納米二氧化鋯對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞組蛋白H3修飾的影響*

趙曉旭 姚燕坊 侯巧利

（1）福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，莆田 351100；2）生態(tài)環(huán)境及其信息圖譜福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，莆田 351100；3）莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，莆田 351100；4）福州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，福州 350108）

納 米 二 氧 化 鋯 （zirconium dioxide nanoparticles，ZrO2-NPs）因其具有較高的穩(wěn)定性、光學(xué)性能和機(jī)械性能，被廣泛應(yīng)用于牙科種植、生物傳感器和癌癥治療等納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［1-3］。然而，廣泛的應(yīng)用增加了ZrO2-NPs 對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境暴露的風(fēng)險(xiǎn)。部分用于醫(yī)用導(dǎo)管、敷料、凝膠等醫(yī)藥領(lǐng)域的納米材料已被證明可以直接與皮膚、血液或淋巴系統(tǒng)等接觸并蓄積，產(chǎn)生潛在的生物學(xué)毒性［4-5］。因此，研究ZrO2-NPs的生物學(xué)毒理效應(yīng)進(jìn)而評(píng)價(jià)其安全性顯得尤為重要。

納米材料因其顆粒尺寸小而產(chǎn)生的特異毒性“納米毒性”已被廣泛認(rèn)識(shí)。納米毒性取決于多種因素，除了與材料的純度、尺寸大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)、團(tuán)聚狀態(tài)、劑量大小及所帶電荷相關(guān)外，還與暴露時(shí)間、暴露途徑以及納米材料的表面修飾、表面活性、表面吸附能力等密切相關(guān)［6］。不同于傳統(tǒng)的材料，納米材料更容易進(jìn)入人體細(xì)胞，從而在細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞各種功能損傷［7-8］。雖然不同物理化學(xué)特性的納米材料的毒性效應(yīng)存在差異，但一般情況下，納米材料粒徑越小，越容易進(jìn)入人體細(xì)胞，其潛在毒性越大［9］。研究表明，與納米二氧化鈦和納米四氧化三鐵相比，納米氧化銅具有更強(qiáng)的毒性，能夠誘導(dǎo)DNA 損傷，其中一個(gè)主要原因涉及細(xì)胞內(nèi)蓄積量的差異［10］。納米銀也能誘導(dǎo)DNA氧化損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）的形成［11］。

納米材料引起的細(xì)胞毒性也與其誘導(dǎo)的組蛋白修飾（histone modification）變化密切相關(guān)［12-14］。組蛋白修飾作為表觀遺傳學(xué)（epigenetics）的重要分支之一，其在控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要作用［15-16］。在各種組蛋白修飾中，組蛋白H3 修飾程度最高，可通過(guò)直接影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)常染色質(zhì)與異染色質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換［17］，在相關(guān)修飾酶的作用下調(diào)節(jié)基因激活和沉默的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換［16］。此外，組蛋白H3修飾參與調(diào)控DNA損傷修復(fù)［18-19］，在細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞生長(zhǎng)以及致癌作用的過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用［20］。研究表明，納米銀被細(xì)胞內(nèi)在化后，誘導(dǎo)了組蛋白H3 第10 位絲氨酸（serine 10，S10）磷酸化（p-H3S10）的持續(xù)高表達(dá)，導(dǎo)致原癌基因c-jun的表達(dá)量增高［21］。納米金暴露后，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 的H3 第4 位賴氨酸（lysine 4，K4）的二甲基化（Me2-H3K4）修飾水平顯著降低，Me2-H3K9 修飾水平則顯著升高［22］。單壁碳納米管也可以選擇性地誘導(dǎo)表觀遺傳修飾酶相關(guān)基因的上調(diào)，從而導(dǎo)致組蛋白H3 的整體脫乙?；?3］。

