結(jié)合原子力顯微鏡和光學(xué)圖像識別的單細(xì)胞力學(xué)特性快速測量研究*

呂曉龍 魏佳佳 張志慧 李 密*

（1）沈陽工業(yè)大學(xué)人工智能學(xué)院，沈陽 110870；2）中國科學(xué)院沈陽自動化研究所，機(jī)器人學(xué)國家重點實驗室，沈陽 110016；3）中國科學(xué)院機(jī)器人與智能制造創(chuàng)新研究院，沈陽 110169；4）中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

細(xì)胞力學(xué)特性在細(xì)胞生命活動過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞不僅是個生化系統(tǒng)，同時也是個力學(xué)系統(tǒng)［1］。細(xì)胞處于由細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、其他細(xì)胞（如基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等）、組織液、各種生物化學(xué)分子（如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、活性氧類等）等共同構(gòu)成的三維微環(huán)境中［2-3］。作為細(xì)胞微環(huán)境的重要組成成分，細(xì)胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供物理支架以維持組織的完整性和彈性，同時細(xì)胞外基質(zhì)還提供細(xì)胞各種生命活動過程中所需的力學(xué)線索［4］。哺乳動物的細(xì)胞外基質(zhì)由約300種蛋白質(zhì)分子（如膠原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白等）組成［5］。根據(jù)細(xì)胞外基質(zhì)所處位置和成分的不同，細(xì)胞外基質(zhì)主要分為間隙基質(zhì)（interstitial matrix）和基膜（basement membrane）兩類［6］。動物體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞均與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白直接接觸，如上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞與基膜接觸，結(jié)締組織中的細(xì)胞被間隙基質(zhì)所包圍，甚至血液中的細(xì)胞也與游離態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如纖連蛋白）進(jìn)行接觸［7］。細(xì)胞通過機(jī)械力傳導(dǎo)機(jī)制（mechanotransduction）將細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械刺激（如細(xì)胞外基質(zhì)剛度、血液/淋巴液剪切力）轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為和功能（如細(xì)胞運動、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、形態(tài)重構(gòu)以及基因變化等）［8］。細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用具有典型的交互性（reciprocal）：一方面，細(xì)胞在其生命活動過程中會不斷生成、降解或重排細(xì)胞外基質(zhì)以改變細(xì)胞外基質(zhì)的某種或多種特性；另一方面，細(xì)胞生理活動導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)變化反過來會影響并改變細(xì)胞行為［9］。細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用會導(dǎo)致細(xì)胞力學(xué)特性的動態(tài)變化，特別是在疾病發(fā)生發(fā)展過程中（如癌癥）通常伴隨著細(xì)胞力學(xué)特性的顯著變化［10］。近年來，研究人員開始在多種疾?。ㄈ绨┌Y、纖維化和心血管病等）中探索對細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)特性進(jìn)行干預(yù)（如預(yù)防、逆轉(zhuǎn)力學(xué)特性變化或中斷細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)特性的響應(yīng)等）的治療方法［11］，并已經(jīng)研發(fā)了多種進(jìn)入臨床試驗階段的力學(xué)特性干預(yù)藥物［12］，為治療人類疾病提供了新的可能。因此，開展細(xì)胞力學(xué)特性研究對于揭示生命活動內(nèi)在機(jī)理、推進(jìn)新型藥物研發(fā)、促進(jìn)疾病診療進(jìn)展等均具有重要的基礎(chǔ)意義。

