甘薯細胞色素P450單加氧酶基因IbCYP714E1和IbCYP714E2的鑒定及表達分析

何敏紅,江夢真,陳善蘭,孫宗建,朱宏波

(廣東海洋大學 濱海農(nóng)業(yè)學院,廣東湛江 524088)

赤霉素(GAs)是重要的植物激素,在調(diào)控植物莖伸長、葉片擴張、開花、種子發(fā)芽和發(fā)育等各個方面都發(fā)揮著重要的作用[1-7]。關于植物赤霉素合成、代謝及信號轉導的機制研究已經(jīng)非常深入,相關基因在水稻、擬南芥等植物中已經(jīng)被克隆[8-10]。高等植物通過控制GA的生物合成、失活和信號轉導來調(diào)節(jié)活性GA水平。活性赤霉素(如GA1和GA4)的生物合成起始于牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP),由3種類型的酶催化,分別是萜烯合成酶(TPSs)、細胞色素P450單加氧酶(P450s)和2-酮戊二酸依賴雙加氧酶(20DDs)。赤霉素(GAs)的失活涉及幾個不同的機制:GA2氧化酶(GA2ox)可以將活性GAs(GA1和GA4)及其前體(GA20和GA9)的C-2位羥基化[9,11-12];水稻Eui基因編碼的細胞色素P450單加氧酶OsCYP714D1可以通過16α,17-環(huán)氧化,使非C 13-羥基化的GAs(GA4、GA9和GA12)失活[13];擬南芥中,AtCYP714A1和AtCYP714A2蛋白被證明具有與水稻CYP714D1蛋白相同的功能[14],在毛白楊中,PtCYP714A3蛋白除了具備失活赤霉素的功能外,還同時參與植物對鹽脅迫的響應[15];水稻的另外2個CYP714基因家族成員OsCYP714B1和OsCYP714B2編碼 GA13氧化酶,能夠將GA12的C-13位羥基化,是植物活性赤霉素失活的另外途徑[16]。

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]屬于旋花科甘薯屬,具有耐貧瘠、抗性強、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、營養(yǎng)豐富等特性,是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原材料作物。甘薯基因組測序工作的完成,為甘薯基因克隆和功能驗證研究提供了方便[17-20]。CYP714基因家族方面的研究主要集中在擬南芥、水稻和毛白楊等植物中,在其他植物中很少有報道。本研究利用甘薯基因組和轉錄組數(shù)據(jù),鑒定了2個CYP714基因,分別定名為IbCYP714E1和IbCYP714E2,對其進行了生物信息學分析,并通過實時定量PCR技術對2個基因在甘薯不同組織和不同非生物脅迫處理下的表達進行研究。本研究為探索甘薯CYP714基因在參與赤霉素代謝和抗性機制方面提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]品種‘濟薯26’,分別于扦插后2個星期取葉(leaves,L)、莖(stem,S)、莖尖(stem tip,ST)和初生根(primary root,PrR),于扦插2個月后取花(flower,F)、果實(fruit,FR)、塊根(tuberous root,TR)、柴根(pencil root,PR)。干旱和鹽脅迫處理采取Hoagland營養(yǎng)液水培的方式種植培養(yǎng),鹽脅迫處理為200 mmol/L氯化鈉(NaCl)、干旱脅迫處理為250 mmol/L甘露醇,處理時間為6 h和30 h,以Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照組(CK),取樣部位為初生根,每個處理3次重復,液氮冷凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1IbCYP714基因的鑒定及理化性質(zhì)分析在甘薯基因組數(shù)據(jù)庫(https://sweetpotao.com)獲得的‘泰中6號’(I.batatas‘Taizhong 6’)基因組數(shù)據(jù)以及‘廣薯87’全長轉錄組數(shù)據(jù)作為參考基因組進行比對及后續(xù)分析。以擬南芥CYP714蛋白序列為參考,利用TBtools軟件中的BLAST程序從甘薯基因組搜索IbCYP714基因。同時利用獲得的IbCYP714基因的氨基酸序列對其進行后續(xù)的理化性質(zhì)分析。使用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具對IbCYP714蛋白分子量、等電點、親水性等理化性質(zhì)進行預測和分析。利用Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進行亞細胞定位預測。根據(jù)甘薯基因組GFF注釋信息,使用GSDS在線軟件(http://gsds.gao-lab.org/)分析IbCYP714基因的外顯子和內(nèi)含子結構。