近年來(lái)，有關(guān)納米材料引起表觀遺傳效應(yīng)變化的研究逐年遞增。從表觀遺傳效應(yīng)角度理解納米材料誘導(dǎo)的生物毒性可以擴(kuò)寬納米毒理學(xué)研究?jī)?nèi)容，為全面評(píng)價(jià)納米材料引起的生物效應(yīng)提供新的視野，為納米材料的進(jìn)一步安全應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?；诖耍疚脑诶脠?chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、激光粒度儀、X 射線粉末衍射儀（X-rad-diffraction，XRD）等技術(shù)手段對(duì)ZrO2-NPs 進(jìn)行詳細(xì)表征的基礎(chǔ)上，以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT 為模型細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting，WB）及流式細(xì)胞技術(shù)等研究手段，探究了ZrO2-NPs 作用后的細(xì)胞生存率、細(xì)胞內(nèi)蓄積量以及組蛋白H3 修飾變化及其潛在的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HaCaT 細(xì)胞（上海傳秋生物科技有限公司）；ZrO2-NPs（平均粒徑<100 nm，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；聚偏二氟乙烯膜（0.45 μm，美國(guó)Millipore公司）；3M 濾紙（3 mm，美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（01863，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；胎牛血清（193254C，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；青鏈霉素雙抗（J170027，美國(guó)Thermo Fisher 公司）； 2.5% 胰蛋白酶溶液（1911594，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；WB 細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解液（P0013，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）； 抗 體 （AF1201、 AF1180、 AF1207、AF5614、AF5704、AF5710、A0208，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA02，北京鼎國(guó)昌盛有限公司）；WB化學(xué)發(fā)光試劑盒（TG268245，美國(guó)Thermo Fisher公司）；彗星法DNA 損傷檢測(cè)試劑盒（KGA240，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8010，日本Hitachi 公司）；激光粒度儀（WINNER803，濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司）；比表面積微孔吸附儀（ASPA2460，美國(guó)Micromeritics 公司）；X 射線粉末衍射儀（XRD-6100，日本Shimadzu 公司）；密閉式超聲破碎儀（VCX150，美國(guó)Sonics 公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（3111，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；酶標(biāo)儀（INFINITE F50，瑞士Tecan 公司）；電泳儀（EPS301，美國(guó)Thermo Fisher公司）；電泳槽（AE-6500，日本Atto 株式會(huì)社）；轉(zhuǎn)膜儀（TE77，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（AI600，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；流式細(xì)胞儀（A00-1-1102，美國(guó)Beckman Coulter 公司）；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（7800，美國(guó)Agilent Technologies 公司）；生物投射電鏡（HT7800，日本Hitachi 公司）；倒置熒光顯微鏡（DMi8，德國(guó)Leica公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)基

向DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（10% DMEM）或0.5%胎牛血清（0.5% DMEM）及1%青鏈霉素雙抗，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2樣品前處理

實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，稱取適量的ZrO2-NPs，用0.5%DMEM 培養(yǎng)基配制成10~50 g/L 的懸濁液。為使ZrO2-NPs 分散，使用密閉式超聲破碎儀在60 W 功率下超聲1 min。另外，用于X 射線粉末衍射及比表面積微孔表征的ZrO2-NPs及其懸濁液在測(cè)試前，經(jīng)-50℃、24 h 真空冷凍干燥處理后置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3納米材料表征

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡表征：將適量待測(cè)樣品均勻涂抹或滴加于導(dǎo)電膠上，噴金150 s 后上機(jī)測(cè)試。測(cè)試參數(shù)為掃描加速電壓10~13 kV，加速電流10 μA，顯示分辨率70~110 K。

動(dòng)態(tài)光散射表征：ZrO2-NPs 的流體動(dòng)力學(xué)粒徑（二次粒徑） 及其分布采用動(dòng)態(tài)光散射法（dynamic light scattering，DLS）表征。測(cè)試參數(shù)為折射角度90°，分散介質(zhì)折射率1.333，介質(zhì)黏度0.000 890 4 Pa·s，粒度測(cè)試范圍為1~10 000 nm，設(shè)備延遲單位時(shí)間10 μs。

X射線粉末衍射表征：取適量經(jīng)干燥處理后的待測(cè)樣品置于樣品槽，用玻璃板壓片壓平待測(cè)樣品，隨后測(cè)試。測(cè)試參數(shù)為儀器銅靶輻射源CuKα（λ=1.540 56 ?），掃描速度為2°/min，掃描角度為4°~90°。