原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）的發(fā)明為單細(xì)胞力學(xué)特性研究提供了重要方法。AFM 利用壓電陶瓷管驅(qū)動一根末端集成有極細(xì)針尖的微懸臂梁對樣本表面進(jìn)行水平方向光柵掃描，同時通過一束照射到懸臂梁背面的激光檢測懸臂梁信號（如偏轉(zhuǎn)量、振幅、頻率等）變化來感知掃描過程中針尖表面原子與樣本表面原子之間的相互作用，并通過信號處理與反饋電路系統(tǒng)控制探針在垂直方向運動以維持針尖與樣本之間相互作用力恒定，從而獲取反映樣本表面形貌起伏的三維圖像［13-14］。AFM 的獨特優(yōu)勢是可以直接在生理溶液環(huán)境下對活體狀態(tài)生物樣本的表面精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行無損高分辨率成像，特別是通過控制AFM 探針在樣本表面進(jìn)行壓痕（indentation）實驗還可以對樣本的力學(xué)特性進(jìn)行精確測量［15］。在壓痕實驗中，AFM 探針在樣本表面垂直方向進(jìn)行逼近（approach）-回退（retract）往復(fù)運動，同時通過記錄該過程中探針懸臂梁偏轉(zhuǎn)量變化和壓電陶瓷垂直方向的位置變化即得到力曲線（force curve），最后利用理論模型對力曲線進(jìn)行分析即可得到樣本的力學(xué)特性（如楊氏模量）。AFM壓痕實驗方法在細(xì)胞力學(xué)特性探測方面取得了極大的成功，已成為細(xì)胞力學(xué)特性表征的重要方法［16-17］。通過將細(xì)胞表面特定區(qū)域劃分為若干個網(wǎng)格，并控制AFM 探針在所有網(wǎng)格內(nèi)分別進(jìn)行壓痕實驗，即可得到反映細(xì)胞表面不同位置點力學(xué)特性分布的楊氏模量圖［18］。特別是近年來出現(xiàn)的基于峰值力輕敲（peak force tapping）模式的AFM 多參數(shù)成像方法可以同時獲取細(xì)胞形貌圖和力學(xué)特性圖［19-22］，極大地促進(jìn)了AFM 在細(xì)胞力學(xué)特性探測方面的應(yīng)用。然而需要指出的是，當(dāng)前基于AFM 的單細(xì)胞力學(xué)特性測量主要依賴于人工操作，即操作員需要在光學(xué)顯微鏡細(xì)胞成像導(dǎo)引下控制AFM 探針移動到目標(biāo)細(xì)胞表面特定位置后進(jìn)行探測。由于不同細(xì)胞間形態(tài)的差異，操作員僅憑經(jīng)驗通常難以準(zhǔn)確判斷并移動AFM 探針至所需位置，往往需要重復(fù)多次才能將AFM 探針移動至合適的位置以成功在目標(biāo)細(xì)胞表面進(jìn)行AFM 壓痕實驗，導(dǎo)致實驗過程耗時費力且效率低下。

針對上述問題，本文將AFM 和細(xì)胞光學(xué)圖像識別相結(jié)合，提出了單細(xì)胞力學(xué)特性快速測量方法。通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法自動識別出光學(xué)圖像中的細(xì)胞，并利用模板匹配算法識別光學(xué)圖像中的AFM探針，在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了目標(biāo)細(xì)胞和AFM探針空間位置關(guān)系的自動快速判斷并進(jìn)而控制AFM探針準(zhǔn)確移動至合適位置以對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行AFM壓痕實驗。實驗結(jié)果表明，所提出的方法不僅適用于常規(guī)AFM錐形針尖探針，還適用于AFM球形針尖探針，為AFM 單細(xì)胞力學(xué)特性自動測量提供了新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本文選用兩種細(xì)胞系進(jìn)行實驗，分別為HEK 293（人胚胎腎細(xì)胞）和MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞），細(xì)胞均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）。細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM 高糖培養(yǎng)基） 以及磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海瑞典生物科技有限公司，胎牛血清購買于美國Thermo Fisher 公司，青霉素-鏈霉素溶液購買于美國Hyclone公司。細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HEK 293和MCF-7 均為貼壁生長型細(xì)胞，因此直接將細(xì)胞接種在60 mm 培養(yǎng)皿（廣州潔特生物有限公司）中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher 公司）中進(jìn)行培養(yǎng)（37℃、5% CO2、95%空氣）。

