施加外源抗壞血酸促進馬鈴薯試管薯形成及其機制初步研究

雷春霞,葉明旺,李燦輝,龔 明*

(1 云南師范大學 生命科學學院,云南省馬鈴薯生物學重點實驗室,生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心,云南省生物質能與環(huán)境生物技術重點實驗室,昆明 650500;2 云南師范大學 馬鈴薯科學研究院,云南省馬鈴薯生物學重點實驗室,昆明 650500)

馬鈴薯富含淀粉、蛋白質和多種重要營養(yǎng)物質,是世界上最重要的糧食作物之一[1-3]。馬鈴薯的塊莖形成是一個復雜的發(fā)育過程,涉及到多重環(huán)境因素與植物激素及信號分子的互作以及這種互作對大量關鍵基因及多條信號轉導與代謝途徑的調(diào)控。這一過程包括一系列生理生化變化,如內(nèi)源激素組成、含量及其比例的明顯變化、葉片光合速率的提高、同化物輸出的加快、蔗糖和淀粉含量的增加以及匍匐莖頂端特異蛋白的出現(xiàn)等。深入了解馬鈴薯塊莖形成的分子機理可為今后通過精準分子育種手段來培育高產(chǎn)優(yōu)質的馬鈴薯品種提供借鑒和新思路[4-6]。

馬鈴薯的塊莖形成由4個連續(xù)階段組成:(1)匍匐莖的形成和生長;(2)隨后頂端區(qū)域彎曲成鉤狀;(3)亞頂端區(qū)域膨大;(4)塊莖生長[6-7]。在影響馬鈴薯結薯的因素中,光周期和溫度是最重要的環(huán)境因素,短日照(short days,SDs)和低溫誘導結薯[8-9]。此外,馬鈴薯塊莖的形成主要受其遺傳特性的控制。在相同的外部環(huán)境中,不同品種的馬鈴薯形成塊莖的能力不同[5]。馬鈴薯植株的發(fā)育階段也是決定塊莖形成的重要因素,它們必須達到一定的生理年齡才能響應誘導塊莖形成的環(huán)境信號[6,10]。塊莖的形成需要生化途徑和形態(tài)發(fā)生的精確同步,這是由特定的基因表達和各種信號分子、特異蛋白、mRNA、miRNAs、植物激素和糖的產(chǎn)生所調(diào)控的[6,10]。參與馬鈴薯塊莖形成過程的關鍵基因包括Solanumtuberosumself-prunning6A(StSP6A)、Solanumtuberosumself-prunning5G(StSP5G)、SolanumtuberosumCONSTANS(StCO)等[6]。

抗壞血酸(ascorbic acid,AsA),又稱維生素C(vitamin C,VC),是植物細胞中最豐富的一種多功能非酶抗氧化劑,具有清除多種活性氧(reactive oxygen species,ROS)的巨大潛力,能夠在非逆境和逆境條件下調(diào)節(jié)植物的一些基本功能,如蛋白質合成、細胞生長和分裂、防御化合物的產(chǎn)生、衰老、活性氧解毒等[11-13]?？箟难嵩诰€粒體中合成,然后被運輸?shù)街参锏钠渌课籟14-15]。植物細胞中AsA含量隨生長條件和發(fā)育階段而變化,其含量的變化可作為一種胞內(nèi)信號通過調(diào)節(jié)激素信號通路基因和防御基因的表達影響植物的生長發(fā)育和抗逆性[15]。AsA不僅是控制細胞氧化還原平衡的關鍵成分,還是參與植物生長發(fā)育的關鍵調(diào)控因子[16],但其是否參與馬鈴薯的塊莖形成,目前尚未見報道。

本文通過外源添加AsA處理研究了其對馬鈴薯塊莖形成的效應及對10個結薯相關基因表達的影響,并研究了敲除結薯關鍵基因StSP6A對AsA誘導馬鈴薯結薯的影響,旨在揭示AsA是否以及如何參與馬鈴薯塊莖的誘導和形成及可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料為來自國際馬鈴薯中心(International Potato Center,CIP)的2個二倍體馬鈴薯種質材料CIP-149(Solanumphureja)和CIP-178(S.ajanhuiri)及1份四倍體主栽品種合作88(C-88,S.tuberosum),均由云南師范大學馬鈴薯科學研究院保存和提供。