比表面積微孔表征：比表面積微孔表征采用氮?dú)馕?脫附（Brunauer-Emmett-Teller，BET）表征方法。分別稱取0.1~0.2 g 經(jīng)干燥處理后的待測(cè)樣品置于BET 試管底部，隨后使用真空干燥脫氣儀在200℃條件下對(duì)待測(cè)樣品脫氣2 h。在相對(duì)壓力P/P0為0.99 及-195.85℃條件下獲得氮?dú)馕?脫附等溫曲線。P/P0在0.05~0.35之間線性擬合。

1.5 傳代細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代后，接種于含10% DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基的100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2及飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁面積達(dá)到70%~90%之間時(shí)傳代1次。

1.6 供試細(xì)胞準(zhǔn)備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT 細(xì)胞，接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁面積達(dá)到70%~90%之間時(shí)，用0.5% DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2 次后，細(xì)胞在0.5% DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.7 樣品暴露

細(xì)胞在0.5% DMEM中培養(yǎng)24 h后，棄掉舊培養(yǎng)基，加入含樣品的新鮮0.5% DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，使樣品最終濃度為0.1~1 000 mg/L后，置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)0.5~72 h。每批次實(shí)驗(yàn)對(duì)照組以未加入樣品的細(xì)胞為空白對(duì)照，每個(gè)濃度單次實(shí)驗(yàn)中設(shè)置3個(gè)重復(fù)，各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞生存率檢測(cè)

至暴露時(shí)間點(diǎn)，棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 沖洗細(xì)胞2 次，0.25%胰蛋白酶溶液消化并收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染色液按1∶1 吹打混勻后移至血球計(jì)數(shù)板。使用倒置顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞數(shù)量，并記錄數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印記法

至暴露時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞刮刀剝離細(xì)胞并移至離心管，PBS沖洗2次后棄上清液。隨后向樣品中添加適量WB 細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解液，超聲破碎1 min 后于4℃靜置2 h。樣品蛋白質(zhì)提取后參照BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將定量過(guò)的蛋白質(zhì)樣品與蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液按1∶1 比例充分混合。樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、染色、脫色、封閉后，在4℃下一抗孵育12 h。隨后，室溫下二抗孵育2 h后上機(jī)檢測(cè)。選取不受外界刺激影響的H3含量作為內(nèi)參，蛋白質(zhì)條帶的影像采用Photoshop 2020軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.10 觀察納米二氧化鋯的細(xì)胞內(nèi)分布

利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察細(xì)胞內(nèi)ZrO2-NPs的分布情況。不同劑量梯度的ZrO2-NPs（0~1 g/L）暴露1 h后，細(xì)胞刮刀剝離細(xì)胞并移至離心管，PBS沖洗2次后棄上清液。沿管壁緩慢加入4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液后于4℃靜置24 h。樣品經(jīng)鋨酸固定、脫水、滲透、包埋、超薄切片、雙染色后上機(jī)觀察。

1.11 納米二氧化鋯的細(xì)胞內(nèi)蓄積量檢測(cè)

利用流式細(xì)胞儀側(cè)向角（side scattered light，SS）的變化研究細(xì)胞內(nèi)納米材料的蓄積量［21］。細(xì)胞攝入納米材料顆粒后，細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞粒度改變，引起SS 增加。至暴露時(shí)間點(diǎn)，棄培養(yǎng)基，PBS 沖洗細(xì)胞2 次，0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移至新的流式管，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組數(shù)據(jù)檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，每組樣品檢測(cè)3次，采用FlowJo 10.7.1軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)ZrO2-NPs 的蓄積量。不同劑量梯度的ZrO2-NPs（0~1 g/L）暴露1 h 后，棄培養(yǎng)基，PBS 沖洗細(xì)胞2 次，0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)。將1×105個(gè)細(xì)胞移至新的15 ml離心管，隨后加入3 ml 65%硝酸及2 ml氫氟酸，室溫下震蕩24 h后，移至聚四氟乙烯管中180℃除酸2 h，隨后用2%硝酸定容至50 ml 上機(jī)測(cè)試。

1.12 彗星實(shí)驗(yàn)

不同劑量梯度的ZrO2-NPs（0~0.1 g/L）暴露1 h后，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗細(xì)胞2次，0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液后，參照彗星法DNA 損傷檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。樣品經(jīng)裂解、DNA堿解旋、電泳、染色后上機(jī)觀察。

