甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因家族鑒定及早熟相關(guān)基因挖掘

張玉玲,張 超,蔣喚喚,梁峰豪,肖華貴,曾 兵,2*

(1 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 貴州省油料研究所,貴陽 550006;2 貴州金瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司,貴陽 550006)

組蛋白N末端尾部含有乙?；?、泛素化、甲基化、磷酸化、糖基化和羰基化等翻譯后修飾位點(diǎn)[1-2],而組蛋白乙?；茄芯孔钌钊氲姆g后修飾之一,目前主要集中于組蛋白乙?；瘷C(jī)制和功能的研究[3-4]。乙?；峭ㄟ^組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDAC)實(shí)現(xiàn)活性轉(zhuǎn)化[4]。前人基于序列相似性和輔因子依賴性,將真核生物中HDAC基因家族分為RPD3/HDA1(reduced potassium dependency 3/histone deacetylase 1)、HD2(histone deacetylase 2)和SIR2(slent information regulator 2)3個(gè)亞家族,其中RPD3/HDA1亞家族需要Zn2+催化活性來發(fā)揮功能[5-7]。

RPD3/HDA1作為HDAC基因家族最大的亞家族,在植物開花及逆境脅迫響應(yīng)中的功能被廣泛研究[8]。在擬南芥中,AtHDA9基因在短日照條件下通過抑制光周期響應(yīng)基因AGL19(Agamouslike19)的表達(dá)來調(diào)控開花時(shí)間,而hda9突變體則提高AGL19基因的組蛋白H3K9和H3K27乙?；蕉怪参锉憩F(xiàn)出早花[9]。同樣,AtHDA6基因通過下調(diào)DNA去甲基化水平調(diào)控開花抑制基因FLC(FLOWERINGLOCUSC)的乙?；?其表達(dá)量降低,促進(jìn)擬南芥開花,而其突變體開花延遲[10]。此外,AtHDA5也可以抑制FLC和MAF1基因的表達(dá),從而促進(jìn)開花,其hda5-1突變體中FLC和MAF1的組蛋白H3乙酰化水平增加[11]。更重要的是,研究發(fā)現(xiàn)AtHDA6、AtHDA5可能與FLC和FVE形成蛋白復(fù)合體,通過多種方式改變組蛋白乙?；?來調(diào)控植物開花[11-12]。RPD3/HDA1家族成員除了參與植物開花調(diào)控,在逆境脅迫中也具有重要作用。學(xué)者發(fā)現(xiàn)AtHDA6基因在低溫脅迫72 h時(shí)表達(dá)水平顯著上調(diào),推測(cè)該基因可能在低溫脅迫中發(fā)揮重要作用[13]。在水稻中,HDA705基因表達(dá)能被茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo),而且水楊酸(SA)和脫落酸(ABA)也能顯著誘導(dǎo)HDA702和HDA704基因表達(dá)[14-15]。以上研究結(jié)果表明RPD3/HDA1基因家族在植物開花及逆境脅迫反應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用。

目前,已在不同植物中鑒定到數(shù)量不同的RPD3/HDA1家族成員,包括番茄(15)[1]、棉花(18)[16]、擬南芥(10)[16]、水稻(14)[16]、玉米(11)[16]、大豆(28)[17]和白菜型油菜(15)[18]。然而,在甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)中尚未進(jìn)行系統(tǒng)的研究。甘藍(lán)型油菜是主要的油料作物之一,每年為全球提供食用植物油總量的13%～16%[19-20]。長(zhǎng)江流域作為冬油菜主產(chǎn)區(qū),種植面積約占中國(guó)油菜種植總面積的85%[21],兩季作物輪作是該地區(qū)的主要種植模式,而該模式下兩季作物茬口矛盾顯得尤為突出,為了緩解這一矛盾,早熟性狀成為油菜理論研究和品種選育的關(guān)鍵性狀[22]。早熟性狀與開花時(shí)間緊密相關(guān),而RPD3/HDA1基因家族被報(bào)道參與調(diào)控植物開花及逆境脅迫的響應(yīng)[8,23]。因此,有必要探討RPD3/HDA1基因在甘藍(lán)型油菜中的潛在功能。本研究通過生物學(xué)信息學(xué)方法鑒定BnRPD3/BnHDA1基因家族,并對(duì)其蛋白理化特性、系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結(jié)構(gòu)、基因復(fù)制事件、順式作用元件、不同組織部位表達(dá)譜和低溫、ABA脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了全面分析,為進(jìn)一步研究RPD3/HDA1基因在甘藍(lán)型油菜生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)中的潛在功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