材料預培養(yǎng):所用試驗材料為離體培養(yǎng)條件下的馬鈴薯無菌苗,剪取供試材料組培苗的單節(jié)莖段轉接到培養(yǎng)瓶(MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂,pH=5.8)中,每個培養(yǎng)瓶接入10個單節(jié)莖段,置于(25±2) ℃、600 μmol/(m2·s)光照強度及16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng),1月齡的組培苗可用于下一步試驗研究。

1.2 外源AsA處理對馬鈴薯試管薯形成的影響

為研究AsA對馬鈴薯塊莖形成的影響,利用外源添加AsA處理二倍體材料CIP-178和CIP-149及四倍體品種C-88。將預培養(yǎng)材料的單節(jié)莖段轉接到含30 g/L蔗糖并分別添加了終濃度為0(對照,CK),1、5、10、20、50 mmol/L AsA的1/2 MS固體培養(yǎng)基上,置于誘導塊莖形成的全黑暗(18±2) ℃條件下培養(yǎng),14 d后統(tǒng)計結薯個數(shù)并計算結薯率, 結薯率的計算方法為平均每100個莖段中結薯的個數(shù),每個處理有3個重復。

1.3 不同pH值處理對CIP-149試管薯形成的影響

將含不同濃度(0、1、5、10和20 mmol/L)AsA的1/2 MS固體培養(yǎng)基離心并收集上清, 測定各個上清溶液的pH值。在1/2 MS培養(yǎng)基中加入1 mol/L的HCl,將培養(yǎng)基pH值調(diào)為上述添加了不同濃度AsA的對應pH值。

將預培養(yǎng)材料CIP-149的單節(jié)莖段轉接到上述不同pH值、含3%(W/V)蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基中,在(18±2) ℃條件下的全黑暗培養(yǎng)間培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計結薯個數(shù)并計算結薯率。

1.4 AsA處理條件下馬鈴薯塊莖形成關鍵基因的RT-qPCR分析

以預培養(yǎng)1月齡的CIP-149為材料,將剪去葉片的單節(jié)莖段轉接到分別添加了0(對照)或1 mmol/L AsA的1/2 MS培養(yǎng)基(含30 g/L蔗糖)中,在全黑暗及(18±2) ℃條件下培養(yǎng)。在5個時間點(0、3、9、12和16 d)剪取代表了馬鈴薯塊莖形成5個典型階段的樣品用于總RNA提取,分別是腋芽(0 d)、長大的腋芽或剛長出的匍匐莖(3 d)、約1 cm長的匍匐莖頂端(9 d)、約1 cm長的帶有匍匐莖的剛剛膨大的塊莖(12 d)及約1 cm長的帶有匍匐莖的生長塊莖(16 d,圖1)。

組培苗. CIP-149組培苗;0 d. 腋芽;3 d. 稍大的腋芽;9 d. 長約1 cm的匍匐莖頂端;12 d. 膨大的匍匐莖頂端;16 d. 生長中的塊莖。圖1 分別在5個時間點對馬鈴薯塊莖形成不同階段的匍匐莖/塊莖頂端取樣用于RNA提取Microplant. Tissue culture seedling of CIP-149; 0 d. Axillary bud; 3 d. Slightly larger axillary bud; 9 d. About 1 cm long stolon tip; 12 d. Swelling stolon tip; 16 d. The growing tuber.Fig.1 Tips of stolons/tubers at different stages of potato tuber formation were harvested for RNA extraction at five time points

使用Tiangen RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒(Tiangen,北京)提取總RNA,使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa,北京),將800 ng總RNA逆轉錄為cDNA第一鏈。基于本實驗室研究及相關文獻[5-6,17-18]挑選出10個馬鈴薯關鍵結薯相關基因[StSP6A、StSP5G、StCO、Solanumtuberosumcyclingdoffactor(StCDF)、SolanumtuberosumphytochromeB(StPHYB)、Solanumtuberosumsucrosetransporter4(StSUT4)、Solanumtuberosumcalcium-dependentproteinkinase1(StCDPK1)、SolanumtuberosumGA20-oxidase(StGA20ox)、SolanumtuberosumBEL5(StBEL5)和Potatohomeobox(POTH)]進行表達量測定(表1)。

