褪黑素調(diào)節(jié)煙草丁香假單胞菌抗性的功能研究

蔡 楠,馬文娜,肖 林,張佳蓉,2,宋中邦,陳 奇*

(1 昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,昆明 650500;2 云南現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南楚雄 675000;3 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,昆明 650021)

植物生長(zhǎng)會(huì)遭受多種病害的影響,嚴(yán)重危及作物產(chǎn)量和糧食安全[1]。植物在長(zhǎng)期與病原菌抗?fàn)庍^程中,進(jìn)化了復(fù)雜而高效的先天免疫系統(tǒng)來應(yīng)答外部病原體的入侵。植物具有兩層先天免疫系統(tǒng)[2],包括模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)介導(dǎo)的模式觸發(fā)免疫(pattern-triggered immunity,PTI)和胞內(nèi)核苷酸結(jié)合域富亮氨酸重復(fù)受體(nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing receptors,NLRs)介導(dǎo)的效應(yīng)觸發(fā)免疫(effector-triggered immunity,ETI)。植物先天免疫是通過細(xì)胞表面的PRRs感知病原體和微生物相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern/metabolism-associated molecular patterns,PAMP/MAMPs)后啟動(dòng)[3-4]。丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000,PstDC3000)是一種宿主廣泛的革蘭氏陰性菌,也是研究植物-微生物互作和植物先天免疫的模式菌。PstDC3000侵染和細(xì)菌鞭毛蛋白衍生多肽(flg22)處理下,植物通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉以防御病原菌入侵和增強(qiáng)植物對(duì)病原菌抗性,這種主動(dòng)防御現(xiàn)象稱為氣孔免疫或氣孔防御[5-6]。由受體樣蛋白(receptor like protein,RLP)和受體激酶(receptor like kinase,RLK)組成的細(xì)胞表面免疫受體負(fù)責(zé)感知微生物侵染,細(xì)胞內(nèi)免疫受體NLR特異性感知傳遞到細(xì)胞內(nèi)的免疫信號(hào)以激活胞內(nèi)病原體效應(yīng)蛋白,觸發(fā)免疫信號(hào)激活下游免疫反應(yīng),如誘導(dǎo)氣孔免疫和葉肉免疫以抵御病原菌入侵和抑制病原菌增殖。

褪黑素于1958年在牛松果體中發(fā)現(xiàn)[7],在脊椎動(dòng)物中具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、睡眠和免疫等作用[8]。動(dòng)物首個(gè)褪黑素受體(melatonin receptor 1,MT1)于1994年從非洲爪蟾中被克隆出來[9]。迄今為止,在哺乳動(dòng)物中共報(bào)道了3種褪黑素受體,包括MT1(Mel1a)、MT2(Mel1b)和MT3(ML2)[10]。MT1和MT2屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)超家族成員[11],對(duì)褪黑素具有高親和力;而MT3對(duì)褪黑素的親和力較低,屬于醌還原酶家族[12]。

1995年,幾個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室在維管植物中檢測(cè)到褪黑素[13-15],其主要由起始物色氨酸通過4個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)催化合成,分別是色氨酸脫羧酶(TDC)、色胺-5-羥化酶(T5H)、5-羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(SNAT)和N-乙?；?5-羥色胺-甲基轉(zhuǎn)移酶(ASMT)等。色氨酸經(jīng)色胺-5-羥化酶轉(zhuǎn)化為5-羥色氨酸,5-羥色胺經(jīng)過色氨酸脫羧酶作用后轉(zhuǎn)變?yōu)檠逅亍?-羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)一步將血清素催化生成乙酰血清素,最后由N-乙?；?5-羥色胺-甲基轉(zhuǎn)移酶將其合成為褪黑素[16-17]。與動(dòng)物類似,植物褪黑素信號(hào)被一個(gè)潛在的具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的植物褪黑素受體1(phytomelatonin receptor 1,PMTR1)識(shí)別感知,通過激活G蛋白/NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS爆發(fā)或通過MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉和氣孔免疫[18-19]。

