細(xì)菌芽孢的形成、萌發(fā)及控制手段研究進(jìn)展

張東春，張雅娟，孫 穎，司海山，康亞朋，馬夢戈，王志新，寧亞維

（河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050000）

細(xì)菌芽孢（Spore）是芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭菌屬（Clostridium）等細(xì)菌營養(yǎng)體在環(huán)境脅迫（如低溫、干旱和營養(yǎng)缺乏等）條件下形成的一個圓形或橢圓形、壁厚、含水量低、抗逆性強(qiáng)的休眠體，對各種物理和化學(xué)殺菌處理有極強(qiáng)的抗性[1]。芽孢因抗逆性強(qiáng)難以在食品加工過程中被殺滅，因此食品加工后殘存的未滅活芽孢待外界環(huán)境適宜時可迅速萌發(fā)成為細(xì)菌營養(yǎng)體，致使食品腐敗、變質(zhì)。如存在于乳品中的蠟樣芽孢桿菌的芽孢，若加工過程中未被滅活，在乳品儲藏期間會萌發(fā)為營養(yǎng)體，不僅導(dǎo)致巴氏殺菌乳的變質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失，還會產(chǎn)生腹瀉型與嘔吐型等毒素，引起食源性疾病的爆發(fā)[2]。因而細(xì)菌芽孢的滅活是食品殺菌和保藏所面臨的主要挑戰(zhàn)之一。本文綜述了芽孢的結(jié)構(gòu)和形成過程及相關(guān)的分子機(jī)制、芽孢的萌發(fā)過程及芽孢對萌發(fā)信號的感應(yīng)、目前使用的芽孢控制技術(shù)對芽孢的作用效果及其機(jī)理，以及這些芽孢控制技術(shù)單獨或與其他技術(shù)相結(jié)合對芽孢的作用，以期為細(xì)菌芽孢控制技術(shù)的研究提供參考。

1 細(xì)菌芽孢概述

1.1 芽孢的結(jié)構(gòu)

芽孢具有同心殼層形式的多層結(jié)構(gòu)，其多層次結(jié)構(gòu)是芽孢抗逆性的基礎(chǔ)。芽孢的結(jié)構(gòu)分別是：孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、芽孢核心。其中，孢外壁和芽孢衣構(gòu)成芽孢抵御外界環(huán)境的第一道屏障。孢外壁主要含脂蛋白，通透性較差，只存在于某些種屬（如蠟樣芽孢桿菌、艱難梭菌等）的芽孢結(jié)構(gòu)中[3]。芽孢衣是由多種蛋白質(zhì)組成的多層結(jié)構(gòu)，可保護(hù)芽孢免受酶和表面活性劑等物質(zhì)的損傷。芽孢外膜是芽孢形成的必需結(jié)構(gòu)，但其在芽孢萌發(fā)和抵御外界損傷過程中均不起作用。皮層由交聯(lián)度低的肽聚糖構(gòu)成，形成了芽孢物理上的剛性結(jié)構(gòu)，可有效保持芽孢的低水分含量。另外，芽孢衣和皮層中分別含有皮層水解酶CwIJ 和SleB，可在芽孢萌發(fā)時水解皮層，打破芽孢的休眠狀態(tài)。

芽孢核心包括芽孢壁、內(nèi)膜層和核區(qū)。芽孢壁由肽聚糖組成，可發(fā)展為新細(xì)胞的壁。內(nèi)膜層由磷脂雙分子層組成，其流動性小、透過性極低，可保護(hù)核區(qū)DNA 免受外來物質(zhì)損傷。核區(qū)含有DNA、RNA 和大多數(shù)酶以及2,6-吡啶二羧酸（2,6-pyridinedicarboxylic acid，DPA）和一些α/β小分子酸溶蛋白（α/β-type small,acid-soluble proteins，SASPs）。DPA 可與Ca2+螯合形成Ca-DPA 并置換核區(qū)水分，導(dǎo)致芽孢核心脫水，增強(qiáng)芽孢抗?jié)駸嵝裕籗ASPs 可與DNA 緊密結(jié)合改變DNA 結(jié)構(gòu)和光化學(xué)性質(zhì)，保護(hù)DNA 免受部分殺菌處理（如熱、輻射和化學(xué)物質(zhì)等）導(dǎo)致的損傷。同時，SASPs 在芽孢萌發(fā)時可降解為氨基酸從而為新蛋白質(zhì)合成提供原料[4]。

1.2 芽孢的形成

1.2.1 芽孢形成的形態(tài)學(xué)特征 細(xì)菌的芽孢形成過程從形態(tài)學(xué)上可分為以下五個階段（圖1）[5]：a.軸絲形成：DNA 濃縮，形成束狀染色質(zhì)；b.極性隔膜形成：細(xì)胞膜內(nèi)陷形成極性隔膜，該隔膜將菌體分離成遺傳物質(zhì)相同但體積不同的前芽孢和母細(xì)胞兩部分；c.裹吞作用：母細(xì)胞細(xì)胞膜快速增長，裹吞前芽孢形成雙層膜結(jié)構(gòu)；d.皮層、芽孢衣形成：前芽孢雙膜間開始合成肽聚糖等物質(zhì)形成初生芽孢壁、皮層和芽孢衣，母細(xì)胞產(chǎn)生大量Ca-DPA 并將其泵入前芽孢中以置換前芽孢核區(qū)水分；e.芽孢成熟：母細(xì)胞裂解，釋放成熟芽孢。

圖1 芽孢桿菌屬芽孢形成過程圖[6]Fig.1 Bacillus sporulation process diagram[6]