2 結(jié)果

2.1 ZrO2-NPs表征

圖1a 為ZrO2-NPs 及經(jīng)0.5% DMEM 分散處理的ZrO2-NPs 的SEM 圖像。與供應(yīng)商標(biāo)注信息基本一致，未分散前的ZrO2-NPs（左）呈現(xiàn)較為規(guī)則均勻的球形，單個(gè)顆粒粒徑（一次粒徑）約為100 nm，顆粒之間界線分明，呈分散堆疊、松散聚集狀態(tài)，表明顆粒之間黏性較低。經(jīng)0.5% DMEM分散處理后的ZrO2-NPs（右）呈現(xiàn)不規(guī)則球形，顆粒之間界線模糊，顆粒之間黏性顯著升高，出現(xiàn)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象，其粒徑（二次粒徑）介于100~500 nm 之間。為了進(jìn)一步評(píng)估ZrO2-NPs 在0.5%DMEM 中的分散情況，進(jìn)行DLS 測(cè)試分析。經(jīng)0.5% DMEM 分散處理后，ZrO2-NPs 的分散指數(shù)（PI）為0.280 6，粒徑分布較為集中，液相分布較為均勻，其粒徑分布集中在200~400 nm 之間。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出ZrO2-NPs 的DLS 平均粒徑（二次粒徑）為332.49 nm，與一次粒徑（<100 nm）相比，由于團(tuán)聚其二次粒徑增大約3 倍（圖1b）。另外，由圖1c可知，兩種樣品的吸附-脫附等溫曲線均為IV 型，在相同壓力下，ZrO2-NPs 的吸附量大于經(jīng)0.5% DMEM分散處理后的ZrO2-NPs，其BET比表面積分別為（32.399 7±0.132 6）m2/g 及（16.290 6±0.161 0）m2/g。表明ZrO2-NPs堆積松散，其孔間隙更大，而經(jīng)分散處理后的ZrO2-NPs 則由于聚集程度高，其孔間隙更小。XRD 分析結(jié)果表明，ZrO2-NPs的晶型為單斜晶（monoclinic），粉末衍射文件（powder diffraction file，PDF）卡片號(hào)為86-1449，且無(wú)論分散（團(tuán)聚）與否其晶型特征無(wú)明顯變化，均能保持良好的晶型結(jié)構(gòu)（圖1d）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)0.5% DMEM 分散處理后，由于團(tuán)聚ZrO2-NPs的比表面積減小、粒徑增大。

Fig. 1 Physicochemical properties of ZrO2-NPs in dispersion medium

2.2 ZrO2-NPs暴露后細(xì)胞生存率的變化

為了確定ZrO2-NPs 對(duì)HaCaT 細(xì)胞生存率的影響，利用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定ZrO2-NPs 暴露后的細(xì)胞生存率（圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量梯度的ZrO2-NPs（0~1 g/L）暴露24 h 后，HaCaT 細(xì)胞生存率略有下降，但不明顯。實(shí)驗(yàn)最大劑量（1 g/L）作用24 h后，HaCaT細(xì)胞生存率僅下降約10%，與對(duì)照組生存率（92%）基本一致（圖2a）。另外，觀察較低劑量的ZrO2-NPs 長(zhǎng)時(shí)間暴露對(duì)HaCaT 細(xì)胞生存率的影響。不同時(shí)間梯度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.1 g/L ZrO2-NPs 長(zhǎng)時(shí)間暴露后，HaCaT 細(xì)胞的生存率無(wú)明顯變化，但在暴露36 h 后出現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2b）。細(xì)胞一旦大量死亡將導(dǎo)致組蛋白修飾不能被有效檢測(cè)，因此選擇36 h作為最大暴露時(shí)間進(jìn)行之后的實(shí)驗(yàn)。