1.2 AFM及球形探針制作

本文采用的AFM 型號為美國Bruker 公司生產(chǎn)的Dimension Icon AFM（圖1a）。該型AFM擁有一個安裝在AFM 掃描頭側(cè)面的光學(xué)顯微鏡，使操作員可以在光學(xué)顯微視覺導(dǎo)引下控制AFM 探針對基底目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行探測。將生長有細(xì)胞（HEK 293或MCF-7）的培養(yǎng)皿置于AFM 樣品臺后，即可控制AFM 探頭浸入培養(yǎng)皿液面對細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行探測。所采用的AFM錐形針尖探針型號為MLCT-C（美國Bruker 公司），該探針的材料為氮化硅，探針懸臂梁（懸臂梁背面有反射金涂層）的彈性系數(shù)為0.01 N/m，懸臂梁共振頻率為7 kHz，針尖曲率半徑為20 nm，針尖高度為2.5~8 μm。此外，在光學(xué)顯微視覺導(dǎo)引下利用AFM 微操作將單個微球黏附至MLCT-C探針懸臂梁制作得到球形針尖探針（圖2）。制作球形探針?biāo)璧腁B 膠（DP420）購自美國3M 公司，碳酸鋇微球（直徑20 μm）購自天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。首先將A膠和B膠以1∶1 在載玻片表面一端均勻混合，同時將碳酸鋇微球粉末蘸至載玻片表面另一端。隨后在光學(xué)顯微鏡視覺導(dǎo)引下控制AFM 探針移動至AB 膠上方并控制探針緩慢接近AB 膠，在懸臂梁接觸到AB 膠后立即控制AFM探針回退。緊接著轉(zhuǎn)動AFM樣品臺，控制AFM 探針移動至單個碳酸鋇微球上方（圖2aI）并控制探針接近微球（圖2aII），在懸臂梁接觸到微球后控制探針回退（圖2aIII）。將制作好的微球探針置于探針盒中保存12 h待AB膠徹底固化后即可利用微球探針進(jìn)行細(xì)胞力學(xué)特性測量實驗。對制作完成的微球探針進(jìn)行的掃描電鏡（SEM）成像清晰地顯示了修飾到AFM探針懸臂梁的單個微球（圖2b）。

Fig. 1 Combining AFM with optical image recognition for rapid measurements of single-cellular mechanical properties

Fig. 2 Preparation of the AFM probe with a spherical tip

1.3 結(jié)合光學(xué)圖像識別的AFM單細(xì)胞力學(xué)特性快速測量

光學(xué)圖像中細(xì)胞和AFM 探針自動識別流程如圖1b所示。將生長有細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于AFM樣品臺，隨后控制AFM 探針進(jìn)入培養(yǎng)皿液面并逼近培養(yǎng)皿基底。隨后利用AFM 光學(xué)顯微鏡（圖1a）拍攝細(xì)胞和AFM探針的光學(xué)圖像（圖1c）。利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練模型識別出光學(xué)圖像中的細(xì)胞輪廓并確定細(xì)胞輪廓重心坐標(biāo)，利用圖像模板匹配方法識別出光學(xué)圖像中的AFM 探針位置。其中，為獲取探針針尖的位置，利用日本HIROX 公司生產(chǎn)的正置光學(xué)顯微鏡對AFM 探針進(jìn)行成像，根據(jù)正置光學(xué)顯微鏡成像結(jié)果得到錐形針尖和球形針尖在探針懸臂梁上的準(zhǔn)確位置，從而在后續(xù)截取AFM 探針模板圖像時使針尖處于模板圖像的中間位置。得到細(xì)胞重心坐標(biāo)和AFM 探針針尖坐標(biāo)后即可確定目標(biāo)細(xì)胞和探針針尖之間的空間位置關(guān)系，隨后利用所得到的位置關(guān)系控制AFM 探針準(zhǔn)確移動至目標(biāo)細(xì)胞并進(jìn)行AFM 力學(xué)特性實驗。在完成對目標(biāo)細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測量后，控制AFM 探針移動至下一個細(xì)胞附近，并重復(fù)上述基于光學(xué)圖像自動識別的細(xì)胞力學(xué)特性快速測量流程。