此外，芽孢桿菌屬與梭菌屬芽孢在皮層、芽孢衣形成與DPA 轉(zhuǎn)運過程中稍有不同[6]：芽孢桿菌屬芽孢先形成皮層、芽孢衣，后母細(xì)胞將DPA 泵入前芽孢置換水分；而梭菌屬芽孢則在母細(xì)胞產(chǎn)生DPA 泵入前芽孢后形成皮層、芽孢衣等結(jié)構(gòu)。

1.2.2 芽孢形成的信號分子調(diào)控機(jī)制 芽孢的形成受信號分子調(diào)控，該過程主要在主調(diào)節(jié)劑Spo0A 和特異性的σ 因子如前芽孢σ因子（σF、σG）、母細(xì)胞σ因子（σE、σK）等調(diào)控下完成。芽孢桿菌屬尤其是枯草芽孢桿菌芽孢的信號分子調(diào)控機(jī)制研究較為深入，枯草芽孢桿菌芽孢經(jīng)信號感應(yīng)后，自磷酸化組氨酸激酶（KinA～E 激酶）直接將磷酸轉(zhuǎn)移酶Spo0F 磷酸化，后依次將磷酸轉(zhuǎn)移到主調(diào)節(jié)劑Spo0A（細(xì)胞進(jìn)入芽孢形成期的關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白），使得主調(diào)節(jié)劑Spo0A 被激活[6]。當(dāng)Spo0A 的含量和磷酸化水平達(dá)到一定閾值時，磷酸化的Spo0A 通過調(diào)控一系列芽孢形成相關(guān)基因（如spoIIA、spoIIE、spoIIG等）啟動產(chǎn)孢（圖2）。

圖2 芽孢桿菌屬芽孢形成相關(guān)分子機(jī)制Fig.2 Molecular mechanism related to spore formation of Bacillus

產(chǎn)孢過程中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Spo0A 和σ因子（是正確識別轉(zhuǎn)錄過程中啟動子的關(guān)鍵因子）在母細(xì)胞和前芽孢的不同階段相繼活化，其中特異性的σ因子σH和Spo0A 共同調(diào)控前芽孢的基因表達(dá)啟動菌體產(chǎn)孢[7]。極性隔膜形成前菌體依賴σH的活性產(chǎn)孢；極性分離后Spo0A 誘導(dǎo)前芽孢和母細(xì)胞中的σF和σE活化，σF和σE可促使母細(xì)胞裹吞前芽孢；裹吞完成后，σE和σF可調(diào)控σG和σK的活化，并在σG和σK作用下形成皮層、芽孢衣等結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致母細(xì)胞裂解，芽孢游離出來。

σ因子在芽孢形成的不同階段特定表達(dá)、發(fā)揮作用。極性分離后，前芽孢中σF立即被Spo0A 活化，σF主要控制基因在母細(xì)胞和前芽孢中的不對稱表達(dá)，并指導(dǎo)早期芽孢發(fā)育所需的基因以及編碼σG的sigG基因的轉(zhuǎn)錄[8]。在母細(xì)胞中，σE在σF作用下被活化，σE可阻止母細(xì)胞進(jìn)行第二次不對稱分裂，促進(jìn)母細(xì)胞對前芽孢的裹吞，并控制許多形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)（如調(diào)控芽孢衣的組裝）；此外，σE可調(diào)控母細(xì)胞產(chǎn)生大量膜蛋白（如與前芽孢DPA 積累有關(guān)的SpoVV 轉(zhuǎn)運蛋白）[8]。裹吞完成后，前芽孢中σG發(fā)揮活性取代σF，σG主要調(diào)控DNA 結(jié)合蛋白（該蛋白可調(diào)控DPA 積累、萌發(fā)受體蛋白合成等過程）的表達(dá)[9]。母細(xì)胞中σK取代σE，σK負(fù)責(zé)芽孢衣相關(guān)蛋白的合成，并可調(diào)控皮層形成相關(guān)酶的合成。另外，σK控制母細(xì)胞合成DPA 合酶SpoVFAB，該酶可將二羥基二吡啶甲酸轉(zhuǎn)化為DPA，并將高水平DPA泵入前芽孢，使得前芽孢DPA 積累[10]。此外，研究發(fā)現(xiàn)σA是枯草芽孢桿菌唯一必需的σ因子，σA降解會使芽孢萌發(fā)生長受阻[11]。

梭菌屬芽孢與芽孢桿菌屬芽孢具有不同的信號分子調(diào)控機(jī)制，如艱難梭菌芽孢在σH作用下磷酸化Spo0A，其后以類似于枯草芽孢桿菌芽孢的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，即前芽孢中表達(dá)σF和σG，母細(xì)胞中表達(dá)σE和σK，但其σ 因子的激活過程基本相互獨立，并發(fā)現(xiàn)σG的表達(dá)可能由Spo0A 激活[12]。相對于枯草芽孢桿菌和艱難梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌和肉毒梭菌芽孢在σK作用下激活Spo0A 轉(zhuǎn)錄，啟動芽孢的形成，產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢中σK可調(diào)控σF、σE活化并表達(dá)，肉毒梭菌芽孢中σK調(diào)控σF活化并表達(dá)。產(chǎn)氣莢膜梭菌和肉毒梭菌芽孢中σF和σK的產(chǎn)生具相互依賴性，且σK缺失將導(dǎo)致母細(xì)胞無法完成裹吞過程，而σE缺失會導(dǎo)致產(chǎn)孢階段停滯，無法形成芽孢[6]。

2 細(xì)菌芽孢的萌發(fā)

芽孢萌發(fā)是指在適宜條件下，芽孢經(jīng)歷DPA 釋放、皮層水解等一系列連續(xù)的降解事件，使休眠的芽孢萌發(fā)成新的營養(yǎng)體的過程。芽孢一旦開始萌發(fā)，其會迅速喪失對多種芽孢控制技術(shù)的抵抗力，使得芽孢易于被殺滅。

