(shí)，指示菌快速生長(zhǎng)產(chǎn)酸，使檢測(cè)液pH 下降，指示劑變色。反之，則會(huì)抑制指示菌生長(zhǎng)，使得檢測(cè)液pH 基本不變，指示劑不會(huì)變色。微生物檢測(cè)方法成本低、敏感性和精確度好，適用于大規(guī)模樣品的篩選。目前國(guó)內(nèi)已廣泛地將其作為一種快速初篩獸藥殘留檢測(cè)方法投入應(yīng)用[71]。

圖7 微生物顯色法檢測(cè)步驟圖Fig.7 Microbial color method detection steps

Wu 等[72]建立了一種可用于高效快速篩選雞蛋制品中的四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、和喹諾酮類等抗生素的廣譜微生物抑制方法。該方法對(duì)雞蛋中各種抗生素的檢測(cè)限均低于歐盟的最大殘留限。此外，該試劑盒的假陽性率和假陰性率均為0%，所以該方法對(duì)樣品中目標(biāo)化合物殘留的篩查是可靠的。楊修鎮(zhèn)等[73]建立了一種獸藥散劑中氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類的微生物管碟快速檢測(cè)方法，其中的檢測(cè)限范圍在1.5～3.5 mg/g，該方法簡(jiǎn)單易行，快速可靠，滿足大多數(shù)獸藥中非法添加抗菌藥物的檢測(cè)需求。王志強(qiáng)等[74]建立了一種微生物紙片法快速檢測(cè)雞肉中抗生素殘留的方法，該方法的最低檢出限均達(dá)到我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235 號(hào)文件《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》的限量要求。沈翠香[75]采用微生物抑制法對(duì)雞肉中恩諾沙星進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.015 μg/mL，回收率80%以上，通過液相色譜法驗(yàn)證40 份可疑陽性樣品雞肉，其假陽性率為5%，檢測(cè)結(jié)果基本一致，符合我國(guó)農(nóng)業(yè)部、歐盟等規(guī)定的殘留分析方法的要求。劉興泉等[76]采用微板檢測(cè)方法測(cè)定雞蛋中土霉素、四環(huán)素、金霉素，以嗜熱脂肪芽孢桿菌為檢測(cè)菌，在一個(gè)板上進(jìn)行多個(gè)樣品檢測(cè)，可以有效檢測(cè)出獸藥殘留，并且每個(gè)孔的檢測(cè)成本極低，是一種簡(jiǎn)單快速的微生物檢測(cè)方法，適用于基層推廣使用。其未來的發(fā)展方向主要是：克服現(xiàn)有分子生物學(xué)方法的缺點(diǎn)，繪制各種菌落圖譜，開發(fā)在線檢測(cè)軟件，能定量測(cè)定微生物細(xì)胞特征和性能，簡(jiǎn)化采集、培養(yǎng)等程序，提高檢測(cè)效率。使獸藥殘留的檢測(cè)方法向自動(dòng)化、快速化、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，試驗(yàn)條件標(biāo)準(zhǔn)化及檢測(cè)的高精度和高靈敏度發(fā)展。

3 小結(jié)

目前，酶聯(lián)免疫吸附法在獸藥殘留的快速檢測(cè)中發(fā)展得相對(duì)成熟，是國(guó)內(nèi)外動(dòng)物源性食品中獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的重要方法。酶聯(lián)免疫吸附法與傳統(tǒng)儀器方法相比最顯著的優(yōu)勢(shì)是其高靈敏度和特異性、樣品制備簡(jiǎn)單、高通量，因此每個(gè)樣品的成本低。雖然膠體金免疫技術(shù)可以在幾分鐘內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，但又因這種檢測(cè)對(duì)方法精度限制得過高，容易導(dǎo)致檢測(cè)出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，因此還需要借助實(shí)驗(yàn)室更加精密的儀器進(jìn)行定性和定量檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法在家禽獸藥檢測(cè)中展現(xiàn)出高特異性和高靈敏度，未來可能擴(kuò)大該方法在臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，特別是在同時(shí)分析多種標(biāo)志物的情況下。生物芯片技術(shù)作為生物技術(shù)和芯片技術(shù)的整合，顯示出優(yōu)異的高通量、快速響應(yīng)和便攜性，在家禽獸藥檢測(cè)中已應(yīng)用廣泛。除了以上快檢技術(shù)以外，越來越多的關(guān)注集中在使用便攜式和自動(dòng)化儀器（如微流體設(shè)備和智能手機(jī)）實(shí)施創(chuàng)新的生物傳感方法，以賦予生物傳感器更實(shí)用、集成、自動(dòng)化和便攜的功能。它在靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性方面優(yōu)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并在快速響應(yīng)和潛在便攜性方面顯示出優(yōu)勢(shì)，是最適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)方法之一。此外，隨著信息技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合大數(shù)據(jù)分析和人工智能的生物傳感器很可能成為一種新趨勢(shì)，以更有效地監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)整個(gè)食品供應(yīng)鏈中的藥物污染，確保食品安全。SERS 在獸藥殘留的檢測(cè)中表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度、簡(jiǎn)單的采樣和快速的測(cè)試速度。通過簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，SERS 基底具有靈活性、適應(yīng)性強(qiáng)、成本效益高、適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展和儀器的改進(jìn)，SERS 可以為獸藥殘留物分析提供一種常規(guī)且成本效益高的檢測(cè)方法。微生物抑制法檢測(cè)食品中獸藥殘留操作簡(jiǎn)單、快速靈敏、成本低廉，適合養(yǎng)殖場(chǎng)使用，作為獸藥篩檢方法將成為我國(guó)未來檢測(cè)發(fā)展的趨勢(shì)。