表1 用于RT-qPCR分析的馬鈴薯塊莖形成相關基因信息Table 1 Information of genes related to potato tuber formation for RT-qPCR analysis

采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa,北京)在Roche Light Cycler 960(Roche Diagnostics, Basel,Switzerland)上進行RT-qPCR。反應體系為:10 μL(1 μL模板cDNA,上下游引物各0.4 μL,5 μL SYBR Green PCR Master Mix和3.2 μL ddH2O)。

采用內(nèi)參基因L2[19],對目標基因的表達量進行校正。引物由Primer3 web(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計(表2)。RT-qPCR反應程序為:95 ℃預孵育600 s,95 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,2步擴增45個循環(huán),最后一步進行60～97 ℃熔解曲線分析。在RT-qPCR分析中,有3個獨立的生物樣重復和3個技術重復。采用比較CT法(2-ΔΔCT法)對RT-qPCR數(shù)據(jù)進行量化[20]。

1.5 StSP6A純合突變體敲除載體的構建

質粒構建: 表達SpCas9的雙元載體pKESE401及中間載體pCBC-DT1T2見前文[28]。從Spud DB數(shù)據(jù)庫(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu)下載獲得馬鈴薯StSP6A基因序列(基因ID:Soltu.DM.05G026370.1)。利用靶位點在線設計工具CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)設計StSP6A的靶位點,篩選出其中2條20 nt的sgRNA(sigle guide RNA)序列,構建的敲除載體引物分別為DT1F,TCGAAGTAGTGATTGGGTTGCATAACAA-CTTGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和DT2R,TTCTAGCTCTAAAACTTCACTAGGTCTGTTGAT-CTCAATCTCTTAGTCGACTCTAC。

DT1F和DT2R用于擴增pCBC-DT1T2。將擴增產(chǎn)物純化后, 通過無縫克隆試劑盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit,Vazyme)連接到被BsaI酶切的pKESE401中[29]。構建的CRISPR/Cas9載體如圖2,A所示。

A. StSP6A的基因結構以及靶位點原理圖,其中2個gRNAs序列用黑線劃線,PAM用紅線劃線;B. 轉基因株系的突變模式。所有轉基因株系后面都有對突變類型的描述:i=插入,d=刪除。i和d對應的數(shù)字表示堿基對變化的數(shù)量。插入用綠色字母表示(G,A,C,T),刪除用綠色“”表示。圖2 StSP6A靶位點(A)及其突變模式(B)示意圖A. The schematic diagram of StSP6A with target sites. Two gRNAs sequences were underlined by black lines, and PAMs were marked by red lines. B. The StSP6A mutation patterns in transgenic lines. All transgenic lines are followed by a description for the mutation type: i = insertion and d = deletion. The number associated with i and d indicates the number of base pair changes. Insertion was shown in green letter(G, A, C, T), and deletion are indicated by a green “”.Fig.2 The schematic diagram of StSP6A target sites(A) and the mutation patterns(B) in transgenic lines