有關(guān)研究表明,褪黑素在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及生物和非生物脅迫應(yīng)答中起重要調(diào)節(jié)作用[20]。在擬南芥中過表達(dá)苜蓿SNAT1基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鎘脅迫的抗性[21],且大豆GmSNAT1和擬南芥AtSNAT1基因的上調(diào)表達(dá)參與植物對(duì)鋁脅迫的抗性[22-23]。在葡萄中,異源過表達(dá)VvSNAT2基因,內(nèi)源褪黑素含量上升,且轉(zhuǎn)基因植物對(duì)白粉病抗性增強(qiáng)[24]。外源褪黑素處理能保護(hù)水稻免受稻瘟病菌引起的水稻細(xì)菌葉片條紋的影響[25],以及降低三七圓斑病、黑斑病等感病率[26]。擬南芥snat1突變體內(nèi)源褪黑素含量較低,且對(duì)丁香假單胞菌PstDC3000的敏感性升高;棉花中GhSNAT1的沉默降低了對(duì)大麗花黃萎病的抗性,而外源性褪黑素處理可恢復(fù)對(duì)病原菌的抗性。Yang等[26]最近在三七和擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn),褪黑素通過受體PMTR1調(diào)控ROS爆發(fā)和MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉是阻止病原菌入侵的主要方式,且免疫受體復(fù)合體FLS2(flagellin sensing 2)和BAK1[brassinosteroid insensitive 1(BRI1)associated kinase receptor 1]介導(dǎo)的flg22誘導(dǎo)氣孔免疫也依賴于PMTR1。

為深入理解褪黑素在植物免疫反應(yīng)中的功能,本研究以煙草為材料,構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因煙草GmSNAT1-OE2和GmSNAT1-OE5,通過對(duì)PstDC3000處理后的病原菌含量測(cè)定、氣孔敏感性分析等手段,探究?jī)?nèi)源和外源褪黑素調(diào)控植物抗病的機(jī)理,為植物褪黑素信號(hào)和功能提出新認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

研究供試材料為煙草(Nicotianatabacumcv.xathi),過表達(dá)GmSNAT1的轉(zhuǎn)基因煙草由張佳蓉轉(zhuǎn)化獲得[27]。將野生型(WT)和T3代GmSNAT1過表達(dá)植物種子(GmSNAT1-OE2和GmSNAT1-OE5)用去離子水浸泡過夜后播種在基質(zhì)中(蛭石∶珍珠巖∶營(yíng)養(yǎng)土=3∶1∶1),置于光照培養(yǎng)箱在12 h光[100 μmol/(m2·s),28 ℃]/12 h黑暗(28 ℃)的條件下培養(yǎng)3～4周用于病原菌侵染、RT-PCR、氣孔開度、保衛(wèi)細(xì)胞ROS含量和葉片褪黑素含量等分析。

1.2 RNA提取和RT-qPCR分析

取0.1 g葉片于液氮中研磨,使用Trizol試劑(Takala)提取葉片總RNA,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用SYBR Premix Ex TaqTMц試劑盒(Takara)和CFX96(BIO-RAD,美國(guó))熒光定量PCR儀檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平。用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物,RT-qPCR所用引物見表1。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平[28]。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers for RT-qPCR analysis

1.3 植物內(nèi)源褪黑素含量測(cè)定

植物褪黑素的提取和含量檢測(cè)參考Li等[29]的方法進(jìn)行。取1月齡煙草葉片300 mg,液氮研磨后加入3 mL甲醇(75%),室溫下1 500 r/min渦旋30 min,超聲3次后(每次5 min)在13 000 g和4 ℃條件下離心15 min。取上清3 mL,使用氮吹儀(RayKol EVA Mini,?？?干燥后加入200 μL 30%乙酸乙酯復(fù)溶,渦旋5 min(1 500 r/min),超聲3 min后在13 000 g 和4 ℃條件下離心,取上清并加入3 ng/g的褪黑素-d4(sc-207849,SantaCruz Biotechnology),0.45 μm濾膜過濾后使用超高效液相色譜儀(Waters Acquity UPLC,Milford,MA,USA)和三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters,Xevo TQ-MS)檢測(cè)內(nèi)源褪黑素含量。

