DNA甲基化譜：流淌的生命脈律

廖端芳，張佳，盧光明，李凱

〔摘要〕 70年前，隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，人類進入基因組時代；21世紀初，人類基因組測序完成及對轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和表觀遺傳的研究，人類繼而進入后基因組時代；近年對DNA甲基化的深入研究，預(yù)示更為神秘寬廣的表觀遺傳組學(xué)時代已經(jīng)到來。人體血液中大量存在的甲基化DNA構(gòu)成甲基化譜，作為一個整合性指標，有如一曲流淌的生命脈律，反映不同細胞的生理或病理狀態(tài)。精準分析甲基化譜，具有診斷疾病特別是腫瘤早篩早診的價值；同時可作為人類健康、乃至天賦的量化評估指標；也可用于中醫(yī)體質(zhì)辨識與證型分類及中藥材溯源、真?zhèn)巫R別和品種改良。本文介紹表觀遺傳組學(xué)時代甲基化譜的重要意義，以紀念DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)70周年。

〔關(guān)鍵詞〕 DNA甲基化；甲基化譜；游離核酸；表觀遺傳；腫瘤早篩

〔中圖分類號〕R2? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.026

DNA methylation profile， the flowing melody of life：

Marking the 70th anniversary of discovering DNA double helix

LIAO Duanfang1，2， ZHANG Jia1， LU Guangming3， LI Kai1，2*

1. National Engineering Research Center of Personalized Diagnostic and Therapeutic Technology， Hunan University of

Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan

Province， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. General Hospital of Eastern

Theater Command， Jinling Hospital of Nanjing University， Nanjing， Jiangsu 210016， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Seven decades ago， the discovery of double helix structure announced the genetic era of human beings; at the beginning of the century， human genomic sequencing， study of transcriptome， proteome， and epigenetics marked the post-genomic era; in recent years， the study of DNA methylation signifies the era of mysterious epigenetics. DNA methylation profile is composed of numerous DNA methylation markers in human blood. As the integrated parameter， it resembles the flowing melody of life， and reflects the physiological or pathological statues of the cells. The methylation profile can diagnose diseases such as cancer at its early stage， evaluate healthy status and constitution， classify the patterns of Chinese medicine， and standardize the diagnosis of Chinese medicine. In addition， it can help trace， identify and improve the Chinese medicines. To mark the 70th anniversary of discovering double helix structure， this paper introduces the biomedical significance of methylation profile.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 DNA methylation; methylation profile; circulating cell-free DNA; epigenetic; early detection of cancer

生命，是一首歌，通過優(yōu)美的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)奏響著由A、T、C、G和甲基化C 5種音符組成的動人旋律[1-2]；生命，是一條河，流淌著蘊含億萬細胞交織而成的甲基化譜脈律。每個個體的生命，從誕生到離去，那動人的5種音符，從深奧無底的基因組，透過甲基化胞嘧啶（methylcytosine， mC）組成的甲基化譜，無時無刻不在我們血液中流淌，是我們生命的脈律，影響著我們的人生。

在跨入21世紀之際，隨著人類基因組測序計劃完成，人類獲取了由ATCG和甲基化C 5種核酸構(gòu)成的長達30億個堿基音符的生命天書，定義了我們所處的時代為后基因組時代[3-5]。解碼生命天書，成為當代生物科學(xué)技術(shù)的主旋律。

甲基化譜，是生物體DNA不同CpG位點甲基化數(shù)量在某一時刻的總和[6-8]?；蚪M中的每個單一CpG位點，通過不斷更新或凋亡細胞釋放入血的游離核酸，攜帶其組織的特異性信息，這些信息的集合反映機體不同系統(tǒng)、器官、組織的生理或病理狀態(tài)。同一個體在不同時間、不同個體在同一時間，甲基化狀態(tài)均有不同；血液游離核酸所呈現(xiàn)的甲基化譜亦相應(yīng)有所區(qū)別[9-10]。因此，游離核酸甲基化譜是生命的信息子集，是一個高度動態(tài)、由不同細胞類型凋亡或死亡細胞碎片化核酸組成的瞬時集合，與之相對應(yīng)的細胞甲基化圖譜，則屬于特定細胞類型各自具有的、相對恒定的甲基化組學(xué)序列[10-12]。