馬鈴薯的農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)轉化:本研究使用的材料為二倍體馬鈴薯CIP-149,農(nóng)桿菌轉化按照之前的方法[28,30],并進行如下修改:預培養(yǎng)2 d后,將外植體與攜帶有雙靶載體pKSE401的農(nóng)桿菌在含有2 mg/L NAA(α-napthaleneacetic acid, α-萘乙酸)和1 mg/L ZT(zeatin trans isomer,玉米素,Phytotechlab)的LB培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d,然后更換到含0.1 mg/L NAA+2 mg/L ZT的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上誘導2周,最后更換到0.01 mg/L NAA和1 mg/L ZT誘導再生培養(yǎng)基上進行誘導,每2周更換1次培養(yǎng)基,直至出芽。將再生苗切下,扦插至含50 mg/L卡那霉素(kanamycin sulfate)和200 mg/L特美汀(timentin,Phytotechlab)的篩選培養(yǎng)基上進行篩選。經(jīng)過2輪篩選后,提取正常生根的再生苗的DNA,用橫跨靶位點的特異性引物進行擴增。特異性引物為5′-AGGCGGCATGTCTTCTAGAG-3′和5′-TAAACCCCTCTACCCCTCCA-3′。將PCR產(chǎn)物純化后克隆到pBM16A載體(Biomed,北京)中, 轉化感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli)。從每個轉化子的DNA中選擇10個菌落在生工生物技術公司(上海)進行測序。采用Geneous 4.8.3軟件進行序列分析。

通過上述轉化過程,共獲得125株轉基因植株。對每個轉基因植株的靶位點進行測序,每株10個無性系,共得到3個StSP6A純合突變體(sp6a85、sp6a107和sp6a113)。突變類型如圖2,B所示。

1.6 外源AsA處理對StSP6A純合變體sp6a85、sp6a107和sp6a113試管薯形成的影響

為研究外源添加AsA對StSP6A純合突變體馬鈴薯塊莖形成的影響,利用獲得的CIP-149的StSP6A敲除突變體,將CIP-149野生型對照和StSP6A純合突變體(Sp6a85、sp6a107和sp6a113)的單節(jié)莖段轉接到含30 g/L蔗糖并添加了0、1、5、10和20 mmol/L AsA的1/2 MS固體培養(yǎng)基上,在(18±2) ℃全黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計結薯率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 22.01進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA),并以至少3次重復的平均值±標準差表示。在*P<0.05和**P<0.01水平評估差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 外源AsA處理對馬鈴薯試管薯形成的影響

以2個二倍體馬鈴薯CIP-149、CIP-178和1個四倍體品種C-88為材料,研究在含30 g/L蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基中加入AsA對其塊莖形成的影響。結果表明,在培養(yǎng)基中加入終濃度為1、5、10、20和50 mmol/L的AsA時,CIP-149的結薯率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖3,A)。與0 mmol/L AsA的對照相比,CIP-149在0～5 mmol/L AsA濃度下的結薯率隨濃度增加結薯率顯著提高(圖3,A)。其中,1和5 mmol/L AsA處理下的結薯率分別是對照的3.6倍和5.84倍,此后隨AsA濃度增高,結薯率逐漸下降。對其生長表型的觀察表明,隨加入的AsA濃度逐漸升高,匍匐莖逐漸變短,50 mmol/L AsA條件下,結薯率為0,莖段幾乎全部枯死(圖3,B)。

*和**分別表示P<0.05和P<0.01水平差異顯著。下同。圖3 外源抗壞血酸處理對馬鈴薯CIP-149結薯率和生長表型的影響* and ** indicate significant difference at P <0.05 and P <0.01 levels, respectively. The same as below.Fig.3 Effects of exogenous ascorbic acid treatments on tuberization percentage and growth phenotype of CIP-149 potato plantlets

AsA對CIP-178和C-88結薯的影響與CIP-149類似。結果顯示,在培養(yǎng)基中加入終濃度為1、5、10和20 mmol/L的AsA時,CIP-178和C-88的結薯率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖4)。與0 mmol/L AsA的對照相比,CIP-178在1 mmol/L和5 mmol/L AsA濃度下的結薯率均顯著增加,分別是對照的4.47倍和3倍(圖4,A);C-88在1和5 mmol/L AsA濃度下的結薯率均顯著增加,分別是對照的4倍和16.67倍(圖4,B)。20 mmol/L AsA條件下,CIP-178和C-88的結薯率均為0。

圖4 外源抗壞血酸處理對馬鈴薯結薯率的影響Fig.4 Effects of exogenous ascorbic acid treatments on tuberization frequency of potato plantlets

上述結果表明,外源添加AsA能夠顯著誘導馬鈴薯塊莖形成,1 mmol/L和5 mmol/L AsA處理均可顯著提高3個馬鈴薯材料的結薯率,其中,CIP-149和C-88的適宜誘導濃度為5 mmol/L,CIP-178的適宜誘導濃度為1 mmol/L。