2.1 萌發(fā)過程

細(xì)菌芽孢雖處于休眠狀態(tài)但其仍可感知外界環(huán)境的變化，當(dāng)外界營養(yǎng)適宜尤其是有萌發(fā)劑存在時芽孢便可迅速萌發(fā)。以芽孢桿菌屬芽孢為例，當(dāng)萌發(fā)劑存在時，其芽孢衣外層GerP 蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆性變化，促使萌發(fā)劑滲入芽孢中，與芽孢內(nèi)膜（IM）中的相應(yīng)受體相互作用并誘導(dǎo)芽孢啟動萌發(fā)[1]。隨后萌發(fā)信號開始轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動萌發(fā)的第一階段，即H+、Na+等離子和Ca-DPA 釋放，芽孢折光性逐漸消失，芽孢核心部分水化。釋放的Ca-DPA 激活皮層水解酶啟動萌發(fā)的第二階段，即皮層開始水解，核心進(jìn)一步水化、膨脹，核內(nèi)新陳代謝相關(guān)的酶類活性恢復(fù)，芽孢完成萌發(fā)。之后芽孢開始后續(xù)代謝活動，轉(zhuǎn)到營養(yǎng)體的生長階段，此時芽孢中的多種蛋白質(zhì)發(fā)生降解為新物質(zhì)的合成提供原料[13]。

與芽孢桿菌屬芽孢萌發(fā)不同，梭菌屬芽孢如產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌芽孢感知萌發(fā)劑的誘導(dǎo)進(jìn)行萌發(fā)后，先產(chǎn)生皮層水解酶（SleC）誘導(dǎo)皮層水解，后釋放Ca-DPA，致使核心水化、膨脹，內(nèi)膜流動性增加，進(jìn)而完成萌發(fā)[6]。

2.2 萌發(fā)劑

萌發(fā)劑是能與芽孢內(nèi)物質(zhì)結(jié)合后促使芽孢萌發(fā)的物質(zhì)，包括營養(yǎng)性萌發(fā)劑（如一些特定的營養(yǎng)性物質(zhì)）和非營養(yǎng)性萌發(fā)劑（如外源性Ca-DPA、十二烷基胺、肽聚糖）等。

2.2.1 營養(yǎng)性萌發(fā)劑 自然條件下，一些特定的營養(yǎng)性萌發(fā)劑（如特定的氨基酸類、嘌呤核苷類、糖類和特定的膽酸鹽等）可與芽孢內(nèi)膜上萌發(fā)受體蛋白GRs（germinant receptors，GRs）結(jié)合，誘導(dǎo)芽孢進(jìn)行生理性萌發(fā)。其中氨基酸類物質(zhì)如L-丙氨酸、L-纈氨酸、亮氨酸和脯氨酸等可與不同芽孢的萌發(fā)受體蛋白結(jié)合，單獨觸發(fā)芽孢萌發(fā)，如L-丙氨酸可分別與枯草芽孢桿菌GerA 萌發(fā)受體蛋白復(fù)合物和蠟樣芽孢桿菌的GerL 或GerR 萌發(fā)受體蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)；L-纈氨酸可與枯草芽孢桿菌GerA 萌發(fā)受體蛋白復(fù)合物結(jié)合，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)[14]。亮氨酸和脯氨酸可分別與巨大芽孢桿菌GerU 萌發(fā)受體蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)。嘌呤核苷類物質(zhì)如肌苷可與蠟樣芽孢桿菌的GerR、GerQ 或GerI 萌發(fā)受體蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)[15]。此外，一些氨基酸和糖類物質(zhì)的混合物如L-天冬酰胺、D-葡萄糖、D-果糖和K+混合物（AGFK）可與枯草芽孢桿菌GerB 和GerK 萌發(fā)受體蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)；L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬酰胺和KCl 的混合物可與產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢的脂蛋白GerKC 結(jié)合，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)。膽酸衍生物如?；悄懰猁}可被艱難梭菌芽孢中所含絲氨酸蛋白酶CspC 感應(yīng)并在共激活劑（甘氨酸、鈣離子）作用下促使芽孢萌發(fā)，但鵝去氧膽酸對該過程具拮抗作用[16]。

2.2.2 非營養(yǎng)性萌發(fā)劑 芽孢還可被不依賴GRs 的非營養(yǎng)性萌發(fā)劑誘導(dǎo)萌發(fā)，如外源性Ca-DPA、十二烷基胺、肽聚糖等。其中外源性Ca-DPA 可激活芽孢皮層水解酶CwlJ，該酶可水解皮層肽聚糖，引起芽孢內(nèi)源性Ca-DPA 釋放，釋放的內(nèi)源性Ca-DPA 再次激活皮層水解；十二烷基胺激活SpoVA 蛋白通道釋放內(nèi)源性Ca-DPA，然后內(nèi)源性Ca-DPA 觸發(fā)皮層水解。即外源性Ca-DPA 和十二烷基胺皆可誘導(dǎo)芽孢內(nèi)源性Ca-DPA 釋放、皮層水解完成萌發(fā)[17]。肽聚糖可與梭狀芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜上真核樣絲氨酸/蘇氨酸激酶PrkC 結(jié)合，誘導(dǎo)芽孢內(nèi)源性Ca-DPA 釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)。Liang 等[18]發(fā)現(xiàn)肽聚糖低至0.1 μg/mL 也具有誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌和產(chǎn)孢梭菌芽孢萌發(fā)的作用。此外，肽聚糖來源不同，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的情況也不同，如朱瑤迪等[19]發(fā)現(xiàn)僅產(chǎn)氣莢膜梭菌營養(yǎng)體所含肽聚糖可誘導(dǎo)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)，而芽孢皮層肽聚糖對誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)基本無影響。

