殼聚糖與細菌細胞膜相互作用的分子動力學(xué)研究*

朱景一 馬振宇 肖 敏 王祿山 蔣緒愷*

（1）山東大學(xué)國家糖工程技術(shù)研究中心，微生物技術(shù)國家重點實驗室，青島 266237；2）山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266237）

殼聚糖（chitosan，CS）是一種無抗原性、無毒性、具有良好生物相容性的天然生物高分子，其結(jié)構(gòu)由D-氨基葡萄糖（脫乙酰單位）和N-乙酰-D-氨基葡萄糖（乙酰單位）經(jīng)β-1,4 糖苷鍵連接而成［1］。脫乙酰殼聚糖具有抗革蘭氏陽性菌（如蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、植物乳桿菌、單核細胞增生性李斯特菌、短乳桿菌和保加利亞乳桿菌）和抗革蘭氏陰性菌（如鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、產(chǎn)氣腸桿菌和霍亂弧菌）的廣譜抗菌活性［1］，作為一種有巨大開發(fā)潛力的醫(yī)用抗菌材料而受到了廣泛關(guān)注［2］。

殼聚糖的抗菌活性主要受其分子質(zhì)量（聚合度）與脫乙?；潭龋―DA）的影響［3-4］。關(guān)于蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、腸道沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的研究表明，低分子質(zhì)量的殼聚糖具有更好的抑菌效果［4］。分子質(zhì)量為470 ku的殼聚糖對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有可觀的抑菌效果，而分子質(zhì)量為1 106 ku的殼聚糖對革蘭氏陽性菌的抑制作用明顯降低［5］。此外，有研究表明殼聚糖分子質(zhì)量介于5 ku和305 ku之間時，隨著分子質(zhì)量的增大，殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抑制效果逐漸增強，而對大腸桿菌的抑制效果卻逐漸減弱［6］。另一方面，殼聚糖的脫乙?；潭葲Q定了分子正電荷強度，進而影響其抗菌活性。研究表明殼聚糖的抗菌活性可以被N-乙?；揎楋@著抑制［6］；膜電負性降低的鼠傷寒沙門氏菌突變體對殼聚糖抗性增加，而膜電負性增加的金黃色葡萄球菌對殼聚糖敏感性增強［7-8］；膜表面帶有較多正電化學(xué)基團的金黃色葡萄球菌突變體，對脫乙酰殼聚糖抗性增加［9］。同時，電鏡和生化實驗發(fā)現(xiàn)殼聚糖在細菌表面發(fā)生堆積，導(dǎo)致細胞膜破裂和胞內(nèi)成分泄露，并最終造成細菌死亡［7，10］。這些研究都說明了殼聚糖與細菌細胞膜的相互作用可能是其發(fā)揮抗菌活性的關(guān)鍵機制。

盡管如此，殼聚糖與細菌細胞膜相互作用的分子機制尚不清楚，這主要是受限于傳統(tǒng)實驗技術(shù)的表征能力。一方面，結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法無法解析得到高分辨率的細胞膜三維結(jié)構(gòu)，這就限制了人們對細菌細胞膜結(jié)構(gòu)性質(zhì)的準(zhǔn)確認識；另一方面，細胞膜的流動性特征導(dǎo)致利用生化檢測技術(shù)難以追蹤化學(xué)分子與細胞膜的動態(tài)相互作用過程。近年來，隨著計算機硬件能力的提高以及分子模擬算法的不斷優(yōu)化［11］，分子動力學(xué)模擬技術(shù)在細胞膜的結(jié)構(gòu)功能研究中得到了廣泛應(yīng)用［12-13］。前期工作中，本課題組建立了基于分子動力學(xué)模擬技術(shù)的藥物-細胞膜互作研究平臺，系統(tǒng)闡明了脂肽類分子的抗菌活性機制［14-15］、耐藥機制［16］和腎毒性機制［17］，并指導(dǎo)設(shè)計出一系列具有臨床應(yīng)用前景的新型抗菌藥物［18-19］。本文搭建了不同聚合度的殼聚糖（八聚糖（chitosan-8）、十二聚糖（chitosan-12）和十六聚糖（chitosan-16）） 與革蘭氏陰性菌外膜（outer membrane， OM） 和革蘭氏陽性菌質(zhì)膜（cytoplasmic membrane，CM）相互作用的全原子分子模擬體系，探究了殼聚糖與不同細胞膜系統(tǒng)相互作用的動態(tài)識別、結(jié)合與膜插入過程，并比較分析了殼聚糖對OM 和CM 結(jié)構(gòu)性質(zhì)的差異化影響，為進一步理解殼聚糖的抗菌活性機制提供了新的視角。