2.2 不同pH值處理對馬鈴薯試管薯形成的影響

AsA是一種天然的有機酸,加入培養(yǎng)基以后,會導致培養(yǎng)基pH值下降。將添加了不同體積摩爾濃度AsA的1/2 MS固體培養(yǎng)基離心,測定其上清的pH值,結果顯示,隨AsA濃度增加,培養(yǎng)基pH值逐漸降低(表3)。

表3 含不同濃度AsA的培養(yǎng)基pH值Table 3 pH values of media containing different concentrations of AsA

為闡明AsA誘導馬鈴薯塊莖形成過程中pH的效應,在含3%(W/V)蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基中加入1 mol/L的HCl,將培養(yǎng)基分別調(diào)為表3所示的幾個pH值。剪取預培養(yǎng)CIP-149的單節(jié)莖段轉接至不同pH值的培養(yǎng)基中,檢測改變培養(yǎng)基pH對馬鈴薯結薯的影響。結果顯示,隨pH下降,CIP-149的結薯率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在pH 4.23(對應5 mmol/L AsA)時的結薯率最高(24%),為對照的2.18倍(圖5,A)。而外源添加5 mmol/L AsA的結薯率(81.11%)為對照的5.84倍(圖3,A)。表明在外源添加AsA處理誘導結薯的過程中,AsA導致的培養(yǎng)基pH下降也可以誘導結薯率的增加,但AsA本身起更重要的作用。

圖5 培養(yǎng)基不同pH值對CIP-149試管薯形成的影響Fig.5 Effects of different pH values in culture medium on microtuber formation of CIP-149

2.3 AsA誘導試管薯形成過程中關鍵結薯相關基因的表達分析

馬鈴薯的塊莖形成需要環(huán)境、生化和遺傳因素的共同作用,是生化途徑激活/抑制和形態(tài)發(fā)生的精確同步,這兩個過程都由特定的基因表達模式控制[5,31]。圖3,A和圖4的結果表明,AsA處理可以顯著誘導馬鈴薯的塊莖形成,表明AsA可能導致一些與塊莖形成相關基因表達的變化。基于目前該領域的研究進展,研究選取了10個參與馬鈴薯塊莖形成的關鍵基因(表1),通過RT-qPCR分析了它們在AsA誘導馬鈴薯塊莖形成過程中的表達情況(圖6)。由于1 mmol/L AsA處理可以顯著提高馬鈴薯CIP-149的結薯率(圖3,A),但對馬鈴薯組培植株生長影響不明顯(圖3,B),因此,研究以該濃度檢測AsA處理對10個結薯相關基因表達的影響。

圖6 外源抗壞血酸處理對馬鈴薯CIP-149試管薯誘導和形成過程中塊莖形成相關基因表達的影響Fig.6 Effect of exogenous ascorbic acid on expression of tuberization-related genes during microtuber induction and formation in potato CIP-149

StSP6A是控制馬鈴薯塊莖形成的關鍵基因,短日照激活其表達。在長日照條件下,StCO轉錄因子通過激活StSP5G,抑制StSP6A的表達。在短日照條件下,由于缺乏StSP5G,葉片中的StSP6A被激活,然后,StSP6A蛋白通過韌皮部從葉片運輸?shù)劫橘肭o。

在匍匐莖頂端,StSP6A形成一種促進塊莖形成的塊莖形成激活復合體[9,17-18,21-22]。本試驗中,在馬鈴薯塊莖形成的不同階段,StSP6A的表達量極顯著增加,尤其是在塊莖形成誘導條件下培養(yǎng)12 d和16 d,對照組(0 mmol/L AsA)在第12天和16天的表達量較0 d分別增加8 864.9倍和9 222.9倍,1 mmol/L AsA處理組在第12天和16天的表達量較0 d分別增加8 393.8倍和8 971.1倍(圖1和圖6,A)。AsA處理在塊莖形成前期的第3天(略大的腋芽)和第9天(生長的匍匐莖)(圖1和圖6,A)可顯著提高StSP6A的表達水平,其表達量分別是對照的13.6倍和5.4倍,表明AsA處理可在馬鈴薯塊莖誘導和早期形成過程中快速提高StSP6A的表達水平。