雖然與國(guó)內(nèi)外大型實(shí)驗(yàn)室儀器檢測(cè)法相比，上述這些快速檢測(cè)方法相對(duì)耗時(shí)要短，成本低，但由于我國(guó)長(zhǎng)期以來缺乏統(tǒng)一快速檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和試劑耗材的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，市場(chǎng)上常見的快檢產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。廠商應(yīng)根據(jù)食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布的《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》的相關(guān)要求對(duì)食品中農(nóng)獸藥殘留，食品添加劑、污染物質(zhì)等快速檢測(cè)方法及相關(guān)產(chǎn)品技術(shù)進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)完善國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化的快速檢測(cè)產(chǎn)品的審核程序，有利于我國(guó)規(guī)范快速檢測(cè)產(chǎn)品市場(chǎng)，更好地服務(wù)于食品安全監(jiān)督，確保食品安全和公眾的生命健康。

4 展望

當(dāng)前，獸藥濫用問題嚴(yán)重，殘留物超標(biāo)甚至是多倍超標(biāo)現(xiàn)象屢見不鮮。傳統(tǒng)的小規(guī)模、檢測(cè)周期長(zhǎng)的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)無法滿足當(dāng)前的需求，要從定性和定量?jī)煞矫娉霭l(fā)，開發(fā)出快速、便捷、準(zhǔn)確且能短時(shí)間內(nèi)出具較為準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果的技術(shù)已成為未來的發(fā)展趨勢(shì)，這也必然是食品安全快速檢測(cè)的發(fā)展方向。

隨著科技的進(jìn)步和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及學(xué)科交叉的日益緊密，獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)也越來越趨于高通量、便攜性和智能化?？梢栽O(shè)計(jì)和獲得具有廣泛特異性和對(duì)多種目標(biāo)的高親和力的識(shí)別元件，同時(shí)新型便攜式儀器的設(shè)計(jì)和新型功能材料的合成有助于促進(jìn)具有更多目標(biāo)分析物和更高靈敏度的新檢測(cè)方法的發(fā)展。對(duì)于獸藥殘留快速檢測(cè)，可以加強(qiáng)試劑原材料的研發(fā)，如核酸適配體、親和體、基因工程抗體等新型識(shí)別材料。大力發(fā)展生物傳感器、抗體芯片等新型信號(hào)輸出技術(shù)和免疫親和層析柱、其他基于石墨烯、碳納米管、超分子材料等樣品前處理技術(shù)。另一方面，提高設(shè)備研發(fā)水平，優(yōu)化儀器效能，結(jié)合現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)及人工智能技術(shù)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)設(shè)備的互聯(lián)互通。同時(shí)檢測(cè)的對(duì)象與數(shù)據(jù)也逐漸擴(kuò)大，將重點(diǎn)放在不同類型多種藥物殘留同時(shí)分析檢測(cè)，并通過不同技術(shù)的相互融合來提高技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性，確保檢測(cè)效率，將手機(jī)作為可視化終端，提高產(chǎn)品的便捷性，降低檢測(cè)成本，建立更完善的檢測(cè)體系，為現(xiàn)階段的食品安全提供強(qiáng)有力的保障。