1 材料與方法

1.1 體系構(gòu)建

OM 和CM 的結(jié)構(gòu)模型均使用CHARMM-GUI Membrane Builder 模塊搭建。OM 模型內(nèi)小葉由102 個1-棕櫚?；?2-油?；字Ｒ掖及狈肿樱≒OPE）和34 個1-棕櫚酰基-2-油?；字８视头肿樱≒OPG）構(gòu)成，外小葉由43個脂質(zhì)A（lipid A）分子構(gòu)成；CM 模型內(nèi)外小葉均由102 個POPE 和34個POPG構(gòu)成［20］。OM和CM初始厚度分別約為4.18 nm 和4.30 nm，膜平面與z 軸垂直。模擬體系使用TIP3P水模型進行溶劑化［21］，并添加0.1 mol/L NaCl 進行電性中和；此外，OM 體系額外加入0.1 mol/L CaCl2以模擬真實環(huán)境并維持細菌外膜系統(tǒng)的穩(wěn)定。模擬體系初始大小約為9.02 nm×9.02 nm×13.43 nm。利用CHARMM-GUI Glycan Builder工具構(gòu)建100%脫乙酰并質(zhì)子化的三種聚合度的殼聚糖分子模型，分別為chitosan-8、chitosan-12和chitosan-16 （圖1a）， 并使用gmx insertmolecules 工具，通過替換水分子將殼聚糖分子分別置于膜結(jié)構(gòu)的上方，每種聚合度分別插入3個分子（編號為a、b、c），同時刪除相應(yīng)數(shù)目的鹽離子保持體系電中性，依據(jù)殼聚糖分子的聚合度將體系命名為Chitosan-8、Chitosan-12 和Chitosan-16。不加入任何殼聚糖分子的模擬體系作為對照組，并用Chitosan-0 表示。此外，按上述同樣的方法構(gòu)建25%、50%脫乙酰并質(zhì)子化的和100%脫乙酰非質(zhì)子化的殼八聚糖分子模型，并將其置入到OM 和CM 體系中，作為補充體系。OM 體系包含約100 400 個原子，CM 體系包含約101 700 個原子。拓撲參數(shù)均來自CHARMM36全原子力場［22］。

1.2 模擬參數(shù)

分子動力學(xué)模擬使用GROMACS 5.1.2 軟件包計算［23］，采用最陡下降法對體系進行能量優(yōu)化［24］。通過逐漸減小脂質(zhì)分子重原子的位置局限，進行了6次連續(xù)的體系平衡計算模擬。在平衡過程中，通過Berendsen 溫度耦合算法將模擬體系溫度維持在313 K，使用Berendsen 和半各項異性耦合算法控制壓力維持在1個大氣壓［25］。平衡完成后，對每組模擬體系進行200 ns的模擬，模擬采用蛙跳算法［26］（leapfrog algorithm），積分步長設(shè)為2 fs，長程靜電相互作用采用PME算法［27］處理，短程鄰近列表截斷和短程庫倫截斷半徑設(shè)定為1.2 nm，使用Nose-Hoover 算法和Parrinello-Rhaman 半各向異性耦合算法控制體系的溫度和壓力為313 K 和1 個大氣壓［28-30］，溫度和壓力耦合的時間常數(shù)分別為1 ps和5 ps，計算范德華作用的截斷半徑為1.2 nm。通過LINCS［31］算法約束殼聚糖和脂質(zhì)分子的鍵長。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用gmx trjconv 工具，以10 ns 為間隔捕捉軌跡并輸出為pdb 文件，使用PyMOL 軟件實現(xiàn)結(jié)構(gòu)可視化。使用gmx make_ndx 工具對殼聚糖的不同官能團進行分組，包括還原端1 位碳連接的羥基C1-OH、2位碳連接的質(zhì)子化氨基C2-NH3+、3位碳連接的羥基C3-OH、糖苷鍵、非還原端4位碳連接的羥基C4-OH、連接5 位碳與1 位碳的氧原子C5-O、6 位碳連接的羥基C6-OH（圖1a）。使用gmx hbond工具計算不同官能團與膜組分的氫鍵數(shù)目，使用gmx mindist 計算殼聚糖不同官能團與膜組分的接觸次數(shù)。使用gmx density 工具計算體系各組分沿z軸的質(zhì)量密度分布。使用gmx order 工具計算膜外小葉脂質(zhì)分子脂肪酸鏈各碳原子的序參數(shù)。使用gmx rdf工具，在OM體系中以lipid A的1位磷原子為參考點，計算Ca2+、Na+、Cl-的徑向分布函數(shù)；在CM 體系中以POPG 的磷原子為參考點，計算Na+、Cl-的徑向分布函數(shù)。使用gmx energy工具計算模擬盒子的邊長，平方運算后求得膜表面積，用以計算單分子脂質(zhì)面積。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖與革蘭氏陰性菌OM和革蘭氏陽性菌CM動態(tài)結(jié)合分析