核酸甲基化是表觀遺傳的主要方式[12-15]，通過對編碼人類大約5萬種蛋白質(zhì)的基因在何時何處以及何種強度進行甲基化調(diào)控，使生命樂章得以完美演奏。甲基化調(diào)控基因的表達水平，抑癌基因的甲基化可顯著增加癌癥發(fā)生的風險[16-18]。文獻報道，超過2 500多種基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，早期腫瘤為單克隆，而晚期腫瘤常常表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，即多克隆或?qū)嶋H為多種疾病的集合[19-20]。DNA甲基化也與循環(huán)腫瘤細胞的干細胞特性、解聚及轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[21]。以上提示，DNA甲基化對指導(dǎo)腫瘤早期診斷、早期治療及轉(zhuǎn)移監(jiān)控具有非常重要的價值。

參與特定腫瘤發(fā)生的基因種類多樣，早期診斷需要對盡可能多的基因甲基化進行高敏感檢測[11]。在現(xiàn)有甲基化分析技術(shù)中，聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction， PCR）檢測一個或少數(shù)幾個甲基化位點，而二代測序（next gene sequencing， NGS）可進行組學(xué)層面的甲基化測序[22-23]。甲基化分析技術(shù)雖已用于肺癌、結(jié)直腸癌等篩查，但這些技術(shù)大都采用亞硫酸氫鈉對未甲基化的胞嘧啶（C）向尿嘧啶（U）進行轉(zhuǎn)化，U在PCR或測序時的后續(xù)擴增中表現(xiàn)為T，而甲基化的C則維持不變，比較化學(xué)轉(zhuǎn)化前后兩個標本，即可得到待測標本的CpG是否甲基化。因此，保留了mC在基因分析時仍呈現(xiàn)為C的基本結(jié)構(gòu)特征（圖1）。由于亞硫酸氫鈉在上述化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中大量破壞核酸，相應(yīng)技術(shù)對低拷貝DNA甲基化表觀遺傳學(xué)信息進行檢測的敏感性不高，用于腫瘤的早期診斷存在很大局限性[24-25]。

為克服亞硫酸氫鈉相關(guān)技術(shù)的致命缺陷，多種新技術(shù)已用于DNA甲基化研究[26-28]。其中，以甲基化依賴酶為核心的單序列特異性引物甲基化檢測技術(shù)和med-NGS技術(shù)，人工創(chuàng)造了一系列抑制接頭自連系統(tǒng)，結(jié)合廣泛用于基因編輯的金門克隆技術(shù)，構(gòu)建動態(tài)抑制甲基化接頭的自連，并促使可逆反應(yīng)向接頭與待測核酸形成產(chǎn)物的方向進行[28-31]（圖2）。這些創(chuàng)新性技術(shù)，可對數(shù)個到成千上萬個CpG選定位點設(shè)計序列特異性引物（圖3），以達到在不破壞待測核酸前提下對甲基化核酸的富集和解碼，均可望成為甲基化譜的標配技術(shù)。

從基因組時代到后基因組時代，從遺傳學(xué)時代到表觀遺傳學(xué)時代，從單個甲基化位點檢測到甲基化組學(xué)測序，生物科技和生命科學(xué)領(lǐng)域經(jīng)歷了漫長而艱辛的探索。在21世紀20年代之初，當全球生物醫(yī)學(xué)因為新冠疫情不得不重復(fù)開發(fā)和廣泛應(yīng)用相對原始的核酸檢測RT-PCR技術(shù)的特殊時期，甲基化譜技術(shù)的出現(xiàn)，拓展了其在重大傳染病防治中的應(yīng)用[32-33]。再次使我們可以通過表觀遺傳學(xué)，去聆聽生命的歌，去感受生命的脈律，去呵護生命的美好。