近年來機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域的快速發(fā)展，特別是在深度學(xué)習(xí)方面的進(jìn)展，極大地促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)圖像理解分析的進(jìn)步，深度學(xué)習(xí)算法已成為生物醫(yī)學(xué)圖像分類、檢測、分割、配準(zhǔn)等的重要研究方法［23］。當(dāng)前，在生物醫(yī)學(xué)圖像分析方面應(yīng)用得最廣泛的深度學(xué)習(xí)模型是端到端（end-to-end）監(jiān)督學(xué)習(xí)的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型［24］。本文采用UNet++卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（圖3）識別AFM 光學(xué)顯微鏡采集的光學(xué)圖像中的細(xì)胞。UNet++由不同深度的U-Net 結(jié)構(gòu)（由卷積、下采樣、上采樣和跳躍連接組成的編碼器-解碼器網(wǎng)絡(luò)）組成，這些U-Net結(jié)構(gòu)的解碼器通過重新設(shè)計的跳躍連接以相同尺寸緊密相連［25］。UNet++網(wǎng)絡(luò)有以下優(yōu)點。首先，UNet++結(jié)構(gòu)中嵌入了不同深度的U-Net 結(jié)構(gòu)，這些U-Net 結(jié)構(gòu)共享一個編碼器，而這些U-Net結(jié)構(gòu)的解碼器則是通過跳躍連接的方式相互交織。利用深度監(jiān)督訓(xùn)練UNet++網(wǎng)絡(luò)時，所有U-Net 結(jié)構(gòu)通過共享圖像可同時得到訓(xùn)練，這種設(shè)計不僅提升了整體的圖像分割性能，還可以在推理時對模型進(jìn)行剪枝。其次，UNet++網(wǎng)絡(luò)不會受到跳躍連接的阻礙，因為只有來自編碼器和解碼器的相同比例特征圖才可以進(jìn)行融合。UNet++網(wǎng)絡(luò)中重新設(shè)計的跳躍連接可以提取出不同尺度的特征，允許聚合層將跳躍連接中各個尺度的特征圖與解碼器的特征圖進(jìn)行融合，因而在圖像語義分割和實例分割方面具有更好的性能。

Fig. 3 Schematic illustration of the UNet++ network structure

用于UNet++網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的數(shù)據(jù)集由本文采用的Dimension Icon AFM的光學(xué)顯微鏡（圖1a）拍攝得到。圖像大小為320×240 像素，經(jīng)過篩選共得到308 張細(xì)胞圖像。利用Labelme 軟件對圖像進(jìn)行標(biāo)注（圖1c）。圖像像素被標(biāo)注為2 類，分別為細(xì)胞（紅色表示） 和背景（黑色表示）。隨后在Windows 10系統(tǒng)環(huán)境下，以PyTorch為框架，使用矩池云人工智能云計算平臺（浙江）對數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練。訓(xùn)練集由通過對308張原始細(xì)胞及其標(biāo)注圖像進(jìn)行鏡像翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)等一系列圖像操作后得到的1 232張圖像組成。迭代次數(shù)為60次，經(jīng)過迭代后得到UNet++訓(xùn)練模型，用于后續(xù)對細(xì)胞光學(xué)圖像進(jìn)行的語義分割。利用C++編寫模板匹配程序并采用OpenCV軟件庫中平方差匹配方法以實現(xiàn)對獲取的光學(xué)圖像AFM探針的定位?？紤]到在AFM實驗中AFM 探針在探針夾上安裝姿態(tài)的誤差會導(dǎo)致模板圖像與待匹配圖像之間存在角度偏差，本文在模板匹配算法的基礎(chǔ)上添加了模板旋轉(zhuǎn)算法，即對模板從-5°到5°，以1°為步長依次進(jìn)行旋轉(zhuǎn)并在每次旋轉(zhuǎn)后都會對待匹配圖像進(jìn)行模板匹配，從中選取模板與待匹配圖像之間差異最小者作為最終匹配結(jié)果。此外，為了對光學(xué)圖像中像素之間的實際距離進(jìn)行標(biāo)定，在空白區(qū)域使用AFM 操控軟件控制AFM 探針移動一定距離（AFM操控軟件可以得到AFM探針移動的準(zhǔn)確距離），并利用模板匹配方法獲取探針移動前后的坐標(biāo)，得到光學(xué)圖像像素與實際距離的對應(yīng)關(guān)系。因此，在利用上述圖像分析方法分別得到細(xì)胞重心和AFM 探針針尖坐標(biāo)后，便可自動計算得到細(xì)胞與AFM探針之間的位置關(guān)系，從而控制AFM 探針準(zhǔn)確移動至細(xì)胞表面獲取力曲線。