經(jīng)過200 ns的全原子分子動力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)不同聚合度的殼聚糖分子均能完全結(jié)合到革蘭氏陰性菌OM和革蘭氏陽性菌CM的極性區(qū)域并維持到模擬結(jié)束，但結(jié)合的動態(tài)過程呈現(xiàn)出不同的特征（圖1b）。在OM 模擬體系中，chitosan-8 分子在經(jīng)過40 ns 模擬后實現(xiàn)與OM 極性區(qū)域的完全結(jié)合，而chitosan-12 和chitosan-16 分子分別經(jīng)過50 ns 和130 ns模擬后實現(xiàn)與OM極性區(qū)域的完全結(jié)合。在CM 模擬體系中，chitosan-8 分子在經(jīng)過10 ns 的模擬后實現(xiàn)與CM極性區(qū)域的完全結(jié)合，而chitosan-12和chitosan-16 分子經(jīng)過60 ns 的模擬后實現(xiàn)與CM極性區(qū)域的完全結(jié)合。由此可見，殼聚糖鏈長是影響其與細胞膜結(jié)合效率的關(guān)鍵因素。

Fig. 1 Snapshots of the interaction between chitosan and bacterial membranes

為了進一步理解殼聚糖與OM和CM相互作用的細節(jié)，本文計算了殼聚糖分子中不同官能團與膜脂質(zhì)形成的接觸數(shù)（圖2a）和氫鍵數(shù)（圖2b）。在OM體系中，-NH3+貢獻的接觸數(shù)在chitosan-8、-12和-16 體系中分別為1 507、2 000 和2 042，占總接觸數(shù)的41%、41%和43%，平均形成氫鍵1.6 個，C3-OH貢獻的接觸數(shù)分別為689、847和825，占總接觸數(shù)的19%、17%和18%，平均形成氫鍵0.5個，C6-OH貢獻的接觸數(shù)分別為739、1 013和970，占總接觸數(shù)的20%、21%和21%，平均形成氫鍵0.6個。殼聚糖分子中的其他基團，包括還原端C1-OH、非還原端C4-OH 和糖苷鍵，貢獻的接觸數(shù)占比總數(shù)2%到7%。在CM體系中，-NH3+與CM貢獻的接觸數(shù)在chitosan-8、-12 和-16 體系中分別為1 781、2 567和3 138，占總接觸數(shù)的43%、45%和45%，平均形成氫鍵1.9 個，C3-OH 貢獻的接觸數(shù)分別為771、1 083和1 274，占總接觸數(shù)的19%、18%和18%，平均形成氫鍵0.5 個，C6-OH 貢獻的接觸數(shù)分別為810、1 082 和1 368，占總接觸數(shù)的20%、19%和20%，平均形成氫鍵0.75個。殼聚糖分子中的其他基團，貢獻的接觸數(shù)占比總數(shù)2%到6%。上述結(jié)果證明了-NH3+主導(dǎo)了殼聚糖與細菌細胞膜的相互結(jié)合，而C6-OH 與C3-OH 也發(fā)揮了一定程度的輔助作用。

此外，為了進一步驗證本文觀點，搭建25%、50%脫乙酰質(zhì)子化和100%脫乙酰非質(zhì)子化的殼八聚糖與OM和CM的全原子模擬體系并計算殼八聚糖與膜形成的氫鍵數(shù)目（圖S1），結(jié)果顯示，25%、50%和100%脫乙酰質(zhì)子化殼八聚糖與膜形成的氫鍵數(shù)目分別為（17±4）、（24±4）和（30±5），這說明殼聚糖和膜相互作用強度與氨基質(zhì)子化程度呈正相關(guān)。而非質(zhì)子化殼八聚糖盡管脫乙酰度為100%，但其與膜形成的氫鍵數(shù)卻不足5，約為對應(yīng)質(zhì)子化殼八聚糖的1/6。這些結(jié)果都說明了-NH3+在介導(dǎo)與膜的結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用。