1.4 氣孔開度檢測(cè)

將1月齡煙草植株葉片撕下的表皮置于表皮緩沖液(50 mmol/L KCl,0.1 mmol/L CaCl2,10 mmol/L MES-KOH,pH=6.15)中,光照[100 μmol/(m2·s)]孵育3 h,使氣孔完全打開,然后添加10 μmol/L褪黑素或5 μmol/L flg22(由北京中科亞光生物科技有限公司合成)處理2 h,在顯微鏡(Olympus BX60)下觀察氣孔開度,測(cè)量氣孔的長(zhǎng)度和寬度,并計(jì)算寬度/長(zhǎng)度比以衡量氣孔開度[18]。

1.5 激光共聚焦熒光顯微鏡分析

撕取1月齡煙草葉片下表皮條置于緩沖液(50 mmol/L KCl,0.1 mmol/L CaCl2,10 mmol/L MES-KOH,pH=6.15)中光照3 h[100 μmol/(m2·s)],然后加入10 μmol/L褪黑素或5 μmol/L flg22處理2 h,隨后將表皮條轉(zhuǎn)移到含有25 μmol/L的2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸(H2DCF-DA,一種ROS熒光探針,Sigma-Aldrich)的表皮緩沖中,在黑暗中孵育30 min。采用激光掃描共聚焦顯微鏡(NIKON TI-E-A1R)觀察保衛(wèi)細(xì)胞中H2DCF-DA熒光(波長(zhǎng)設(shè)置:ex=488 nm,em=535 nm),使用ImageJ軟件分析相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.6 Pst DC3000侵染實(shí)驗(yàn)

取-80 ℃保存的PstDC3000菌種在含有1.5%瓊脂(W/V)和50 mg/mL利福平的King’s B(KB,20 g/L蛋白胨,10 mL/L甘油,1.5 g/L K2HPO4,1.5 g/L MgSO4·7H2O)固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后,挑取單菌落于含有50 mg/mL利福平的KB液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)2 d。離心收集菌體,使用10 mmol/L的MgCl2溶液(含0.02%V/VSilwet L-77)稀釋菌體至OD600=0.2備用。取生長(zhǎng)3～4周長(zhǎng)勢(shì)一致的煙草,使用10 μmol/L褪黑素或1/10000(V/V)DMSO溶液(溶劑對(duì)照處理)噴施煙草葉片2 h后,使用PstDC3000(OD600=0.2)噴施植物葉片,直到葉片完全濕潤(rùn)。使用75%(V/V)乙醇表面消毒處理第0天(0 d)和第3天(3 d)葉片,用直徑為0.7 cm的打孔器取樣。打孔葉片使用10 mmol/L MgCl2研磨,梯度稀釋后涂布于含50 mg/mL利福平的KB培養(yǎng)基上(1.5%W/V瓊脂),28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel-2015進(jìn)行處理和分析,用GraphPad prism軟件進(jìn)行作圖和顯著性分析,不同字母表示P<0.05的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pst DC3000侵染增加煙草褪黑素合成基因NtSNAT1和潛在受體NtPMTR1的表達(dá)

通過檢測(cè)NtSNAT1和NtPMTR1基因表達(dá)衡量?jī)?nèi)源褪黑素信號(hào)對(duì)PstDC3000侵染的響應(yīng)。與對(duì)照(-MT-Pst)相比,PstDC3000(+MT+Pst)處理2 h后NtSNAT1和NtPMTR1表達(dá)水平分別顯著提高了84.6倍和28.2倍,然而處理8 h和24 h后卻顯著下降至對(duì)照水平(圖1)。