2.3 萌發(fā)相關(guān)的物理因素

物理因素如壓力、溫度、pH、水分活度（aw）等是影響芽孢萌發(fā)的另一主要因素。研究表明，150 MPa～600 MPa 的壓力處理可誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，但不同壓力誘導(dǎo)機(jī)制不同。100～200 MPa 壓力可通過激活GRs 誘導(dǎo)萌發(fā)；500～600 MPa 高壓可激活芽孢內(nèi)膜中的SpoVA 蛋白通道，誘導(dǎo)Ca-DPA 釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)[20]。此外，一些對芽孢萌發(fā)水平與芽孢培養(yǎng)條件之間關(guān)系的研究表明，溫度、pH、aw等過高或過低均會抑制芽孢的萌發(fā)。如枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的芽孢在最適生長溫度37 ℃條件下培養(yǎng)，其萌發(fā)率高于30 ℃培養(yǎng)。Soni 等[21]發(fā)現(xiàn)pH 降低可抑制芽孢萌發(fā)，如pH 為4 可完全阻止蠟樣芽孢桿菌芽孢萌發(fā)；與之相似，徐茜茜[22]研究發(fā)現(xiàn)pH 降低可導(dǎo)致酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)過程延長甚至孢外壁損傷。Rao 等[17]發(fā)現(xiàn)aw值降至0.92 可抑制枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)。因此，低溫、低pH、低aw等條件均可抑制芽孢的萌發(fā)生長。

部分萌發(fā)影響因素與芽孢的相互作用如表1 所示。

表1 部分芽孢與萌發(fā)影響因素的相互作用Table 1 Interaction between some spores and influencing factors of germination

3 芽孢的控制技術(shù)及其應(yīng)用

在極端環(huán)境中，芽孢休眠體可以存活數(shù)百年甚至幾百萬年[23]。若食品原料或加工過程中處理不當(dāng)則很容易受其污染，導(dǎo)致食品腐敗、變質(zhì)甚至引起食源性疾病，造成嚴(yán)重危害。因此，必須對芽孢進(jìn)行嚴(yán)格控制以保障食品安全。芽孢的控制技術(shù)主要包括物理控制技術(shù)、化學(xué)控制技術(shù)和生物控制技術(shù)三類，表2 列舉了部分控制技術(shù)對芽孢的滅活效果及機(jī)制。

表2 部分控制技術(shù)對芽孢的作用效果及機(jī)制Table 2 The effect and mechanism of some control technologies on spores

3.1 物理控制技術(shù)及其應(yīng)用

控制芽孢常用的物理手段包括熱處理和非熱處理（如超聲處理、高壓處理、輻照處理、等離子體處理等）等技術(shù)，這些技術(shù)可通過誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)降低芽孢抗逆性后，配合后續(xù)處理滅活芽孢或直接破壞芽孢結(jié)構(gòu)達(dá)到殺滅芽孢的目的。

3.1.1 熱處理技術(shù)及其應(yīng)用 熱處理技術(shù)是一種常用的殺菌方法，其作用位點主要為皮層和內(nèi)膜，高溫破壞芽孢皮層、損傷內(nèi)膜完整性，導(dǎo)致孢內(nèi)物質(zhì)泄漏和熱抗性降低，進(jìn)而殺滅芽孢[24]。與常規(guī)加熱不同，歐姆加熱處理則通過干擾芽孢核心成分加劇芽孢失活，但歐姆加熱處理與常規(guī)加熱處理產(chǎn)生不同的滅活機(jī)制的原因尚不清楚[25]。

熱處理對芽孢滅活的效果受熱處理溫度、菌株種類、加熱方式及誘導(dǎo)萌發(fā)處理等工藝的影響。Juneja 等[26]發(fā)現(xiàn)在相同時間（30 min）內(nèi)熱處理對大米中蠟樣芽孢桿菌芽孢的失活效果隨處理溫度增加而增強(qiáng)：如溫度自90.5 ℃升高至99 ℃，可使失活芽孢數(shù)量增加2.53 logs；說明提高殺菌溫度可以顯著縮短處理時間。此外，不同菌株所產(chǎn)芽孢的熱抗性也不同：如韋氏芽孢桿菌芽孢的熱抗性強(qiáng)于蕈狀芽孢桿菌芽孢的熱抗性，其中韋氏芽孢桿菌芽孢經(jīng)107 ℃處理1.4 min 使芽孢數(shù)量降低4 logs，蕈狀芽孢桿菌芽孢僅95 ℃處理1.6 min 芽孢數(shù)量可減少4 logs[27]。另外，加熱方式不同及誘導(dǎo)萌發(fā)處理等工藝也會影響熱處理對芽孢的滅活作用：Schottroff 等[25]發(fā)現(xiàn)歐姆加熱處理較常規(guī)加熱對枯草芽孢桿菌芽孢的滅活作用更強(qiáng)（121 ℃處理4.4 s 可使芽孢失活增加2.2 logs）。Ansari 等[28]研究發(fā)現(xiàn)水、全脂牛奶、米粥等介質(zhì)中的枯草芽孢桿菌芽孢的耐熱性不同：水中芽孢的耐熱性最弱，米粥中芽孢的耐熱性最強(qiáng)，該現(xiàn)象可能與食物的粘稠度和脂肪等成分對微生物的保護(hù)作用有關(guān)。Buhr 等[29]研究發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌芽孢經(jīng)萌發(fā)劑處理后對熱處理的抗性大大降低：使用萌發(fā)劑處理30 min 后，經(jīng)60 ℃熱處理1 h 可使芽孢數(shù)量減少>2 logs，若再次進(jìn)行萌發(fā)誘導(dǎo)處理，則可使芽孢數(shù)量減少≥6 logs。李素等[30]發(fā)現(xiàn)中溫香腸中凝結(jié)芽孢桿菌芽孢經(jīng)葡萄糖誘導(dǎo)萌發(fā)后，在后續(xù)灌制及殺菌過程中可被有效控制（芽孢生長量低于103CFU/g）。因而，增加熱處理溫度、改變食品基質(zhì)如使用脂肪含量低、流動性強(qiáng)的食品基質(zhì)或使用萌發(fā)劑進(jìn)行誘導(dǎo)處理等可增強(qiáng)熱處理對食品中芽孢的滅活效果。