2.2 殼聚糖插入革蘭氏陰性菌OM和革蘭氏陽性菌CM的動力學(xué)分析

殼聚糖結(jié)合到膜表面后，發(fā)現(xiàn)其末端糖基單元（還原端或非還原端）部分插入到OM 和CM 中（圖3、4）。為探究殼聚糖末端糖基插入膜的穩(wěn)定性，本文分析了膜脂質(zhì)磷原子與殼聚糖末端糖基單元原子的運動軌跡（圖S2，S3）。結(jié)果顯示，在OM 體系中，3 個chitosan-8 分子中的1 個還原末端糖基和2 個非還原末端糖基均能穩(wěn)定地插入OM中，持續(xù)的模擬時長分別為50、100 和120 ns，3個chitosan-12分子中1個還原末端糖基穩(wěn)定地插入OM，持續(xù)時長約為180 ns；3個chitosan-16分子中的2 個非還原末端糖基穩(wěn)定插入OM，持續(xù)時長分別為50 和100 ns（圖S2）。在CM 體系中，雖然同樣觀察到殼聚糖分子插入膜內(nèi)部的現(xiàn)象，但持續(xù)時間均不超過20 ns（圖S3）。上述結(jié)果表明殼聚糖末端糖基傾向于穩(wěn)定地插入到OM內(nèi)部區(qū)域，而難以穩(wěn)定地插入CM內(nèi)部區(qū)域。

Fig. 3 Chitosan inserts into the outer membrane

Fig. 4 Chitosan inserts into the cytoplasmic membrane

進一步分析殼聚糖末端糖基在插入前后與膜脂質(zhì)形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)（圖3、4），發(fā)現(xiàn)殼聚糖末端糖基與脂質(zhì)的脂肪酸鏈羰基形成氫鍵是膜插入的共性特征。在OM 體系中，chitosan-8 非還原末端糖基插入OM前（t=50 ns）僅與膜表面的磷酸基團形成氫鍵，插入后（t=200 ns），其C4-OH 和-NH3+與lipid A 脂肪酸鏈的羰基分別形成1 個氫鍵。chitosan-12 還原末端糖基插入OM 前（t=10 ns）與膜表面的磷酸基團形成3個氫鍵，與lipid A脂肪酸鏈的羰基形成1 個氫鍵，插入后（t=200 ns），其C1-OH、-NH3+和C6-OH 與lipid A 脂肪酸鏈的羰基形成3 個氫鍵。chitosan-16 非還原端糖基插入OM前（t=40 ns）僅與膜表面的磷酸基團形成2 個氫鍵，插入后（t=200 ns），其-NH3+和C3-OH 與lipid A 脂肪酸鏈的羰基形成3 個氫鍵。在CM 體系中，同樣發(fā)現(xiàn)殼聚糖末端糖基在插入后主要與磷脂分子的脂肪酸鏈上的羰基形成氫鍵（圖4）。上述結(jié)果表明，殼聚糖末端糖基與脂質(zhì)的脂肪酸鏈羰基形成的氫鍵作用可能是誘導(dǎo)其插入膜內(nèi)部的關(guān)鍵因素。

2.3 殼聚糖對細菌細胞膜結(jié)構(gòu)的影響

為進一步探究殼聚糖對細菌細胞膜結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，分析各模擬體系的質(zhì)量密度分布（mass density distribution，Density）、離子徑向分布函數(shù)（radial distribution function，RDF）、脂質(zhì)單分子面積（area per lipids，APL）和脂質(zhì)分子脂肪酸鏈序參數(shù)（order parameters，Scd）。結(jié)果顯示殼聚糖未對體系中各組分的密度分布和脂質(zhì)分子脂肪酸鏈序參數(shù)產(chǎn)生明顯影響（圖S4，S5），但卻改變了模擬體系中的離子分布和脂質(zhì)單分子面積（圖5）。這說明殼聚糖結(jié)合主要影響了膜脂質(zhì)分子間的相互作用。