Fig. 2 Cell viability after exposure to ZrO2-NPs

2.3 ZrO2-NPs對(duì)組蛋白H3修飾的影響

為了確定ZrO2-NPs對(duì)組蛋白H3常見(jiàn)修飾位點(diǎn)的影響，利用蛋白質(zhì)免疫印跡法觀察ZrO2-NPs 暴露后HaCaT 細(xì)胞的p-H3S10、組蛋白H3 第9 位賴氨酸（lysine 9，K9） 的乙?；ˋc-H3K9）、Ac-H3K14、組蛋白H3 第4 位賴氨酸的三甲基化（Me3-H3K4） 及Me3-H3K27 修飾水平變化（圖3）。不同劑量ZrO2-NPs（0~1 g/L）暴露1 h 后，p-H3S10修飾水平隨著暴露劑量的升高而升高，顯示出較為明顯的劑量依賴性（圖3a）。與p-H3S10的結(jié)果相似，Ac-H3K9、Ac-H3K14、Me3-H3K4及Me3-H3K27 修飾水平也隨著暴露劑量的升高而升高。另一方面，低劑量0.1 g/L ZrO2-NPs 長(zhǎng)時(shí)間（~36 h）暴露的結(jié)果表明（圖3b），ZrO2-NPs 暴露后誘導(dǎo)了p-H3S10 修飾水平的升高并持續(xù)長(zhǎng)達(dá)24 h。同樣的，隨著暴露時(shí)間的增加，觀察到Ac-H3K9、Ac-H3K14 及Me3-H3K4 修飾水平明顯上調(diào)。另外，0.1 g/L ZrO2-NPs 暴露后Me3-H3K27修飾水平上調(diào)只持續(xù)了2 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZrO2-NPs 暴露后短時(shí)間內(nèi)（1 h）即引起了p-H3S10、Ac-H3K9、Ac-H3K14 及Me3-H3K4 的高表達(dá)，并持續(xù)長(zhǎng)達(dá)24 h。另外，Me3-H3K27 修飾的上調(diào)在ZrO2-NPs暴露2 h后出現(xiàn)下降。

Fig. 3 Histone H3 modification after exposure to ZrO2-NPs

2.4 細(xì)胞內(nèi)ZrO2-NPs的分布及其蓄積量

不同于傳統(tǒng)材料，納米材料更容易進(jìn)入細(xì)胞，從而在細(xì)胞內(nèi)引起各種功能損傷［24-25］。為了探究ZrO2-NPs對(duì)組蛋白H3修飾影響的機(jī)制，觀察ZrO2-NPs 細(xì)胞內(nèi)的分布情況（圖4a）。隨著ZrO2-NPs 暴露劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)ZrO2-NPs 顆粒成簇分布于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器（如線粒體）中，但并未觀察到顆粒進(jìn)入細(xì)胞核的現(xiàn)象。另外，利用流式細(xì)胞儀的側(cè)向散射光SS 分析檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ZrO2-NPs 的蓄積量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZrO2-NPs（0~1 g/L）暴露1 h后，SS 強(qiáng)度以劑量依賴的方式增加（圖4b）。而SS強(qiáng)度并未隨著1 g/L ZrO2-NPs暴露時(shí)間的增加而增強(qiáng)，各暴露時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果與1 h 時(shí)基本一致（圖4c）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)ZrO2-NPs 的蓄積量，使用ICP-MS 定量細(xì)胞內(nèi)總鋯的含量。與流式細(xì)胞儀的結(jié)果一致，隨著ZrO2-NPs 暴露劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)總鋯的含量隨之增加，顯示了顯著的劑量依賴性（圖4d）。

Fig. 4 Intracellular distribution and accumulation after exposure to ZrO2-NPs

為了進(jìn)一步確定細(xì)胞內(nèi)ZrO2-NPs 的蓄積量與組蛋白修飾之間的關(guān)系，使用Photoshop 2020軟件定量圖3a 中所示的p-H3S10、Ac-H3K9 及Me3-H3K4 條帶，并計(jì)算了SS 和各組蛋白H3 修飾強(qiáng)度的平均值。隨著ZrO2-NPs 的暴露劑量的增加，ZrO2-NPs 的蓄積量（SS 強(qiáng)度） 和p-H3S10、Ac-H3K9 及Me3-H3K4 的強(qiáng)度平行增加（圖5）。各自的相關(guān)系數(shù)為R2=0.818 63、R2=0.881 28 及R2=0.584 59。