3.1.2 非熱殺菌處理技術(shù)及其應(yīng)用

3.1.2.1 超聲處理技術(shù) 超聲作為一種非熱殺菌技術(shù)，其產(chǎn)生的剪切和空化效應(yīng)可破壞芽孢衣的結(jié)構(gòu)、改變芽孢內(nèi)膜的通透性，導(dǎo)致水分子進(jìn)入芽孢內(nèi)部，降低芽孢的耐熱性[28]。Fan 等[31]發(fā)現(xiàn)超聲處理對降低芽孢數(shù)量無顯著影響，但超聲處理可降低芽孢對熱處理的抗性，使得超聲處理與后續(xù)熱處理產(chǎn)生協(xié)同作用。另外，超聲處理可使萌發(fā)芽孢失活，且該失活效果隨超聲處理溫度的增加而增加：如Fan 等[32]發(fā)現(xiàn)55 和63 ℃超聲處理30 min 可將枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌萌發(fā)芽孢數(shù)量分別減少2.06 和2.20 logs，說明超聲處理作用可能與芽孢萌發(fā)狀態(tài)有關(guān)，芽孢經(jīng)誘導(dǎo)萌發(fā)后抗逆性降低，使用超聲處理時便可達(dá)到滅活效果。Ansari 等[28]將超聲處理應(yīng)用于全脂牛奶中的枯草芽孢桿菌芽孢的控制，發(fā)現(xiàn)使用114 μm振幅（1.1 W/mL）超聲處理5 min 可顯著降低芽孢耐熱性（D100℃從4.51 min 降至2.94 min）。因而超聲技術(shù)多與其他殺菌處理如熱處理結(jié)合以增強(qiáng)其對芽孢的滅活效果。

3.1.2.2 高壓處理技術(shù) 高壓處理通過誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，進(jìn)而破壞萌發(fā)芽孢結(jié)構(gòu)顯著提高芽孢的熱敏感性。Wang 等[33]研究發(fā)現(xiàn)200 MPa 壓力處理20 min后結(jié)合500 MPa 壓力處理20 min 可破壞萌發(fā)芽孢的ATP 的合成過程。但壓力單獨處理對芽孢的滅活作用較弱導(dǎo)致其應(yīng)用于芽孢的控制效果受限，如550 MPa 壓力處理25 min 僅對枯草芽孢桿菌芽孢造成亞致死性損傷[34]。因此，改進(jìn)高壓處理工藝或以高壓為主的復(fù)合殺菌技術(shù)可能在芽孢的控制領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用潛力。

3.1.2.3 等離子體處理 等離子體是氣體在受到外界高能量作用時電離產(chǎn)生的一種物態(tài)。利用低溫等離子體技術(shù)處理水或氣體后所得的低溫等離子體活性水（plasma activated water，PAW）、大氣壓冷等離子體等可產(chǎn)生豐富的活性物質(zhì)，具有滅菌效果好、品質(zhì)破壞小、無毒副作用等優(yōu)點，在食品工業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景。低溫等離子體技術(shù)對芽孢作用靶位主要分為芽孢的外部結(jié)構(gòu)及內(nèi)部成分兩種：對于芽孢外部結(jié)構(gòu)，低溫等離子體技術(shù)可導(dǎo)致芽孢形態(tài)改變，其產(chǎn)生的活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等物質(zhì)對芽孢外部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生刻蝕作用及改變膜組成成分并破壞GRs 蛋白；對于芽孢內(nèi)部成分，低溫等離子體技術(shù)可導(dǎo)致孢內(nèi)DPA 釋放、酶活性降低，損傷DNA[35]。此外，PAW 對芽孢的滅活作用隨處理溫度的升高而加劇，且牛血清白蛋白等有機(jī)物會為芽孢提供屏障以抵抗PAW 處理；初始芽孢濃度越低，PAW 滅活作用越強(qiáng)，這可能是外層芽孢會為內(nèi)部芽孢提供物理屏障導(dǎo)致[36]。即較高溫度（55 ℃）、低牛血清白蛋白濃度、低芽孢濃度、低PAW 活化量（50 mL）可增強(qiáng)PAW對芽孢的滅活作用。因而PAW 對芽孢的滅活作用與工藝參數(shù)、芽孢所處環(huán)境因素等密切相關(guān)，導(dǎo)致其應(yīng)用于芽孢的控制領(lǐng)域的難度增加。

3.1.2.4 輻照處理 輻照處理如UV-C，400 nm 藍(lán)光輻射及γ輻射等對芽孢具較好的殺滅作用。輻照處理對芽孢的主要作用位點是DNA，UV 輻射導(dǎo)致DNA 鏈斷裂產(chǎn)生特定的光產(chǎn)物（嘧啶二聚體如CPD 和6-4PP 及芽孢特異性光產(chǎn)物等）殺滅休眠芽孢，并可引起高水平的芽孢形成突變[37]。KrCl 激發(fā)光還可破壞DNA 完整性并導(dǎo)致內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化，引起芽孢內(nèi)膜損傷[38]。Taylor 等[39]發(fā)現(xiàn)222 nm 輻射（140 μW/cm2）處理可有效殺滅約106logs 的枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和艱難梭菌芽孢，并發(fā)現(xiàn)輻照處理對芽孢的殺滅效果基本不受芽孢濃度的影響。Tremarin 等[40]以污染酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的蘋果汁為研究對象，發(fā)現(xiàn)使用UV-C 處理8 min 可將蘋果汁中的芽孢數(shù)量減少5 logs。因此，輻照處理在食品（尤其是液體食品）中的芽孢控制方面有著重要應(yīng)用，但也需要注意輻照處理產(chǎn)生的自由基可能會對食品的營養(yǎng)成分和感官品質(zhì)等產(chǎn)生不良影響。