甘藍(lán)型油菜‘黔油早2號(hào)’由貴州省油料研究所選育,平均生育期為190.07 d,屬于早熟品種?！须p11’平均生育期為233.5 d,為中晚熟品種。研究以‘黔油早2號(hào)’和‘中雙11’品種為試驗(yàn)材料,選取籽粒飽滿的種子置于濕潤(rùn)的培養(yǎng)皿中,待2片子葉完全展開,移栽于土壤(基質(zhì)∶土壤=3∶1)中,在室外條件下生長(zhǎng)至4葉期,分別對(duì)2個(gè)品種進(jìn)行脅迫處理。激素處理:使用100 μmol/L ABA對(duì)甘藍(lán)型油菜進(jìn)行噴施,分別于0,1,3,6,12,24 h采集葉片[24]。低溫處理:將4葉期油菜置于4 ℃低溫培養(yǎng)箱(光照/黑暗為16 h/8 h),分別于0,3,6,12,24,48,72 h收集葉片[25]。以上每個(gè)樣品均為3個(gè)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1家族成員鑒定及理化特性預(yù)測(cè)為了鑒定BnRPD3/BnHDA1基因,在甘藍(lán)型油菜全基因組(Brana_ZS_HZAU_V1.0/)(http://brassicadb.cn/#/Download/)中通過Blastp和HMMER 2種方法搜索可能的該家族成員。首先,下載擬南芥和水稻的RPD3/HDA1蛋白序列,將其比對(duì)到甘藍(lán)型油菜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),閾值E<1×10-10。接著,從Pfam(https://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載Hist_cetyl結(jié)構(gòu)域(PF00850)的隱馬爾可夫模型(HMM)文件,利用HMMER 3.0軟件在甘藍(lán)型油菜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索BnRPD3/BnHDA1,閾值為E<1×10-5。最后,整合2種方法得到BnRPD3/BnHDA1候選基因。將候選基因蛋白序列提交至Pfam和NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)網(wǎng)站驗(yàn)證保守結(jié)構(gòu)域。在ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)該家族基因編碼的氨基酸數(shù)目、蛋白分子量、等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)等物理化學(xué)特性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.2 RPD3/HDA1家族系統(tǒng)進(jìn)化樹下載擬南芥和甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1氨基酸序列全長(zhǎng),利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì),隨后使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap值設(shè)置為1 000,并通過在線軟件EvolView(https://evolgenius.info//evolview-v2/#mytrees/AS/ASD)對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行可視化。

1.2.3 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因結(jié)構(gòu)、基因復(fù)制事件和順式作用元件預(yù)測(cè)根據(jù)甘藍(lán)型油菜基因組的注釋文件(GFF3)提取該家族基因的外顯子和內(nèi)含子等結(jié)構(gòu)信息,使用TBtools軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖[26]。利用MCScanX(http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/)軟件獲取BnRPD3/BnHDA1基因家族的片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)基因,使用Circos軟件呈現(xiàn)該家族基因復(fù)制事件。使用TBtools軟件截取BnRPD3/BnHDA1基因起始密碼子上游2 kb的啟動(dòng)子序列,將其提交至PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)順式作用元件種類及數(shù)目。通過GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)網(wǎng)站中對(duì)其順式作用元件進(jìn)行可視化。

1.2.4 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因不同組織部位的表達(dá)為了全面了解甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因在不同組織部位的表達(dá)情況,從BnIR(http://yanglab.hzau.edu.cn/BnIR/expression_zs11)數(shù)據(jù)庫(kù)下載了該家族基因在根、莖、葉、花、子葉、萼片和蕾中的RNA-seq數(shù)據(jù),使用TBtools軟件繪制熱圖。

1.2.5 RNA提取及qRT-PCR采用SteadyPure Plant RNA Extraction Kit(AG21019,艾科瑞)試劑盒提取低溫和ABA處理前后‘黔油早2號(hào)’及‘中雙11’葉片的RNA,使用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度與質(zhì)量。