StSP5G作為StSP6A轉錄的抑制因子負調(diào)控馬鈴薯的塊莖形成[23]。結果表明,StSP5G在塊莖形成前(第3天和第9天,圖1)的表達量都低于0 d,第3天對照組和AsA處理組的表達量分別為0 d的48.86%和29.9%。第9天分別為0 d的29.88%和36.2%。但在塊莖開始膨大和塊莖生長階段(第12天和第16天,圖1),StSP5G的表達量有大幅度的上調(diào),且AsA處理組的表達量均顯著高于對照組(圖6,B)。

StCO在長日照條件下抑制StSP6A基因的表達,負向調(diào)控馬鈴薯的塊莖形成[21-22]。在試驗的塊莖誘導和形成過程中,對StCO表達分析的結果表明,在塊莖誘導和形成的3～16 d(圖1),StCO的表達水平在對照組和AsA處理組中總體上都低于0 d;且在9～16 d期間,AsA處理組的StCO表達量均顯著低于對照組(圖6,C)。

StCDPK在馬鈴薯塊莖形成初期表達量急劇升高并受高濃度蔗糖誘導[24]。結果表明,在塊莖誘導和形成的3～16 d(圖1),StCDPK在對照組和AsA處理組的表達量整體上呈先急劇上升后下降的趨勢;其中,第9天的表達量最高,對照組和AsA處理組第9天的表達量可達0 d的1 553.3倍和1 633.8倍(圖6,D)。

GA20氧化酶(GA20ox1)是GAs合成途徑中的關鍵調(diào)控酶,StGA20ox1的表達水平與塊莖形成時間呈負相關,該基因轉錄的增強延緩了塊莖的形成,而表達的抑制則加速了塊莖形成[25,32]。結果表明,StGA20ox在塊莖誘導形成的0～12 d表達量呈上升趨勢,在第16天表達量略有下降;在3～16 d,AsA處理組StGA20ox表達量均顯著低于對照組(圖6,E)。

StBEL5-POTH1異源二聚體抑制GA20ox1啟動子活性,降低GAs水平[26]。在本試驗中,StBEL5在塊莖誘導形成的3～16 d的表達量除第3天低于0 d外,AsA處理組和對照組的StBEL5表達量總體上呈持續(xù)增加的趨勢, 但處理組和對照組之間差異不顯著(圖6,F)。POTH的表達量在0～16 d總體上變化幅度不大(圖6,G)。

StCDF1作為生物鐘組件抑制StCO的表達[22]。結果表明,在AsA處理組中,在塊莖誘導形成的3～16 d,StCDF1的表達量均明顯低于0 d;此外,除在第3天AsA處理組中的StCDF1表達量略高于對照組之外,在9～16 d AsA處理組中的StCDF1表達量均顯著低于對照組(圖6,H)。

StPHYB是一種能感知光周期的光受體,控制光周期依賴的塊莖形成[5,8]。StSUT4通過調(diào)控基因如StSP6A、StCO等的表達以及抑制葉片蔗糖輸出來抑制馬鈴薯的塊莖形成[27]。在本試驗中,StPHYB和StSUT4在塊莖誘導形成的3～16 d,AsA處理組和對照組的表達量變化較小,總體上表現(xiàn)為表達量下降或不變(圖6,I和圖6,J)。這可能與本試驗在全黑暗條件下的培養(yǎng)有關,具體表達變化調(diào)控機制尚待進一步研究。

2.4 AsA處理對StSP6A純合突變體試管薯形成的影響

以上結果表明,在馬鈴薯塊莖誘導形成過程中,StSP6A表達急劇上調(diào)(圖6,A),AsA處理能顯著提高馬鈴薯的結薯率(圖3,A、圖4,A和圖4,B),也能顯著提高StSP6A的表達量(圖6,A)。為明確StSP6A在AsA誘導塊莖形成中的作用,通過CRISPR-Cas9介導的基因組編輯敲除StSP6A基因,獲得3個StSP6A純合突變體sp6a85、sp6a107和sp6a113(圖2)。