殼聚糖使OM 和CM 極性區(qū)的Na+和Ca2+數(shù)目明顯減少（圖5a）。在OM 對照體系中，Ca2+在距離lipid A 的1 位磷原子0.3 至0.7 nm 的范圍內(nèi)大量聚集，RDF峰值為60；而chitosan-8/12體系的RDF峰值減少到20 以下，與對照組相比下降約67%；chitosan-16 的RDF 峰值減少到10 以下，與對照組相比下降約83%。在OM 對照體系中，Na+集中分布于距離lipid A 的1 位磷原子0.3~1.0 nm 的范圍內(nèi)，RDF 峰值為4；而chitosan-8 體系的RDF 峰值降低為3，與對照組相比下降約25%；chitosan-12/16體系的RDF 峰值降低為2，與對照組相比下降約50%。Cl-的分布趨勢則與Ca2+和Na+相反，在距離P原子0.5 nm范圍內(nèi)幾乎沒有Cl-分布，當(dāng)r>0.5 nm，RDF 值由0 逐漸增大，對照組chitosan-0 體系r=4 nm 時達到峰值；隨著殼聚糖分子質(zhì)量增加，Cl-徑向分布的峰值點距 P 原子越近，最為明顯的是，chitosan-16 體系的峰值點為r=1.2 nm，與對照組相比縮短2.8 nm。CM 體系中Na+與Cl-的徑向分布趨勢整體與OM體系類似，但受殼聚糖結(jié)合的影響更加顯著。上述結(jié)果表明，殼聚糖分子改變了膜周圍的離子分布微環(huán)境，這可能會進一步破壞陽離子介導(dǎo)的脂質(zhì)間相互作用，從而削弱細菌膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

此外，殼聚糖結(jié)合稍微降低了OM和CM的脂質(zhì)單分子面積（圖5b）。在OM 體系中，對照組chitosan-0 體系的lipid A 脂質(zhì)單分子面積集中于1.67 nm2，隨著殼聚糖聚合度增大，APL 呈降低趨勢，其中chitosan-16 體系A(chǔ)PL 值最小，集中于1.64 nm2。在CM體系中，對照組chitosan-0體系的脂質(zhì)單分子面積集中于0.60 nm2，chitosan-8 和chitosan-12體系A(chǔ)PL值集中于0.585 nm2，chitosan-16體系A(chǔ)PL值集中于0.59 nm2。這些結(jié)果表明殼聚糖結(jié)合改變了膜脂質(zhì)的徑向排布，從而影響膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

Fig. 5 Effects of chitosan binding on the structural properties of bacterial membranes

3 討論

近年來殼聚糖作為一種新型的抗菌生物材料，得到了越來越多的關(guān)注和研究，然而，其抗菌活性的分子機制仍不清楚。闡明殼聚糖與細菌細胞膜相互作用的分子機制是破解殼聚糖抗菌機理的關(guān)鍵。本文采用全原子分子動力學(xué)模擬研究了3種聚合度的脫乙酰殼聚糖與革蘭氏陰性菌外膜和革蘭氏陽性菌質(zhì)膜相互作用的動態(tài)過程，并系統(tǒng)地分析了其對膜體系離子分布和脂質(zhì)排列的影響。

殼聚糖與細胞膜的相互作用是其發(fā)揮抗菌活性的關(guān)鍵。研究指出，殼聚糖正電強度的降低和膜突變體菌株表面負電基團的減少均使得抗菌活性減弱，從而說明殼聚糖與膜相互作用是抗菌活性的關(guān)鍵機制［7-8，32］。Raafat 等［7］通過電鏡觀察到殼聚糖吸附到細菌細胞表面，Liu 等［10］使用凝膠滲透色譜（GPC）、傅里葉變換紅外光譜等方法研究殼聚糖與人工膜相互作用，指出其相互作用很可能是-NH3+與磷脂酰膽堿中的磷酸基團形成離子鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖主要依靠-NH3+穩(wěn)定結(jié)合到細菌細胞膜表面，并從接觸數(shù)與氫鍵數(shù)兩個角度定量表征了-NH3+在介導(dǎo)殼聚糖與膜結(jié)合過程的重要作用，與上述實驗結(jié)果相一致，同時證明了本研究中建立的殼聚糖-細菌細胞膜模擬體系的可靠性。此外，不同脫乙酰質(zhì)子化程度的殼聚糖與膜的相互作用進一步驗證了此觀點（圖S1），發(fā)現(xiàn)殼聚糖的脫乙酰質(zhì)子化程度與膜相互作用強度成正相關(guān)，而非質(zhì)子化殼聚糖盡管脫乙酰度為100%，但由于-NH2缺少正電荷而無法與膜緊密結(jié)合，使其基本不與膜相互作用。這些結(jié)果都說明了-NH3+在介導(dǎo)與膜的結(jié)合中起著主要的作用。