利用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒(AG11728,艾科瑞)將RNA反轉(zhuǎn)為第一鏈cDNA,保存于-20 ℃。采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Q711-02,諾唯贊)進(jìn)行qRT-PCR,按照試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,以Bnactin7 為內(nèi)參基因。qRT-PCR程序如下:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)數(shù)為40。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù),采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[27]。通過Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析,使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)。qRT-PCR中使用的所有引物列于表1中。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因家族成員鑒定及理化特性預(yù)測(cè)

在甘藍(lán)型油菜全基因組中共篩選到28個(gè)具有完整保守結(jié)構(gòu)域的RPD3/HDA1基因,該家族成員的理化特性分析結(jié)果見表2。

表2 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因家族成員編碼氨基酸數(shù)目、蛋白理化特性及基因位置Table 2 Number of amino acids encoded by RPD3/HDA1 gene family members, physical and chemical characteristics of protein and gene location in Brassica napus

由表2可知,其編碼氨基酸數(shù)目變化幅度較大,在363 aa(BnHDA13)～675 aa(BnHDA5)之間不等,蛋白分子量在40.89 kD(BnHDA13)到74.98 kD(BnHDA5)之間,平均為53.04 kD。等電點(diǎn)范圍為4.94(BnHDA28)至8.71(BnHDA18),小于7(除BnHDA10、BnHDA18),92.85%的BnRPD3/BnHDA1屬于酸性蛋白,說明大部分BnRPD3/BnHDA1蛋白可能在酸性環(huán)境中發(fā)揮作用。不穩(wěn)定系數(shù)系數(shù)介于26.05～43.24之間,為穩(wěn)定型蛋白(除BnHDA6、BnHDA11、BnHDA14、BnHDA19和BnHDA28)。

2.2 RPD3/HDA1家族系統(tǒng)進(jìn)化樹及基因結(jié)構(gòu)

采用鄰接法構(gòu)建甘藍(lán)型油菜和擬南芥2個(gè)物種RPD3/HDA1家族成員(圖1)及單獨(dú)的甘藍(lán)型油菜該家族成員(圖2,A)的系統(tǒng)發(fā)育樹。依據(jù)ZHANG等[16]的分類方法將甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1家族成員分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個(gè)亞家族,其中13個(gè)成員分布于Ⅰ亞家族,11個(gè)成員在Ⅱ亞家族,Ⅲ亞家族和Ⅳ亞家族中均含有2個(gè)成員。在甘藍(lán)型油菜的多倍體化過程中,BnRPD3/BnHDA1不同亞家族基因數(shù)量存在差異,可能經(jīng)歷了基因擴(kuò)增和丟失。此外,BnHDA9和BnHDA20與AtHDA3蛋白高度同源,說明它們可能具有相似或相同的功能。

圖1 擬南芥(At)和甘藍(lán)型(Bn)油菜RPD3/HDA1家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of RPD3/HDA1 family members in Arabidopsis (At) and Brassica napus (Bn)

圖2 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因結(jié)構(gòu)Fig.2 RPD3/HDA1 gene structures of Brassica napus

基因結(jié)構(gòu)決定基因功能,為了明確甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1家族成員的生物學(xué)功能,對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果(圖2,B)表明該家族成員外顯子數(shù)量在3～17之間,不同亞家族成員的外顯子數(shù)量存在差異,其中Ⅳ亞家族基因均含有3個(gè)外顯子,外顯子數(shù)量最少,而Ⅱ亞家族的外顯子數(shù)量較多(8～10),這可能與其功能的多樣化有關(guān)。但同一亞家族成員具有相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)模式,推測(cè)同一亞家族成員可能是通過基因復(fù)制產(chǎn)生。

2.3 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因重復(fù)事件分析

基因重復(fù)是基因組進(jìn)化和基因家族擴(kuò)展的主要驅(qū)動(dòng)力之一[28]。全基因組復(fù)制、片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制是植物基因家族擴(kuò)張的主要原因[29]?；蚝突蚪M復(fù)制使基因數(shù)量增加,從而基因功能冗余和分化,使基因組能夠在進(jìn)化過程中不斷適應(yīng)環(huán)境的影響[28-29]。