3.1.2.5 脈沖電場處理 脈沖電場處理可利用高壓脈沖電源產(chǎn)生的電脈沖作用殺滅芽孢。脈沖光對芽孢的作用位點為芽孢衣，脈沖光處理可通過切割氨基酸鍵對芽孢衣所含部分蛋白進(jìn)行降解或分離達(dá)到殺滅芽孢的目的。Clair 等[41]使用脈沖光處理細(xì)菌芽孢，發(fā)現(xiàn)10.8 J/cm2脈沖光處理可使枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量減少>6 logs。Soni 等[42]發(fā)現(xiàn)高壓脈沖電場在低電場強(qiáng)度（9.4 kV/cm）和中溫（80 ℃）條件下可將蠟樣芽孢桿菌芽孢數(shù)量減少3.1 logs。并揭示該處理可使涉及肽聚糖降解的寡糖脫乙酰酶的基因（BC1768）上調(diào)，芽孢形成時分離所需的青霉素結(jié)合蛋白的基因（BC2729）下調(diào)。

3.1.3 熱處理與非熱物理殺菌技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用 非熱物理殺菌技術(shù)（如高壓、超聲等）與熱處理結(jié)合不僅具協(xié)同殺滅芽孢的作用，而且可降低熱處理導(dǎo)致的食品營養(yǎng)物質(zhì)損失[40]。其中，高壓聯(lián)合熱處理（high pressure and thermal processing，HPTP）可引起芽孢形態(tài)改變，導(dǎo)致部分芽孢膜、芽孢衣受損、核心中空變扁甚至導(dǎo)致芽孢裂解。HPTP 對芽孢的殺滅時間隨處理溫度的增高而縮短（如600 MPa 時，80 ℃處理5 min 或90 ℃處理1 min 均可滅活酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢）[43]。董鵬[44]使用350 MPa 結(jié)合150 ℃處理0.24 s，可將牛奶中解淀粉芽孢桿菌芽孢數(shù)量降低3.5 logs。劉月[45]研究發(fā)現(xiàn)HPTP（600 MPa，75 ℃處理20 min）結(jié)合溶菌酶處理（0.05%）可有效滅活番茄汁中的枯草芽孢桿菌芽孢，且該處理不會明顯影響番茄汁的營養(yǎng)和感官品質(zhì)。但HPTP 處理芽孢時存在短時處理滅活芽孢效果較差或高強(qiáng)度處理影響食品品質(zhì)的問題，而HPTP 處理與其他技術(shù)聯(lián)用雖可降低HPTP 對食品品質(zhì)的不利影響，但HPTP 處理與其他技術(shù)結(jié)合應(yīng)用也導(dǎo)致操作步驟和成本的增加。此外，高壓與其他處理技術(shù)聯(lián)合如高壓二氧化碳處理（high pressure carbon dioxide，HPCD）被應(yīng)用于芽孢的控制領(lǐng)域，HPCD 處理可增加內(nèi)膜通透性、破壞芽孢衣結(jié)構(gòu)及芽孢核心成分，從而導(dǎo)致芽孢失活[46]。但目前HPCD 對芽孢滅活的數(shù)學(xué)模型還需進(jìn)一步研究以確定其應(yīng)用于芽孢滅活最佳工藝條件。

此外，熱輔助超聲波處理（thermosonication，TS）可損傷皮層和內(nèi)膜，致使芽孢皮層部分酶（如皮層轉(zhuǎn)移酶）失活，致使內(nèi)膜GRs 被破壞，部分蛋白泄漏，從而導(dǎo)致芽孢失活[31]。TS 對芽孢的滅活效果隨超聲密度增加而增加：Fan 等[31]研究發(fā)現(xiàn)超聲波與80 ℃熱處理聯(lián)合使用40 min，超聲波由6.67 W/mL 增加至20 W/mL 會使枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量額外減少約0.45 logs。且TS 處理對嗜冷蠟樣芽孢桿菌芽孢的殺滅效果優(yōu)于HPTP 處理[47]。另外，超聲預(yù)處理可降低熱處理55%的熱能需求，起到一定的節(jié)能作用[28]。

3.2 化學(xué)控制技術(shù)及其應(yīng)用

控制芽孢常用的化學(xué)技術(shù)主要是通過添加一些化學(xué)類抑菌物質(zhì)（如表面活性劑、化學(xué)防腐劑、商業(yè)消毒劑等）達(dá)到抑制或殺滅芽孢的作用。

3.2.1 表面活性劑 一些表面活性劑對芽孢具一定的殺滅作用，如陽離子表面活性劑十二烷基胺和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）不僅可誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，還能整合到萌發(fā)的芽孢內(nèi)膜中破壞內(nèi)膜滲透性對萌發(fā)芽孢起到殺滅作用。Mokashi 等[48]使用1 mol/L 十二烷基胺于45 ℃處理枯草芽孢桿菌、艱難梭菌芽孢（約108CFU/mL）4 h 發(fā)現(xiàn)芽孢滅活率高達(dá)99%。并發(fā)現(xiàn)十二烷基胺會消散萌發(fā)芽孢新陳代謝產(chǎn)生質(zhì)子動力。Dong 等[49]使用CTAB 及其類似物（TAB、DTAB 等）處理蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的芽孢，發(fā)現(xiàn)CTAB 可誘導(dǎo)蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌芽孢萌發(fā)，進(jìn)而殺滅萌發(fā)芽孢，而TAB（C-14）和DTAB（C-12）誘導(dǎo)芽孢釋放CaDPA 的效果較差，這可能與烷基鏈長度有關(guān)。Hirokado 等[50]發(fā)現(xiàn)一些非離子型表面活性劑如甘油脂肪酸酯處理對枯草芽孢桿菌芽孢也具有滅活作用，且甘油脂肪酸酯對芽孢的滅活效果隨碳鏈延長而降低，其中2 mmol 單辛酸甘油酯（MC10）對芽孢滅活作用最強(qiáng)。