1.2.2 IbCYP714的進化分析根據(jù)已獲得的擬南芥、水稻、毛白楊以及甘薯的CYP714氨基酸序列,使用MEGA7.0軟件的ClustaW算法對擬南芥、水稻、毛白楊和甘薯CYP714氨基酸進行序列比對,采用鄰接法(neighbor-joining,NJ),默認參數(shù)構建進化樹。利用Swiss-Model網(wǎng)站對甘薯、水稻、擬南芥、毛白楊等CYP714蛋白質(zhì)三級結構進行預測。

1.2.3IbCYP714基因啟動子分析用Tbtools軟件提取甘薯CYP714基因起始密碼子CDS序列上游2 000 bp區(qū)域作為啟動子并提交至在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare-/htm1)進行IbCYP714基因啟動子順式作用元件預測,對PlantCare分析結構進行篩選簡化后,用TBtools軟件對結果進行可視化。

1.2.4IbCYP714基因的表達分析使用Snapgene軟件設計IbCYP714基因的引物,引物序列為IbCYP714E1(5′-GATCTCCAGGAGGCCACTTC-3′,5′-GCCTCTGCGCCTTCAAGAAC-3′)、IbCYP714E2(5′-GAGCCATGGCAAGACAAGTAC-3′,5′-CCGTTGGATGTGAGGATGCC-3′),交由生工生物工程(上海)公司進行合成,以ARF(5′-CTTTGCCAAGAAGGAGATGC-3′,5′-TCTTGT-CCTGACCACCAACA-3′)作為內(nèi)參基因進行特異性表達分析。用Trizol法提取總RNA,再利用反轉錄盒(vazyme,南京)將RNA反轉錄合成cDNA,進行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCT法[21]處理數(shù)據(jù),每個樣本技術重復3次,基因的相對表達量使用(平均值±標準差)表示。

2 結果與分析

2.1 基因理化性質(zhì)分析

根據(jù)水稻和擬南芥CYP714基因保守序列,從甘薯基因組中鑒定出2個CYP714基因,定名為IbCYP714E1(OQ184947)和IbCYP714E2(OQ184948),分別位于甘薯第2和第3染色體,內(nèi)含子數(shù)均為4個,開放讀碼框為1 554個和1 563個堿基,編碼518個和521個氨基酸(圖1和表1)。蛋白質(zhì)理化分析結果表明:2個編碼蛋白質(zhì)分子量分別為58 036.42,57 881.43 kD,理論等電點分別為7.18、8.77,均為堿性蛋白,總平均親水性(GRAVY)均為負值,為親水蛋白,兩蛋白被亞細胞定位于細胞質(zhì)中(表1)。

表1 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of physicochemical properties of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

圖1 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因結構分析Fig.1 Structural analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene

2.2 系統(tǒng)進化分析及蛋白質(zhì)三級結構預測

為進一步了解該基因蛋白的功能和進化特征,使用MEGA 7.0軟件對甘薯CYP714蛋白與各參考物種CYP714蛋白序列進行比對,2個甘薯CYP714蛋白含有與水稻、擬南芥和毛白楊一致的保守結構域:氧結合和激活位點、ERR三聯(lián)體基序和Haeme結合位點(圖2,A)。2個甘薯CYP714蛋白三級結構與水稻OsCYP714D1(EUI)和OsCYP714B1蛋白三級結構相似(圖2,B)。采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)進化樹。將甘薯、擬南芥、水稻和毛白楊CYP714蛋白聚為4個類群,2個甘薯IbCYP714蛋白與3個毛白楊PtCYP714E2、PtCYP714E4和PtCYP714E5蛋白聚為一個類群(圖3)。

圖2 IbCYP714E1和IbCYP714E2蛋白多序列聯(lián)配及三級結構預測Fig.2 Multi-sequence alignment and tertiary structure of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