數(shù)據(jù)為平均值±SE(n=3),不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。圖1 褪黑素和Pst DC3000對(duì)煙草葉片NtSNAT1和NtPMTR1基因表達(dá)的影響Data are presented as means ± SE (n = 3). Different letters indicate significant difference (P< 0.05). The same as below.Fig.1 Effects of melatonin and Pst DC3000 on the expression of NtSNAT1 and NtPMTR1 in tobacco leaves

褪黑素(+MT-Pst)處理8 h誘導(dǎo)了NtSNAT1和NtPMTR1表達(dá),且進(jìn)一步促進(jìn)了PstDC3000(+MT+Pst)處理4 h和8 h對(duì)這兩個(gè)基因表達(dá)的誘導(dǎo)(圖1)。

由此可見,PstDC3000侵染能夠快速誘導(dǎo)內(nèi)源褪黑素信號(hào)。

2.2 外源褪黑素降低煙草葉片中Pst DC3000含量

為研究褪黑素在病原菌入侵中的功能,外源褪黑素預(yù)處理2 h后葉片噴施PstDC3000,分析葉片中病原菌菌落形成單位(colony forming units,CFU)以衡量葉片病原菌含量[30-34]。與對(duì)照組(-MT)相比,褪黑素(+MT)預(yù)處理后,煙草葉片上的病原菌菌落數(shù)顯著降低了88%(圖2)。

圖2 褪黑素對(duì)煙草葉片Pst DC3000含量的影響Fig.2 Effects of melatonin on the Pst DC3000 contents in tobacco leaves

2.3 過表達(dá)GmSANT1基因增加轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)源褪黑素含量

與野生型相比較,GmSNAT1-OE2和GmSNAT1-OE5轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GmSNAT1的基因表達(dá)顯著提高,且內(nèi)源褪黑素含量分別顯著提高了3.2和3.5倍,NtPMTR1的表達(dá)水平也提高了約6倍(圖3)。

圖3 過表達(dá)GmSANT1基因增加內(nèi)源褪黑素合成與潛在受體NtPMTR1基因表達(dá)Fig.3 Overexpression of GmSANT1 increases endogenous phytomelaton in synthesis and expression of the putative phytomelatonin receptor NtPMTR1

2.4 過表達(dá)GmSANT1基因提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)Pst DC3000的抗性

本研究隨后使用GmSNAT1轉(zhuǎn)基因煙草為材料,探討內(nèi)源褪黑素信號(hào)在植物應(yīng)答病原菌入侵中的功能。

與對(duì)照相比(-MT),外源褪黑素(+MT)預(yù)處理2 h后,野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的PstDC3000菌落數(shù)均顯著下降(圖4)。

圖4 褪黑素對(duì)野生型(WT)和GmSNAT1轉(zhuǎn)基因煙草(GmSNAT1-OE2和GmSNAT1-OE5)葉片Pst DC3000含量的影響Fig.4 Effects of melatonin on the Pst DC3000 content in leaves of wild type (WT) and GmSNAT1-overexpressing (GmSNAT1-OE2 and GmSNAT1-OE5) tobacco plants

在有無褪黑素預(yù)處理情況下,GmSNAT1-OE2和GmSNAT1-OE5葉片中的菌落數(shù)均顯著低于野生型植物。由此可見,外源和內(nèi)源褪黑素均顯著降低病原菌入侵。

2.5 GmSNAT1轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)褪黑素和flg22誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的敏感性增加

氣孔是病原菌入侵植物葉片的主要通道,且褪黑素通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞ROS產(chǎn)生和氣孔關(guān)閉以阻止病原菌入侵[19]。

對(duì)氣孔開度和ROS含量的分析結(jié)果表明,褪黑素和細(xì)菌鞭毛蛋白多肽flg22均能夠誘導(dǎo)野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因植物(GmSNAT1-OE2和GmSNAT1-OE5)氣孔關(guān)閉和ROS產(chǎn)生。褪黑素和flg22處理2 h后,GmSNAT1-OE2和GmSNAT1-OE5氣孔開度是WT植物的90%,而ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度提高了約2倍(圖5)。