因此,為了闡明BnRPD3/BnHDA1基因家族擴(kuò)張的機(jī)制及解析基因功能,對(duì)其進(jìn)行復(fù)制基因分析(圖3)。在該家族中共檢測(cè)到16對(duì)復(fù)制基因,均為片段復(fù)制,表明BnRPD3/BnHDA1基因家族主要通過基因復(fù)制實(shí)現(xiàn)基因數(shù)量的增加,而片段重復(fù)是該家族進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力。

圖3 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1復(fù)制基因Fig.3 RPD3/HDA1 replication genes in Brassica napus

2.4 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因順式作用元件預(yù)測(cè)

順式作用元件在啟動(dòng)基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用。為此,對(duì)BnRPD3/BnHDA1家族成員ATG上游2 kb啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果(圖4)顯示:該家族中共有675個(gè)元件與植物激素、環(huán)境脅迫和光響應(yīng)相關(guān),其中與光響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件最多,表明可能參與光有關(guān)的植物生長(zhǎng)發(fā)育過程;其次含有大量與激素有關(guān)的元件,包括MeJA、ABA、生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GA)和SA等。低溫和干旱等環(huán)境脅迫有關(guān)的元件在BnRPD3/BnHDA1基因中也被確定,說明基因家族成員可能參與干旱和低溫有關(guān)的信號(hào)途徑。以上研究表明BnRPD3/BnHDA1基因可能通過激素信號(hào)通路和防御信號(hào)通路參與油菜的生長(zhǎng)發(fā)育和防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

圖4 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因順式作用元件Fig.4 Cis-acting elements in RPD3/HDA1 genes of Brassica napus

2.5 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因不同組織部位表達(dá)

為了揭示甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因在不同組織部位的表達(dá)模式,從BnIR網(wǎng)站下載該家族基因的RNA-seq數(shù)據(jù),同時(shí)繪制熱圖(圖5)。結(jié)果顯示:BnRPD3/BnHDA1基因在不同組織部位的表達(dá)存在差異,在葉片中表達(dá)量相對(duì)較高,其中BnHDA2、BnHDA13和BnHDA17在葉片中呈現(xiàn)高表達(dá),而BnHDA3、BnHDA18和BnHDA25基本不表達(dá);BnHDA2和BnHDA17在根中大量表達(dá),而BnHDA7不表達(dá)。特別的是,BnHDA17在蕾中的表達(dá)量非常高,暗示可能在蕾中發(fā)揮功能;BnHDA27在花和萼片中大量表達(dá),猜測(cè)可能參與植物花發(fā)育。以上研究結(jié)果表明BnRPD3/BnHDA1家族基因可能存在基因功能分化。

圖5 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因不同組織部位表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of RPD3/HDA1 genes in different tissue parts of Brassica napus

2.6 不同品種甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因表達(dá)

為了檢測(cè)RPD3/HDA1基因在‘黔油早2號(hào)’和‘中雙11’中的表達(dá)差異,根據(jù)該家族基因含有的順式作用元件及不同組織部位的RNA-seq數(shù)據(jù)選取8個(gè)基因進(jìn)行試驗(yàn)。

qRT-PCR結(jié)果(圖6)顯示:‘黔油早2號(hào)’中BnHDA1、BnHDA2、BnHDA9、BnHDA13、BnHDA19、BnHDA21、BnHDA23、BnHDA28基因的表達(dá)量分別是‘中雙11’對(duì)應(yīng)基因的1.31,2.06,3.41,1.88,1.37,2.67,2.44,1.80倍,該家族基因在早熟品種‘黔油早2號(hào)’中的表達(dá)量均高于在中晚熟品種‘中雙11’中的表達(dá)量,推測(cè)該家族基因可能參與油菜早熟性狀的調(diào)控。

圖中小寫字母表示同一品種中不同基因間在0.05水平上差異顯著。下同。圖6 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因在不同品種中的表達(dá)分析The lowercase letters in the figure indicate significant difference at the 0.05 level between different genes in the same variety. The same as below.Fig.6 Expression analysis of RPD3/HDA1 genes in different varieties of Brassica napus