殼聚糖與膜結(jié)合后，相比于CM體系，殼聚糖末端糖基更容易穩(wěn)定地插入到OM內(nèi)部，并與脂質(zhì)脂肪酸鏈羰基形成氫鍵。導(dǎo)致這種差異的原因可能有以下兩方面。一方面，OM中l(wèi)ipid A分子間的穩(wěn)定排列高度依賴Ca2+介導(dǎo)的間接相互作用，一旦Ca2+被結(jié)合的殼聚糖排斥，這種交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)即被破壞［33-34］，隨后殼聚糖分子發(fā)生膜插入的現(xiàn)象（圖5a）。而CM 結(jié)構(gòu)主要依靠POPE 的-NH3+與POPG的磷酸基團形成直接的氫鍵和靜電相互作用，使得膜脂質(zhì)堆積更緊密，也降低了對離子介導(dǎo)的間接相互作用的依賴，從而抑制了殼聚糖分子的插入［20］。另一方面，OM中l(wèi)ipid A分子含有兩個負電性的磷酸基團供殼聚糖結(jié)合，而CM中每個磷脂分子只有1個磷酸基團，同時POPE頭部的-NH3+基團可能不利于殼聚糖的結(jié)合，殼聚糖與OM更強的親和能力可能促進其末端糖基單元插入到OM 的內(nèi)部［34］。值得注意的是，不同分子質(zhì)量的殼聚糖插入OM的末端糖基數(shù)目存在差異。殼聚糖的分子柔性與其分子質(zhì)量（或鏈長）具有緊密的相關(guān)性，本文的結(jié)果表明分子質(zhì)量越小的殼聚糖分子越容易緊密地結(jié)合在OM 表面（圖1b），這為后續(xù)發(fā)生末端糖基插入膜內(nèi)部提供了更多的機會（圖S2，S3），因此推測分子質(zhì)量差異帶來的分子柔性改變可能是導(dǎo)致不同分子質(zhì)量殼聚糖插入OM內(nèi)部末端糖基數(shù)目不同的主要原因。

殼聚糖對膜結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響主要涉及離子分布和脂質(zhì)排列的改變。離子分布的改變表現(xiàn)為Ca2+、Na+被排斥，Cl-被吸引，這會破壞陽離子介導(dǎo)的脂質(zhì)分子間相互作用［33-34］，從而削弱OM和CM的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，與之前研究中提出的殼聚糖引起離子穩(wěn)態(tài)受損導(dǎo)致膜破損的觀點相一致［9］。此外，Raafat等［7］發(fā)現(xiàn)殼聚糖吸附在金黃色葡萄球菌表面后，會導(dǎo)致細胞膜收縮和胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏，Liu 等［10］通過熒光探針1-N-苯基萘胺 （NPN）處理和胞內(nèi)半乳糖苷酶活性檢測實驗證實了殼聚糖破環(huán)大腸桿菌OM和金黃色葡萄球菌CM的完整性，模擬結(jié)果證明殼聚糖的結(jié)合能夠降低細胞膜的脂質(zhì)單分子面積，這可能是實驗發(fā)現(xiàn)的殼聚糖造成細菌細胞膜損傷的機制之一。

4 結(jié)論

殼聚糖與細菌細胞膜的相互作用是其發(fā)揮抗菌活性的關(guān)鍵。本研究利用全原子分子動力學(xué)模擬技術(shù)，探究殼聚糖與革蘭氏陰性菌外膜和革蘭氏陽性菌質(zhì)膜的相互作用，發(fā)現(xiàn)完全脫乙酰質(zhì)子化的殼聚糖憑借其高密度正電性，迅速緊密結(jié)合到富含負電性磷酸基團的膜表面，通過改變離子分布微環(huán)境破壞陽離子介導(dǎo)的脂質(zhì)間相互作用、改變脂質(zhì)排列，進而削弱細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這可能是殼聚糖引起細菌細胞膜損傷的關(guān)鍵機制，但其末端糖基插入膜的穩(wěn)定性卻因兩種膜分子極性及交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的不同而存在差異。這些結(jié)果為從原子水平上理解殼聚糖的抗菌機制提供了新的見解。

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