甲基化譜是機體細胞新陳代謝在基因?qū)用娴囊粋€瞬時性總體集合，重復(fù)檢測甲基化譜，可以動態(tài)反映組成生命各系統(tǒng)、各器官的細胞更新速率和各種細胞基因表達調(diào)控水平的變化程度。人類基因組含有大約2 800萬個CpG位點，這些位點的C是否甲基化直接關(guān)系到相關(guān)基因表達與否以及表達水平的高低。換言之，基因的甲基化與去甲基化，高甲基化與低甲基化，均參與基因表達的調(diào)控[34-35]。甲基化譜直接反映生命活動的健康、亞健康，亦或某種疾病狀態(tài)。

甲基化譜分析技術(shù)的出現(xiàn)，突破了長期困擾腫瘤早篩早診的技術(shù)瓶頸[18，20-21]。然而，器官特異性腫瘤甲基化譜和泛癌種甲基化譜要逐步成為基因診斷標準或成熟為臨床指南，尚有待積累大量臨床檢測病例，并通過甲基化譜與早篩早診所必須的突變數(shù)量、突變豐度、突變比例和突變速率等臨床數(shù)據(jù)的不斷細化、更新和臨床再驗證。甲基化譜的臨床應(yīng)用，短期可用于耐藥監(jiān)測和圍手術(shù)期監(jiān)測（minimal residual disease， MRD）[35]，減少晚期腫瘤患者比例，提高患者生存期和生存質(zhì)量，使常態(tài)化荷瘤生存成為可能，其遠期效果有望根治大部分腫瘤患者。

在臨床推進上，甲基化譜用于腫瘤的早期診斷，首先需要通過對單一癌種晚期患者手術(shù)前后的甲基化譜進行布爾代數(shù)運算，以及術(shù)前術(shù)后甲基化譜的差異性（即病集）運算，從而得到相應(yīng)腫瘤的疾病特異性甲基化譜[36-37]。多種腫瘤甲基化譜的進一步并集，即得到泛癌種的甲基化譜。甲基化譜在用于腫瘤早期診斷之前，一個合適的應(yīng)用場景是對影像學(xué)發(fā)現(xiàn)的微小增生病灶進行良惡性鑒別，然后初步擴大臨床應(yīng)用。正是因為血液游離核酸甲基化的高敏感檢測技術(shù)，人類得以第一次認識到甲基化譜——這一動態(tài)與全息的生命脈律。在腫瘤早期診斷的醫(yī)學(xué)旅程中，可以預(yù)期，甲基化譜分析技術(shù)的出現(xiàn)對甲基化譜成為腫瘤早期腫瘤診斷標準之一將具有重要推動作用。

甲基化譜分析新技術(shù)[25-30]研發(fā)的初心，是為防止晚期腫瘤。這些技術(shù)避免使用亞硫酸氫鈉對待測標本的破環(huán)，不僅提高了檢測敏感性，更解決了亞硫酸氫鈉技術(shù)導(dǎo)致的“薛定諤的貓”相類似難題。以亞硫酸氫鈉為基礎(chǔ)的經(jīng)典DNA甲基化分析技術(shù)，需對化學(xué)處理前后標本進行比對，很明顯，在對體外受精的單細胞甲基化分析中，臨床實際難以提供兩個細胞進行比對。新的甲基化譜技術(shù)，因其只需對一個細胞進行檢測，即可在生命誕生的初始階段對其進行監(jiān)控。作為一個機體細胞的整合性指標，甲基化譜除了可以廣泛用于多種疾病的早期診斷、療效評估以及藥物毒副作用監(jiān)測外，還可以用于人種[38-39]、同卵及異卵雙胞胎[9]鑒別，甚至還可以用于衰老速率評估及特定工作狀態(tài)分析[40]。