2.7 不同脅迫條件下甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因表達(dá)

2.7.1 低溫脅迫下的表達(dá)為了探究BnRPD3/BnHDA1基因在低溫脅迫下的響應(yīng)情況,利用qRT-PCR檢測(cè)8個(gè)BnRPD3/BnHDA1基因在‘黔油早2號(hào)’和‘中雙11’中的表達(dá)量。

結(jié)果(圖7)表明:在‘黔油早2號(hào)’中,BnHDA1、BnHDA9、BnHDA13、BnHDA21和BnHDA23基因在受到低溫脅迫后表達(dá)量降低,且顯著低于0 h表達(dá)水平;BnHDA2、BnHDA19和BnHDA28基因表達(dá)量達(dá)到峰值的時(shí)間存在差異,如BnHDA28在脅迫72 h時(shí)表達(dá)量最高,顯著高于0 h。特別的是,BnHDA13和BnHDA23隨著處理時(shí)間的遞增表達(dá)量依次降低,說明它們對(duì)冷脅迫具有響應(yīng)。在‘中雙11’中,BnHDA9、BnHDA13、BnHDA19、BnHDA23和BnHDA21基因均在脅迫3 h時(shí)表達(dá)量最高;BnHDA1基因在冷處理后表達(dá)量下調(diào),且處理后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平均低于0 h,而BnHDA2基因在脅迫后表達(dá)量上調(diào),且顯著高于0 h。綜上可知,BnRPD3/BnHDA1基因家族參與冷脅迫的響應(yīng),但2個(gè)品種中表達(dá)模式存在差異。

圖7 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因冷脅迫(4 ℃)下的表達(dá)模式Fig.7 Expression patterns of RPD3/HDA1 genes in Brassica napus under cold stress (4 ℃)

2.7.2 ABA脅迫下的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)了8個(gè)BnRPD3/BnHDA1基因在ABA脅迫后的表達(dá)水平(圖8)。結(jié)果顯示:‘黔油早2號(hào)’中BnHDA1、BnHDA2和BnHDA19基因在受到ABA脅迫后表達(dá)量降低,而其他5個(gè)BnRPD3/BnHDA1基因在ABA處理后表達(dá)量到達(dá)峰值的時(shí)間不一致,其中BnHDA13和BnHDA28基因在脅迫1 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值,分別是0 h的1.09和1.42倍;BnHDA9、BnHDA21和BnHDA23基因在處理6 h時(shí)表達(dá)量最高,分別是0 h的2.45,1.07,1.35倍。

圖8 甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因在ABA脅迫下的表達(dá)模式Fig.8 Expression patterns of RPD3/HDA1 genes in Brassica napus under ABA stress

在‘中雙11’中,BnHDA1、BnHDA2、BnHDA9、BnHDA13、BnHDA19、BnHDA21和BnHDA28在ABA脅迫后表達(dá)量均下調(diào),且在各處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均低于0 h。BnHDA23僅在脅迫后1 和12 h稍高于0 h,說明在‘中雙11’中該基因家族成員在激素信號(hào)途徑中可能具有調(diào)控作用。綜上所述,‘黔油早2號(hào)’和‘中雙11’中RPD3/HDA1基因在ABA處理后表達(dá)水平隨著處理時(shí)間的遞增上調(diào)或下調(diào),說明該家族基因能對(duì)ABA脅迫做出響應(yīng)。