1.4 SEM成像

利用美國Thermo Fisher 公司生產(chǎn)的Quattro SEM 環(huán)境掃描場發(fā)射電鏡對制作的微球探針進(jìn)行高分辨率成像。具體來說，利用導(dǎo)電膠將制作好的微球探針固定在SEM 樣品臺上，并利用離子濺射儀對樣本進(jìn)行鍍金處理。隨后在高真空模式下對微球探針樣本進(jìn)行掃描成像。

1.5 細(xì)胞楊氏模量計算

利用Hertz-Sneddon 模型（Hertz 模型對應(yīng)微球針尖探針，Sneddon 模型對應(yīng)常規(guī)錐形針尖探針）對獲取的力曲線進(jìn)行分析以得到細(xì)胞楊氏模量［15，26］：

其中F為探針加載力，E為細(xì)胞楊氏模量，R為微球針尖半徑，δ為壓痕深度，θ為錐形針尖半開角，υ為細(xì)胞的泊松比（一般認(rèn)為活細(xì)胞為不可壓縮材料，因此活細(xì)胞的泊松比為0.5［27］）。探針加載力F可以根據(jù)胡克定律從懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x得到：

其中k為探針懸臂梁彈性系數(shù)。獲取的力曲線記錄了AFM 壓痕過程中探針懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x與壓電陶瓷驅(qū)動器垂直方向位置變化量d之間的關(guān)系。獲取的力曲線分為兩部分，分別為逼近曲線和回退曲線。通常利用逼近曲線計算樣本的楊氏模量［28］。根據(jù)逼近曲線上接觸點的位置將逼近曲線轉(zhuǎn)化為壓痕曲線（壓痕深度等于壓電陶瓷驅(qū)動器垂直方向變化量d與懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x之間的差值），隨后利用Matlab （美國Mathworks 公司） 編寫的Hertz-Sneddon模型擬合程序?qū)汉矍€進(jìn)行擬合即得到細(xì)胞楊氏模量［13］。