3 討 論

褪黑素是生物體普遍存在的信號(hào)分子。在人體中,褪黑素主要具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、睡眠、生殖和免疫等生理功能。與之類似的是,褪黑素也調(diào)控了植物種子萌發(fā)、開花、氣孔節(jié)律關(guān)閉等[35]。此外,褪黑素在提高植物抗病能力中也起到重要作用,如外源褪黑素可以有效抑制茄根根核菌的活性,增強(qiáng)蘋果樹對(duì)褐斑病的抗性[36],減輕草莓真菌感染[37]。在擬南芥中,熒光假單胞菌PstDC3000可迅速提高植物內(nèi)源褪黑素含量,且外源施加褪黑素誘導(dǎo)了水楊酸和NO等防御信號(hào)和抗病基因表達(dá)[38]。與擬南芥Col-0相比,褪黑素合成關(guān)鍵基因snat1突變體中的內(nèi)源褪黑素含量及其對(duì)病原菌抗性均顯著下降[39]。本研究發(fā)現(xiàn)外源噴施褪黑素和內(nèi)源褪黑素含量提高的GmSANT1轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的PstDC3000菌落數(shù)均顯著下降,表明褪黑素在抵御病原菌入侵中起重要作用,且褪黑素在動(dòng)植物免疫應(yīng)答中的功能可能是保守的。

氣孔不僅是植物葉片吸收CO2進(jìn)行光合作用的主要通道,也是病原菌入侵的主要途徑[40]。油菜黃單胞菌(bacteriumXanthomonascampestrispv.armoraciae)[41]、葡萄生單軸霜霉菌(OomycetePlasmoparaviticola)[42]和柄銹菌屬(fungusPuccinia)[43-44]等均通過氣孔進(jìn)入植物葉片。植物質(zhì)膜定位的模式識(shí)別受體可識(shí)別病原體相關(guān)的分子模(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和氣孔關(guān)閉,從而“關(guān)閉”病原菌入侵的“大門”[5-6]。在三七(Panaxnotoginseng)中,Yang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)外源褪黑素主要通過誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉以降低病原菌入侵。在擬南芥中的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[19,26],褪黑素通過PMTR1激活異源三聚體GTP結(jié)合蛋白Gα亞基(GPA1)或MAPK信號(hào)途徑調(diào)節(jié)擬南芥氣孔免疫,且免疫受體復(fù)合體FLS2(flagellin sensing 2)和BAK1[brassinosteroid insensitive 1(BRI1)associated kinase receptor 1]介導(dǎo)的flg22誘導(dǎo)氣孔免疫也依賴于PMTR1。在煙草中,Kong等[45]克隆了PMTR1同源基因TrP47363和TrP13076,且褪黑素及其類似物5-甲氧基色胺和5-甲氧基吲哚誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉、PR1a基因表達(dá)和水楊酸累積均依賴于TrP47363和TrP13076。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)褪黑素誘導(dǎo)了煙草保衛(wèi)細(xì)胞ROS的爆發(fā)和氣孔關(guān)閉。與野生型植物相比,內(nèi)源褪黑素含量提高的GmSNAT1-OE2和GmSNAT1-OE5轉(zhuǎn)基因煙草中潛在褪黑素受體NtPMTR1的表達(dá)水平顯著提高,且它們對(duì)褪黑素和flg22誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和ROS產(chǎn)生的敏感性也顯著增加。由此可見,褪黑素主要通過誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉以阻止病原菌的入侵。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)病原菌PstDC3000能迅速誘導(dǎo)煙草葉片褪黑素信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)(NtSNAT1和NtPMTR1),且外源噴施褪黑素通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞ROS產(chǎn)生和氣孔關(guān)閉以阻止病原菌入侵。在煙草中過量表達(dá)GmSNAT1顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草中內(nèi)源褪黑素合成及受體基因NtPMTR1的表達(dá),從而提高植物的氣孔免疫和對(duì)病原菌入侵的抗性。