從圖7可看出,雖然1～10 mmol/L外源AsA處理可顯著促進野生型(WT)CIP-149的塊莖形成,但在0、1、5、10和20 mmol/L AsA處理下,敲除StSP6A的純合變體sp6a85、sp6a107和sp6a113的塊莖形成都受到了強烈抑制,表明StSP6A參與了自然結薯和AsA誘導的結薯調(diào)控。

A. WT和StSP6A純合突變體(sp6a85、sp6a107和sp6a113)在不同濃度AsA處理下的結薯率;B. 不同濃度AsA處理對WT及StSP6A純合突變體sp6a85試管薯形成影響的表型觀察。圖7 外源AsA對馬鈴薯CIP-149野生型(WT)及敲除StSP6A的純合突變體結薯率和生長表型(sp6a85)的影響A. Tuberization frequency of WT and the StSP6A null-mutants (sp6a85, sp6a107 and sp6a113) under different concentrations of AsA treatments; B. Phenotypical observation of effects of different concentration of AsA treatment on microtuber formation in WT and the StSP6A null-mutant sp6a85.Fig.7 Effects of exogenous AsA treatments on tuberization percentage and growth phenotype (sp6a85) of CIP-149 wild type(WT) and knockout of StSP6A null-mutants of the potato CIP-149

3 討 論

AsA是植物細胞中最豐富的抗氧化劑, 除具有較高的抗氧化活性外,AsA也是細胞和細胞器氧化還原狀態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑,參與調(diào)節(jié)光合作用、生長發(fā)育、細胞壁生物合成、種子萌發(fā)、開花時間、果實軟化和衰老、采后貯藏、信號轉導和增強植物對不利環(huán)境的抗性等[11,33-36];另一方面,馬鈴薯塊莖形成過程中匍匐莖頂端的塊莖發(fā)育是由特定的基因表達模式控制的復雜過程[31]。然而,AsA是否參與馬鈴薯塊莖誘導和形成的調(diào)控,目前尚不清楚。本研究結果表明,外源AsA處理3個馬鈴薯材料CIP-149、CIP-178和C-88均能使其結薯率顯著提高,并且結薯率都呈現(xiàn)了一個先升高后降低的趨勢,表明適宜濃度(1～5 mmol/L)的AsA處理能誘導和促進馬鈴薯塊莖的快速形成。這個結果不僅豐富了對AsA生物學功能的認識,而且由于AsA的易得和廉價,也為提高工廠化生產(chǎn)的馬鈴薯脫毒微型種薯產(chǎn)量提供了一條可行的路徑。

馬鈴薯的塊莖形成過程涉及到多重環(huán)境因素與植物激素及信號分子的互作以及這種互作對大量關鍵基因及多條信號轉導與代謝途徑的調(diào)控;其中,StSP6A基因及其編碼蛋白在馬鈴薯塊莖的誘導和形成過程中起關鍵作用[6,21-23]。本研究表明,在馬鈴薯塊莖誘導形成過程中,StSP6A的表達顯著增強;此外,AsA處理可以顯著提高StSP6A的表達水平,尤其是在塊莖形成前期。通過CRISPR-Cas9介導的基因組編輯敲除StSP6A基因,可消除外源AsA誘導StSP6A純合突變體sp6a85、sp6a107和sp6a113的結薯效應。這些結果都清楚表明,StSP6A的表達深度參與了AsA誘導的塊莖形成過程。

StCO可通過轉錄激活StSP6A的負調(diào)控因子StSP5G負向調(diào)控StSP6A的表達[5]。本研究表明,在9～16 d,AsA處理組中StCO的表達量均顯著低于對照組。StSP5G在塊莖形成前(第3天和第9天)的表達量都低于0 d,暗示著StCO和StSP5G作為馬鈴薯塊莖形成的負調(diào)控因子可能參與了AsA誘導的塊莖形成。