3.2.2 化學(xué)防腐劑 化學(xué)防腐劑如硝酸鹽、亞硝酸鹽、檸檬酸鹽等對芽孢的生長具抑制作用。Velugoti等[51]發(fā)現(xiàn)檸檬酸鈣（Ca-Cit）、檸檬酸鉀（K-Cit）和檸檬酸鈉（Na-Cit）能抑制腌制火腿和未腌制火腿中的產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢的萌發(fā)和生長，經(jīng)0.5% Ca-Cit 處理6.5 h 后兩種火腿中芽孢僅生長約0.5 logs，并發(fā)現(xiàn)其抑制作用與肉制品冷卻時間無關(guān)；但對于KCit 或Na-Cit 處理，當(dāng)肉制品冷卻時間延長至12 h以上時，則需1.0%及以上濃度方對芽孢的萌發(fā)和生長具抑制作用。Cayemitte 等[52]通過添加乳酸鈣、抗壞血酸鈣實現(xiàn)了鮭魚中蠟樣芽孢桿菌芽孢的高效滅活，使得芽孢數(shù)量減少7 logs。

3.2.3 商業(yè)消毒劑 一些商業(yè)消毒劑如次氯酸鈉、過氧乙酸等處理可降低芽孢的存活能力。Ghosh 等[53]發(fā)現(xiàn)芽孢對次氯酸鹽和濕熱的抵抗力與培養(yǎng)介質(zhì)有關(guān)，于2×SG 產(chǎn)孢平板制備的芽孢次氯酸鹽抗性和耐濕熱能力明顯優(yōu)于LB 平板制備的芽孢。Sudhaus等[54]發(fā)現(xiàn)過氧乙酸對蠟樣芽孢桿菌芽孢的滅活效果受溫度和菌株的影響，如低溫會降低過氧乙酸對芽孢的滅活效果；對于不耐受過氧乙酸的蠟樣芽孢桿菌DSM 4384 芽孢，經(jīng)2.0%過氧乙酸處理30 min 可使芽孢數(shù)量減少>6 logs，而耐受過氧乙酸的蠟樣芽孢桿菌DSM 4313，需使用3.0%過氧乙酸處理60 min方可達(dá)到所需的滅活效果。

3.2.4 其他處理 抗生素、溶菌酶和金屬離子等處理也會增強(qiáng)芽孢的敏感性。抗生素如尼生素可對萌發(fā)芽孢或去除芽孢衣芽孢發(fā)揮抑制作用，其主要在芽孢萌發(fā)后期作用于芽孢的內(nèi)膜導(dǎo)致芽孢死亡[55]。溶菌酶可通過誘導(dǎo)去除芽孢衣芽孢的萌發(fā)達(dá)到降低芽孢抗逆性的目的[56]。金屬離子如Tb3+、Dy3+等會擾亂芽孢內(nèi)膜中Ca-DPA 釋放通道降低芽孢的萌發(fā)速度而對芽孢發(fā)揮抑制作用[57]。此外，F(xiàn)?積累會導(dǎo)致枯草芽孢桿菌芽孢耐濕熱性顯著降低，且F?（10～40 mmol/L）可在pH 為5.5 時顯著抑制芽孢萌發(fā)，而芽孢衣及外膜可在一定程度上阻擋芽孢對水、F?等吸收[58]。

3.2.5 化學(xué)控制技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用 化學(xué)抑菌物質(zhì)與其他技術(shù)聯(lián)用，如過氧乙酸聯(lián)合超臨界二氧化碳技術(shù)、微酸性電解水聯(lián)合超聲技術(shù)、亞硝酸鹽聯(lián)合γ輻射等技術(shù)可協(xié)同滅活芽孢。其中，過氧乙酸聯(lián)合超臨界二氧化碳技術(shù)對芽孢的作用位點是芽孢膜，其可損害芽孢內(nèi)膜、破壞膜電位，抑制芽孢萌發(fā)時的氧化代謝以滅活芽孢[56]。Setlow 等[56]使用7 ppm過氧乙酸與超臨界二氧化碳聯(lián)合處理可在25 min 內(nèi)將枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)量減少6 logs。微酸性電解水與超聲技術(shù)聯(lián)合處理可先通過超聲處理破壞芽孢皮層，進(jìn)而使得酸性電解水破壞內(nèi)膜完整性，達(dá)到協(xié)同滅活芽孢的作用[59]。此外，為降低化學(xué)防腐劑如亞硝酸鹽在食品中的添加量，Silva 等[37]以含有較低亞硝酸鹽含量（<100 mg/kg）的肉制品為樣品，發(fā)現(xiàn)肉制品中亞硝酸鹽添加量為50 mg/kg 時，聯(lián)合使用γ輻射（>3 kGy）可使肉制品中產(chǎn)孢梭菌芽孢數(shù)量減少2 logs 及以上，且亞硝酸鹽含量和輻射劑量越高對芽孢的殺滅作用越強(qiáng)?；瘜W(xué)技術(shù)雖然在芽孢控制領(lǐng)域表現(xiàn)出較好的抑制效果，但在使用時應(yīng)結(jié)合實際加工環(huán)境考慮其使用劑量及對食品安全性的影響。