2 結(jié)果與討論

為了驗證本文提出方法的有效性，首先利用常規(guī)錐形針尖AFM 探針進(jìn)行了實驗。圖4 顯示了結(jié)合AFM 和光學(xué)圖像識別對單個HEK 293 細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測量的實驗結(jié)果?？刂艫FM 探針到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞附近后，利用AFM 光學(xué)顯微鏡獲取細(xì)胞和AFM探針的光學(xué)圖像（圖4a）。隨后即可根據(jù)預(yù)先訓(xùn)練的UNet++網(wǎng)絡(luò)模型識別出光學(xué)圖像中的目標(biāo)細(xì)胞輪廓（圖4b），同時通過模板匹配方法識別出AFM探針（圖4c）。根據(jù)錐形針尖高分辨率光學(xué)成像結(jié)果（圖4a插圖）可以確保在制備的AFM探針模板圖像中針尖位置處于模板中心，因此模板識別結(jié)果的中心即為AFM探針針尖（圖4c藍(lán)色方框中心）。基于上述識別結(jié)果即可確定目標(biāo)細(xì)胞輪廓重心與AFM 針尖之間的位置關(guān)系（圖4d），得到AFM 探針在水平面內(nèi)移動至目標(biāo)細(xì)胞所需的距離（Δx和Δy），并將其輸入至AFM操控軟件，即可實現(xiàn)將AFM 探針準(zhǔn)確移動至目標(biāo)細(xì)胞（圖4e）并進(jìn)行AFM壓痕實驗。利用Hertz-Sneddon模型對壓痕實驗中獲取的力曲線進(jìn)行分析即得到細(xì)胞楊氏模量（圖4f）?？紤]到不同類型細(xì)胞之間的形態(tài)差異，利用該方法對MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行了實驗，實驗結(jié)果（圖5）表明，基于光學(xué)圖像自動識別可將AFM錐形針尖準(zhǔn)確移動至目標(biāo)MCF-7 細(xì)胞重心并在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了對MCF-7細(xì)胞力學(xué)特性的測量。

Fig. 4 Experimental results of utilizing AFM conical probe to rapidly detect the mechanical properties of single living HEK 293 cells under aqueous conditions based on optical image automatic recognition

Fig. 5 Experimental results of utilizing AFM conical probe to rapidly detect the mechanical properties of single living MCF-7 cells based on optical image automatic recognition

隨后利用AFM 微球探針測試了所建立的方法流程的有效性。圖6 為光學(xué)圖像識別導(dǎo)引下利用AFM 微球探針對單個HEK 293 活細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行探測的實驗結(jié)果，可以看到基于光學(xué)圖像識別可將微球探針準(zhǔn)確移動至目標(biāo)細(xì)胞表面并進(jìn)而對細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測量。圖7 為結(jié)合光學(xué)圖像識別和AFM微球探針對MCF-7細(xì)胞進(jìn)行探測的實驗結(jié)果，同樣顯示了所提出方法的有效性。為了獲取具有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果，利用所建立的方法分別對10 個HEK 293 細(xì)胞和10 個MCF-7 細(xì)胞的力學(xué)特性進(jìn)行了測量，其中在每個細(xì)胞表面獲取10 條力曲線，統(tǒng)計結(jié)果如圖8所示?？梢钥吹郊?xì)胞楊氏模量測量結(jié)果符合正態(tài)分布，且球形針尖探針測量得到的細(xì)胞楊氏模量要明顯小于錐形針尖探針測量得到的楊氏模量，與前人測量結(jié)果［29-31］一致。造成這種差異的主要原因是錐形針尖和球形針尖所探測細(xì)胞結(jié)構(gòu)部位的不同［32］。錐形針尖由于接觸面積小，其主要探測的是細(xì)胞表層局部區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，而球形針尖則由于接觸面積大探測的是細(xì)胞骨架及細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。細(xì)胞骨架的硬度要明顯大于細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致錐形針尖測量得到的細(xì)胞楊氏模量遠(yuǎn)大于球形針尖測量得到的細(xì)胞楊氏模量。

Fig. 6 Experimental results of utilizing AFM spherical probe to rapidly detect the mechanical properties of single living HEK 293 cells based on optical image automatic recognition

Fig. 7 Experimental results of utilizing AFM spherical probe to rapidly detect the mechanical properties of single living MCF-7 cells based on optical image automatic recognition