StCDPK1在馬鈴薯塊莖形成初始階段的匍匐莖膨大部分高表達[24]。本結果也表明StCDPK在塊莖形成之前的第9天,表達量達到了0 d的1 500倍以上,表明StCDPK在馬鈴薯塊莖形成過程中發(fā)揮重要作用。

GAs是一種高效的植物生長調(diào)節(jié)劑,能夠影響植物的發(fā)育進程[37]。GAs對馬鈴薯塊莖形成具有抑制作用[6]。GA合成途徑中的關鍵調(diào)控酶GA20ox1負向調(diào)控馬鈴薯的塊莖形成,過表達StGA2ox1導致塊莖形成提前,抑制其表達則塊莖形成推遲[25]。本研究表明,在3～16 d,AsA處理組的表達量均顯著低于對照組,暗示AsA可能通過調(diào)控StGA20ox的表達來調(diào)控馬鈴薯塊莖形成。

Chen等發(fā)現(xiàn)StBEL5和POTH1協(xié)同互作抑制StGA20ox1的表達,進而降低塊莖形成期間GAs的合成[26]。本研究表明,StBEL5在塊莖誘導形成的9～16 d,表達量總體上呈持續(xù)增加的趨勢。馬鈴薯POTH1基因受光誘導表達[6]。本研究結果顯示,POTH在塊莖誘導形成的0～16 d,AsA處理組和對照組中的表達量變化相對不大,這可能與試驗材料是在離體條件下的全黑暗環(huán)境中培養(yǎng)有關。

自然條件下,馬鈴薯的塊莖形成是一個受光周期調(diào)控的生理過程[5,18]。本研究試驗材料是在離體條件下的全黑暗環(huán)境中培養(yǎng)(這也是離體條件下誘導馬鈴薯微型薯形成的標準條件),因此,有關受生物鐘調(diào)控的基因如StCO、StCDF、StPHYB和StSUT4的表達與正常光周期條件下的結果并不完全一致,這種在全黑暗培養(yǎng)條件下結薯相關基因的表達模式與塊莖形成的關系有待進一步深入研究。

AsA是一種存在于所有生物體內(nèi)的基本化合物,在植物生長發(fā)育、激素信號以及應激防御網(wǎng)絡等多個方面具有重要作用[38]。在植物的生長發(fā)育過程中,不同基因在不同時期的有序表達調(diào)控著植物的形態(tài)建成和生長期轉變[39]。本結果表明,AsA處理使不同塊莖形成相關基因的表達在塊莖形成的不同階段得到增強或抑制,說明AsA可能是在塊莖形成相關基因的上游發(fā)揮作用,并通過調(diào)控這些基因的表達來誘導結薯?；谝陨辖Y果,筆者提出了一個可能的模型來說明AsA參與調(diào)控馬鈴薯塊莖形成相關基因表達、進而調(diào)控馬鈴薯的塊莖形成(圖8)。

紅色標記為馬鈴薯塊莖誘導形成過程中表達上調(diào)的基因,藍色標記為表達下調(diào)或表達基本不變的基因。圖8 AsA通過激活/抑制塊莖形成相關的信號轉導通路誘導馬鈴薯塊莖形成的可能模型Red marks indicate the genes with up-regulated expression, whereas blue marks represent the genes that are down-regulated or whose expression unchanged during induction and formation of potato tubers.Fig.8 A possible model for the AsA-induced tuber formation in potato by activating/inhibiting the tuberization-related signal transduction pathways

綜上所述,外源AsA處理可誘導馬鈴薯塊莖形成,AsA誘導的塊莖形成可能與AsA調(diào)控的塊莖形成信號通路及相關基因的表達有關,特別是StSP6A在AsA處理過程中的塊莖形成早期表達量極顯著上調(diào)。敲除StSP6A可消除外源AsA誘導的結薯作用。這些結果表明,AsA誘導馬鈴薯塊莖形成是通過調(diào)控與塊莖形成相關的基因表達和激活信號轉導通路來實現(xiàn)的,而StSP6A在AsA誘導馬鈴薯塊莖形成中起著關鍵作用。