2.5 ZrO2-NPs誘導(dǎo)DNA損傷形成

為了確定進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的ZrO2-NPs 是否引起DNA 損傷，使用圖3 相同樣本觀察ZrO2-NPs 暴露后DNA 損傷標(biāo)志物組蛋白H2AX 第139 位絲氨酸的磷酸化（γ-H2AX）修飾水平。不同劑量ZrO2-NPs（0~1 g/L）暴露1 h后，γ-H2AX修飾水平隨著暴露劑量的升高而升高，顯示出明顯的劑量依賴性（圖6a）。0.1 g/L ZrO2-NPs 長(zhǎng)時(shí)間（~36 h）暴露后誘導(dǎo)了γ-H2AX 修飾水平的升高并持續(xù)長(zhǎng)達(dá)36 h（圖6b）。另外，使用彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了ZrO2-NPs誘導(dǎo)的DNA損傷（圖6c）。

Fig. 5 Correlation between intracellular accumulation of ZrO2-NPs and histone H3 modification

Fig. 6 γ-H2AX modification after exposure to ZrO2-NPs

為了進(jìn)一步確定細(xì)胞內(nèi)ZrO2-NPs 的蓄積量與DNA 損傷以及DNA 損傷與組蛋白H3 修飾之間的關(guān)系，繪制DNA 損傷（γ-H2AX） 與SS 強(qiáng)度、DNA 損傷與p-H3S10、Ac-H3K9、Me3-H3K4 相關(guān)性的散點(diǎn)圖（圖7）。ZrO2-NPs 的細(xì)胞內(nèi)蓄積量與其誘導(dǎo)的DNA損傷呈線性相關(guān)（R2=0.680 99）。另外，DNA損傷與p-H3S10、Ac-H3K9及Me3-H3K4的強(qiáng)度平行增加，各自的相關(guān)系數(shù)為R2=0.726 29、R2=0.912 69和R2=0.599 81。

Fig. 7 Correlation between DNA damage and intracellular accumulation，and between DNA damage and histone H3 modification

3 討論

納米材料可以通過(guò)內(nèi)吞作用或自由擴(kuò)散等不同途徑被細(xì)胞蓄積［26］。本文觀察到將ZrO2-NPs 分散在0.5% DMEM 中后，明顯出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象（圖1）。DMEM 培養(yǎng)基中帶正電荷的離子較多，呈負(fù)電性的納米顆粒分散后，因顆粒間的靜電斥力的減弱及顆粒間穩(wěn)態(tài)的失衡，導(dǎo)致顆粒在分散介質(zhì)中產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象。此外，含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基會(huì)在納米顆粒表面覆蓋一層“蛋白冠”［27］。蛋白冠的形成可能進(jìn)一步促進(jìn)納米顆粒相互吸引，并能在液相中維持穩(wěn)定。一般而言，納米顆粒的尺寸越小越容易進(jìn)入細(xì)胞［28］。納米顆粒在分散介質(zhì)中的團(tuán)聚明顯會(huì)影響其進(jìn)入細(xì)胞的能力。然而，也有報(bào)道指出“蛋白冠”的形成會(huì)為納米顆粒表面提供新的生物結(jié)合位點(diǎn)。在生物系統(tǒng)內(nèi)，納米顆粒表面吸附的組分可為免疫系統(tǒng)提供特異性，從而使納米顆粒順利進(jìn)入細(xì)胞［29］。多項(xiàng)研究證實(shí)，納米顆粒誘導(dǎo)的組蛋白H3修飾及DNA損傷與其細(xì)胞內(nèi)蓄積量高度相關(guān)［30-32］。這與本文觀察到的結(jié)果一致，隨著ZrO2-NPs 暴露劑量的增加，ZrO2-NPs 的細(xì)胞內(nèi)蓄積量及其誘導(dǎo)的組蛋白H3修飾及γ-H2AX顯著增加（圖3a，4a，6a），進(jìn)一步分析表明，ZrO2-NPs 的細(xì)胞內(nèi)蓄積量與組蛋白H3 修飾及γ-H2AX 形成高度相關(guān)（圖5、7a），間接證明了ZrO2-NPs 的細(xì)胞內(nèi)蓄積是引起組蛋白修飾的關(guān)鍵因素之一。另外，ZrO2-NPs 顆粒未能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，其暴露可能是引起了組蛋白H3 修飾相關(guān)信號(hào)通路的變化，進(jìn)而間接的導(dǎo)致組蛋白H3修飾變化（圖4a）。