3.3 生物控制技術(shù)及其應(yīng)用

3.3.1 生物抑菌劑應(yīng)用 生物抑菌物質(zhì)因具有安全性高、對食品感官品質(zhì)影響小等優(yōu)點，被應(yīng)用于芽孢的控制領(lǐng)域。已有研究表明nisin 可破壞萌發(fā)芽孢膜完整性、抑制膜電位和氧化代謝，從而抑制萌發(fā)芽孢的生長，但其對休眠芽孢無抑制作用。Fan 等[32]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌芽孢被誘導(dǎo)萌發(fā)后對nisin、百里香精油的敏感性增強(qiáng)：nisin（57 μg/mL）可將枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌萌發(fā)芽孢數(shù)量分別降低1.29～1.64、1.14～1.36 logs。除nisin 外，一些微生物源抑菌物質(zhì)（如一些酶類、脂肽類物質(zhì)等）和部分天然植物源化合物也可對芽孢起到一定的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，酶類物質(zhì)中噬菌體vB_BpuM_BpSp裂解酶Ply67 可破壞芽孢皮層，導(dǎo)致芽孢結(jié)構(gòu)變形，進(jìn)而破壞內(nèi)膜完整性，致使芽孢無法萌發(fā)、內(nèi)部物質(zhì)溶出從而導(dǎo)致芽孢死亡[60]。Zhao等[61]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素JLA-9（32 μg/mL）對蠟樣芽孢桿菌芽孢具抑制作用，該細(xì)菌素可抑制萌發(fā)芽孢的代謝活性、破壞芽孢膜完整性從而有效抑制萌發(fā)芽孢的生長。Ghosh 等[53]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度抗菌肽ceragenin-13（300 μg/mL）在高溫（70 ℃）條件下可激活枯草芽孢桿菌芽孢CaDPA 通道誘導(dǎo)孢內(nèi)CaDPA 釋放，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)增強(qiáng)其敏感性進(jìn)而滅活芽孢。Cetin-Karaca 等[62]發(fā)現(xiàn)天然植物源化合物反式肉桂醛（125 mg/L）在23 ℃時可完全抑制嬰幼兒米粉中污染的蠟樣芽孢桿菌及其芽孢的生長。

3.3.2 生物抑菌劑與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用 目前研究較多的生物抑菌劑聯(lián)用組合為nisin 與高壓技術(shù)結(jié)合使用。Modugno 等[63]發(fā)現(xiàn)nisin（50 IU/mL）和高壓（500 MPa）聯(lián)用對芽孢桿菌屬芽孢具高度協(xié)同抑制作用（芽孢數(shù)量減少>4 logs），該聯(lián)合處理通過高壓破壞芽孢結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)nisin 對芽孢的抑制效果，從而發(fā)揮協(xié)同作用。Fan 等[32]發(fā)現(xiàn)55 ℃、超聲頻率為20 kHz 的TS 處理可增強(qiáng)萌發(fā)芽孢對nisin 的敏感性（可將枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌萌發(fā)芽孢數(shù)量分別降低2.38～2.39、1.38～1.50 logs）。Rao 等[64]將HPCD 處理（20 MPa、84～86 ℃）和nisin（200 IU/mL）聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)該聯(lián)合處理對枯草芽孢桿菌芽孢具有協(xié)同滅活效果，其通過HPCD 處理依次破壞芽孢衣及皮層、增強(qiáng)內(nèi)膜通透性，使得nisin 進(jìn)入芽孢，進(jìn)一步破壞內(nèi)膜，從而發(fā)揮協(xié)同作用。除nisin 外，Cho 等[65]使用濃度為1%（w/v）的肉豆蔻、香菜及藏茴香粗提物分別處理枯草芽孢桿菌芽孢，發(fā)現(xiàn)三種提取物均可將芽孢數(shù)量減少90%以上。后使用提取物與乳酸聯(lián)合處理，發(fā)現(xiàn)提取物濃度0.1%～2.5%（w/v）、pH 為4～5 時對芽孢滅活作用優(yōu)于單獨處理，可將芽孢數(shù)量額外降低1～3 logs。

4 結(jié)語

本文主要從細(xì)菌芽孢的形成和萌發(fā)過程入手，綜述了芽孢形成和萌發(fā)的相關(guān)機(jī)制，并對芽孢的控制手段進(jìn)行了介紹，發(fā)現(xiàn)對芽孢的控制仍以物理和化學(xué)技術(shù)為主，這些技術(shù)雖對芽孢具較好的控制作用，但物理處理如熱處理會破壞食品品質(zhì)、影響營養(yǎng)價值，非熱殺菌雖對芽孢具有較好的殺滅效果，但該技術(shù)成本較高，對芽孢的殺滅效果易受食品狀態(tài)、處理工藝參數(shù)的影響，且部分非熱殺菌技術(shù)在分子水平層面對芽孢的滅活機(jī)理未完全闡明，在食品中的應(yīng)用研究較少，導(dǎo)致其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受阻；化學(xué)控制技術(shù)中多數(shù)處理僅可用于食品表面設(shè)備上芽孢的控制，無法直接應(yīng)用于食品加工，化學(xué)防腐劑如亞硝酸鹽雖可直接應(yīng)用于食品行業(yè)，但其仍存在安全性不高等問題。生物抑菌劑因抑菌性能優(yōu)良、成本低、安全性高等優(yōu)點，被應(yīng)用于食品的抗菌保鮮等領(lǐng)域，但該技術(shù)在芽孢控制方面的應(yīng)用較少，且對芽孢的抑制機(jī)制還未能完全清楚，仍需對對生物抑菌技術(shù)的應(yīng)用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，進(jìn)而推動生物抑菌技術(shù)對食品加工過程中芽孢的應(yīng)用。因此，未來芽孢的控制技術(shù)需要尋找新型綠色、安全、高效的技術(shù)，實現(xiàn)高效控制芽孢，保證食品的安全與食用品質(zhì)。