本文所提出方法對于AFM 單細(xì)胞力學(xué)特性研究具有積極意義。AFM 已成為單細(xì)胞力學(xué)特性研究的重要工具并在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。然而，現(xiàn)有的AFM 單細(xì)胞力學(xué)特性測量實驗嚴(yán)重依賴于人工，需要操作員根據(jù)經(jīng)驗判斷AFM 探針和目標(biāo)細(xì)胞之間的空間距離關(guān)系并控制探針移動至目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行壓痕實驗。本文通過借鑒光學(xué)圖像分析技術(shù)，實現(xiàn)了對光學(xué)圖像中細(xì)胞和AFM 探針位置的自動識別，在此基礎(chǔ)上控制AFM 探針準(zhǔn)確移動至目標(biāo)細(xì)胞并進(jìn)而完成壓痕實驗。本文提出的方法不依賴于操作員的經(jīng)驗，有助于提升AFM 壓痕實驗效率，為基于AFM 的高通量單細(xì)胞力學(xué)特性研究提供了新的思路和潛在可行的方法。此外本文提出的方法不僅適用于探測細(xì)胞表面局部區(qū)域力學(xué)特性的常規(guī)錐形針尖探針（圖4，5），還適用于探測細(xì)胞整體力學(xué)特性的球形針尖探針（圖6，7），對于AFM 細(xì)胞力學(xué)特性研究具有普遍意義。需要指出的是，本文方法直接控制探針移動到目標(biāo)細(xì)胞表面，因此探測范圍取決于所采用AFM 的探針在水平面的運動范圍。本文AFM 的水平面探針運動范圍為80×80 μm2，因此本文方法的探測范圍為以AFM探針針尖為中心的80×80 μm2區(qū)域。下一步可以在細(xì)胞光學(xué)圖像識別基礎(chǔ)上，通過控制AFM 樣品臺運動以提升單細(xì)胞力學(xué)特性自動化探測范圍。本文方法目前主要適用于單個孤立細(xì)胞，在未來通過借鑒聚團(tuán)細(xì)胞光學(xué)圖像分割方法［33］以對聚團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)分割將顯著提升本文方法的適用范圍。當(dāng)前在基于AFM 的細(xì)胞力學(xué)特性測量研究中，為了最大限度減少基底效應(yīng)對測量結(jié)果的影響，通常在細(xì)胞中央?yún)^(qū)域（細(xì)胞核）采集力曲線［34］?；诖耍疚幕诠鈱W(xué)圖像自動識別實現(xiàn)了準(zhǔn)確移動AFM 探針針尖至細(xì)胞中央?yún)^(qū)域以對細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測量。研究人員已經(jīng)提出了去除基底效應(yīng)的方法以使AFM 可以較準(zhǔn)確地測量細(xì)胞邊緣部位的力學(xué)特性［27］，因此下一步研究利用光學(xué)圖像識別算法自動識別出細(xì)胞其他部位（如在癌癥轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的癌細(xì)胞偽足結(jié)構(gòu)［35-36］以及細(xì)胞質(zhì)等），并實現(xiàn)將AFM探針準(zhǔn)確移動至細(xì)胞表面不同部位，以進(jìn)行力學(xué)特性測量，這對于理解細(xì)胞生命活動過程中的內(nèi)在力學(xué)機(jī)制具有重要意義。此外，通過將單個細(xì)胞連接到AFM 探針懸臂梁制成單細(xì)胞探針［37-38］，并應(yīng)用本文提出的方法有望實現(xiàn)對單對細(xì)胞間黏附作用的快速自動測量，對于細(xì)胞黏附行為研究具有積極意義。

Fig. 8 Statistical histograms of measuring cellular mechanical properties based on the combination of AFM and optical image recognition

3 結(jié)論

總結(jié)起來，本文結(jié)合AFM 和光學(xué)圖像自動識別技術(shù)實現(xiàn)了對單個活細(xì)胞力學(xué)特性的快速測量，為提升AFM 單細(xì)胞分析實驗探測效率提供了新的可能，對于單細(xì)胞力學(xué)特性研究具有重要基礎(chǔ)意義。