組蛋白修飾在控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要作用［15-17］。p-H3S10是有絲分裂起始的關(guān)鍵事件常被用作判斷細(xì)胞是否處于有絲分裂的標(biāo)志物［33］。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZrO2-NPs 能誘導(dǎo)p-H3S10 的持續(xù)高表達(dá)（圖3b）。然而，p-H3S10在ZrO2-NPs 暴露后立即被誘導(dǎo)，這與有絲分裂相關(guān)的p-H3S10 存在明顯差異。p-H3S10 的高表達(dá)也是誘導(dǎo)原癌基因表達(dá)的關(guān)鍵因素之一［34-36］。一些致癌性金屬，如鎳、砷等能引起p-H3S10 修飾的改變，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的改變［35-36］。p-H3S10的增加會(huì)促進(jìn)Ac-H3K14 修飾水平上調(diào)［37-38］。Ac-H3K9及Ac-H3K14主要位于啟動(dòng)子區(qū)域，其高表達(dá)通常與基因激活相關(guān)［39］。在相同暴露時(shí)間點(diǎn)下觀察到p-H3S10 與Ac-H3K9 及Ac-H3K14 存在協(xié)同作用（圖3b）。另一方面，Me3-H3K4 與組蛋白H3 的乙?；g也存在協(xié)同作用［40］，而Me3-H3K27是異染色質(zhì)區(qū)域的主要標(biāo)志，其高表達(dá)常常被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄抑制的關(guān)鍵［20］，這與本文觀察到的ZrO2-NPs 誘導(dǎo)組蛋白H3 修飾變化結(jié)果高度一致。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，ZrO2-NPs誘導(dǎo)的p-H3S10與基因激活高度相關(guān)。

組蛋白修飾變化在DNA 損傷修復(fù)過(guò)程中具有重要作用［41］。DNA一旦發(fā)生損傷，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)組蛋白修飾等相關(guān)的DNA損傷修復(fù)途徑［42］。組蛋白H3乙?；瘎?chuàng)造了開(kāi)放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，為募集DNA修復(fù)蛋白提供了良好的環(huán)境［18］。DNA損傷也可以引起相關(guān)修飾酶的變化，進(jìn)而對(duì)組蛋白修飾產(chǎn)生影響。研究表明，甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1 可被迅速募集到DNA 損傷區(qū)域并引起H3K9 甲基化的迅速上調(diào)，進(jìn)而激活DNA損傷信號(hào)蛋白［43］。本文的分析結(jié)果表明，ZrO2-NPs 引起的DNA 損傷（γ-H2AX）與其誘導(dǎo)的組蛋白H3 修飾變化強(qiáng)度呈線性相關(guān)（圖7b-d）。這些結(jié)果間接證明了ZrO2-NPs 引起的DNA 損傷是其誘導(dǎo)組蛋白H3 修飾變化的原因之一。另外，發(fā)現(xiàn)ZrO2-NPs 暴露后Me3-H3K27 修飾水平上調(diào)只持續(xù)了2 h（圖3b），尚不清楚原因，這將是今后工作的重點(diǎn)之一。

組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域重要的研究?jī)?nèi)容之一，參與染色質(zhì)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的維持和調(diào)節(jié)、基因激活及沉默、DNA 損傷修復(fù)等多種重要的生物學(xué)過(guò)程，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病和癌癥等各類(lèi)疾病有關(guān)［44-45］。對(duì)ZrO2-NPs 等金屬氧化物納米材料誘導(dǎo)組蛋白修飾的分子機(jī)制的進(jìn)一步探究，必將為推動(dòng)納米安全性評(píng)價(jià)系統(tǒng)的發(fā)展與完善，為評(píng)估金屬氧化物納米材料的生物效應(yīng)和安全性及設(shè)計(jì)應(yīng)用于各種領(lǐng)域的金屬氧化物納米材料提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

分散在DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中的ZrO2-NPs 顆粒明顯團(tuán)聚，比表面積減少，二次粒徑增大，且誘導(dǎo)了HaCaT細(xì)胞組蛋白H3常見(jiàn)修飾位點(diǎn)的變化。另外，細(xì)胞內(nèi)的蓄積是ZrO2-NPs誘導(dǎo)組蛋白H3修飾變化的關(guān)鍵因素之一，組蛋白H3 修飾的調(diào)控機(jī)制可能涉及DNA損傷修復(fù)途徑。