3 討 論

RPD3/HDA1基因家族是調(diào)控植物開花重要家族之一[8],該家族成員之間通過協(xié)同調(diào)節(jié)基因表達(dá),以多種方式改變組蛋白乙酰化水平,抑制FLC基因的表達(dá)使植物早花[11-12]。植物開花受到多種因素的影響,其中低溫是誘導(dǎo)植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)的重要環(huán)境信號(hào),合理低溫能夠加快植物開花進(jìn)程,提高開花產(chǎn)量與品質(zhì)[30]。郝蓬勃[31]指出植物在未受低溫脅迫時(shí)FLC大量表達(dá),抑制花芽分化;而長(zhǎng)時(shí)間低溫處理后卻抑制了FLC基因的表達(dá),促進(jìn)花芽分化。此外,低溫條件下能誘導(dǎo)ABA積累[32],而外源ABA能有效地減輕冷脅迫帶來的傷害[33]。但ABA被認(rèn)為是植物成花起始的抑制因子,其信號(hào)因子ABI4和ABI5能與FLC基因啟動(dòng)子中的ABRE/G-box元件結(jié)合促進(jìn)FLC基因的轉(zhuǎn)錄,從而延遲植物開花[34-35]。研究人員發(fā)現(xiàn)越早熟的油菜品種在花芽分化期間ABA含量越低,表明低含量的ABA與油菜早熟關(guān)系密切[36]。因此,本研究以早熟品種‘黔油早2號(hào)’和中晚熟品種‘中雙11’為試驗(yàn)材料,來探究冷和ABA脅迫對(duì)油菜早熟的影響,以期挖掘到RPD3/HDA1基因家族中調(diào)控油菜開花的基因。

本研究在甘藍(lán)型油菜中共鑒定到28個(gè)RPD3/HDA1基因,聚類為4個(gè)亞家族,不同亞家族基因數(shù)量存在差異。由于植物雜交或染色體加倍后基因組序列重排會(huì)發(fā)生基因丟失[37]。因此,猜測(cè)甘藍(lán)和白菜雜交、加倍過程中可能發(fā)生了該家族亞家族基因丟失。甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1家族除了不同亞家族基因數(shù)量不同以外,其不同亞家族成員的外顯子/內(nèi)含子數(shù)量也存在差異。據(jù)報(bào)道,基因組中轉(zhuǎn)座子元件會(huì)使染色體序列發(fā)生重排,從而影響基因結(jié)構(gòu),包括缺失、反轉(zhuǎn)和易位[38],而外顯子/內(nèi)含子的獲得或丟失會(huì)使基因結(jié)構(gòu)和功能存在差異[39-40]。因此,甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因外顯子/內(nèi)含子在進(jìn)化中發(fā)生丟失,可能會(huì)使基因功能改變。

本研究采用qRT-PCR方法比較了‘黔油早2號(hào)’和‘中雙11’中RPD3/HDA1基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)該家族基因在‘黔油早2號(hào)’中的表達(dá)量高于‘中雙11’,這一結(jié)果與張晶晶[41]在早熟棉花中的研究結(jié)果一致,暗示BnRPD3/BnHDA1家族基因可能參與油菜早熟性狀的調(diào)控。HU等[42]發(fā)現(xiàn)玉米R(shí)PD3/HDA1基因受到低溫脅迫后表達(dá)水平上調(diào),導(dǎo)致H3和H4組蛋白完全去乙?；?。然而,‘黔油早2號(hào)’中BnHDA1、BnHDA9、BnHDA13、BnHDA21和BnHDA23基因受到低溫脅迫后表達(dá)量降低,‘中雙11’中僅BnHDA1基因的表達(dá)量下調(diào),表明不同植物及不同的取樣時(shí)間可能使該基因家族植物冷脅迫中發(fā)揮不同的調(diào)控作用。此外,低溫能夠加快植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng),促使植物早花[43]?！驮?號(hào)’具有早花的特性,受到冷脅迫后‘黔油早2號(hào)’較‘中雙11’中大部分RPD3/HDA1基因表達(dá)量下調(diào)幅度大,這可能與該材料早花早熟特性有關(guān)。ABA作為植物重要的激素,被認(rèn)為是一種開花抑制因子,延遲植物開花[34]。ABA處理后RPD3/HDA1基因的表達(dá)量在‘黔油早2號(hào)’中的下調(diào)幅度大于‘中雙11’,說明ABA能抑制RPD3/HDA1基因的表達(dá),且在‘黔油早2號(hào)’中抑制程度較大,表明RPD3/HDA1基因經(jīng)ABA處理后可能在油菜開花中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,但具體的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究借助生物信息學(xué)方法對(duì)甘藍(lán)型油菜RPD3/HDA1基因家族進(jìn)行全面鑒定,并明確了該家族基因在低溫和ABA處理后的表達(dá)模式,進(jìn)一步豐富了對(duì)油菜響應(yīng)逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制的認(rèn)識(shí),也為早熟油菜抗逆性遺傳改良提供了理論基礎(chǔ)和候選基因。