圖3 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

2.3 基因啟動子順式作用元件分析

通過對IbCYP714E1和IbCYP714E2基因啟動子序列進行順式作用元件預測,發(fā)現(xiàn)IbCYP714E1和IbCYP714E2基因除了含有通用順式作用元件(CAAT)、核心啟動子元件(TATA、TATA-box)外,還含有與光反應、植物激素調(diào)控、生物和非生物脅迫及與植物生長發(fā)育相關的轉錄因子等4種類型的順式作用原件,說明甘薯CYP714基因可能參與到甘薯的生長發(fā)育及生物和非生物脅迫的應答和調(diào)控(圖4)。

IbCYP714E1和IbCYP714E2基因啟動子區(qū)域內(nèi)的激素和逆境相關元件分布,不同顏色方框代表不同功能的元件。圖4 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因啟動子順式作用元件分析Distribution of hormone- and stress-related elements in the promoter region of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene, and different colored boxes represent elements with different functions.Fig.4 Analysis of cis-acting elements of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene promoter

2.4 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在不同組織和非生物脅迫下的表達分析

2個基因在甘薯不同組織中的表達存在一定的差異,IbCYP714E1基因主要在葉片、柴根和初生根中表達量較高,而IbCYP714E2基因表達量較高的組織是柴根和花(圖5)。

不同字母表示0.05水平上存在差異顯著;*表示0.05水平上存在顯著差異,**表示在0.01水平上存在極顯著差異。圖5 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在不同組織和非生物脅迫下的表達分析Different letters indicate significant difference at the 0.05 level. * indicates significant difference at the 0.05 level, ** indicates highly significant difference at the 0.01 level.Fig.5 Expression analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes in different tissues and under abiotic stresses

水培條件下對初生根進行非生物脅迫處理,IbCYP714E1基因在干旱和鹽脅迫6 h和30 h表達量均極顯著高于對照。

IbCYP714E2基因在干旱脅迫下,2個時間段基因的表達量與對照沒有顯著差異,而鹽脅迫下6 h表達量顯著增加,30 h表達量與對照沒有顯著差異(圖5)。

3 討 論

植物CYP714基因屬于細胞色素P450家族中的亞家族成員,在赤霉素代謝過程中具有重要的作用[22],水稻OsCYP714D1/Eui基因和擬南芥中的AtCYP714A1、AtCYP714A2基因編碼GA 16α,17-環(huán)氧化酶,能夠將GA12,GA9和GA4失活[13-14],水稻OsCYP714B1與OsCYP714B1編碼GA13氧化酶,是另外一個重要的GA失活酶[16],毛白楊中的PtCYP714A3基因在水稻中過量表達后,除了降低水稻株高外,還能夠提高水稻的抗鹽能力。本研究鑒定到2個甘薯CYP714基因IbCYP714E1和IbCYP714E2具備模式植物CYP714基因亞家族的特征序列,啟動子分析表明,2個基因的啟動子區(qū)域均具備與光反應、植物激素調(diào)控、生物和非生物脅迫等結合原件,尤其IbCYP714E2基因具備赤霉素響應元件,說明這兩個基因可能是甘薯赤霉素代謝的關鍵基因,同時可能參與甘薯抗逆性反應。

擬南芥中的2個CYP714基因被證明具有降解赤霉素的功能,基因的表達在組織上有疊加性和差異性[14],甘薯的2個CYP714基因也有類似結果,說明2個基因在調(diào)控甘薯赤霉素活性方面存在著一定的分工。IbCYP714E1主要在初生根、柴根和葉片上表達量較大,而IbCYP714E2主要在柴根和花中表達量較大,2個基因在不同類型根中的表達量的差異,說明它們在參與甘薯塊根的分化過程中可能起到一定作用。2個基因均能受到干旱和鹽脅迫的誘導,與啟動子分析的結果吻合,同時也說明2個基因參與非生物脅迫的應答反應,這方面的研究與毛白楊PtCYP714A3基因的研究結果[15]比較接近,說明甘薯CYP714基因在非生物脅迫應答方面也發(fā)揮一定的作用。關于甘薯IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在甘薯赤霉素代謝及非生物脅迫方面的分子機制,需要進行進一步的過表達和RNAi等方面的研究,本試驗為甘薯赤霉素代謝機理和生理機制及相關性狀分子育種研究提供了理論依據(jù)。