游離核酸甲基化譜同樣可以用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的全流程分析。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)都是根據(jù)可觀察到的癥狀或證候指標描述病理變化，而甲基化譜揭示了在遺傳和表觀遺傳水平上發(fā)生的變化。中醫(yī)學(xué)的整體觀念和辨證論治兩大特點，很可能與甲基化譜及其變化相吻合。一方面，甲基化譜可以作為一個通用的參數(shù)，對中醫(yī)的基本概念進行分類，如陰陽五行、臟腑及其表現(xiàn)、氣血津液、經(jīng)絡(luò)等。特別是在辨識中醫(yī)的不同證型或亞證型方面，甲基化譜可能是中醫(yī)證素（包括病性證素和病位證素）的重要展現(xiàn)方式，可為中醫(yī)體質(zhì)辨識和療效評估提供一個敏感的定量技術(shù)途徑，從表觀遺傳的角度更加精準地指導(dǎo)中醫(yī)治病防病。另一方面，也可以利用植物DNA甲基化（CpG、CpHG和CpHH）譜辨別中藥材的真?zhèn)?，采用甲基化譜技術(shù)結(jié)合基因編輯技術(shù)對農(nóng)作物和中藥材進行品種改良和優(yōu)化[15，41-42]。此外，DNA甲基化譜還可用于動物模型的評價[43]。利用甲基化譜對傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)進行量化評估，可能成為中藥通過多途徑、多靶標調(diào)節(jié)人體功能的一種最好詮釋方式，使人類歷史上的經(jīng)驗性知識升華為現(xiàn)代科學(xué)理論。

游離核酸甲基化譜既是生命中屬于機體的物理性動態(tài)指標，可授益通常意義上的疾病診斷；也可在一定程度上作為人類健康、亞健康的衡量指標，甚至成為心理和智商的判斷指標。譬如，機體處于亞健康狀態(tài)、應(yīng)激狀態(tài)或某個特殊工作狀態(tài)（如夜班工作者）時，可能不存在病理、生化或物理等指標的改變，但以甲基化譜為代表的表觀遺傳學(xué)改變已經(jīng)悄悄展現(xiàn)[40]；又如，當神經(jīng)細胞中參與思維的基因表達異常時，外周血cfDNA的甲基化譜將可能早于常規(guī)的行為學(xué)和生化檢測指標[44]。

因為基因組主要定性組成生命的元器件，甲基化譜則定量各元器件在生命活動中的實時參與程度[13]。一方面，從更廣的視野上，人類有望利用甲基化譜對多種能力如運動、音樂、繪畫、管理等進行量化評估；另一方面，甲基化譜技術(shù)對植物育種，同樣具有實用價值。一個甲基化譜技術(shù)，可以連通整個真核生物世界[45]，為構(gòu)建包括人類健康、動植物健康以及環(huán)境健康在內(nèi)的大健康生態(tài)打通航道、揚起風帆。

從千萬年蠻荒時代走來，得益于一代又一代科學(xué)家的努力，人類終于在20世紀50年代發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，盡管最早發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)——X射線衍射照片的富蘭克林女士因為晚期癌癥去世，未能與沃森和克里克分享諾貝爾獎的殊榮，但DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，讓我們進入了基因組時代，進入了后基因組時代，進入了表觀遺傳學(xué)時代。新年伊始，Nature和Nature Genetics又分別以“正常人細胞甲基化譜”和“DNA甲基化提供了復(fù)雜性狀背后的分子聯(lián)系”開篇[46-47]。正常細胞甲基化譜的完成，為腫瘤甲基化譜的確定起到了加速作用，我們有理由期待，我們有理由相信，因為用于血液游離核酸甲基化譜分析技術(shù)的出現(xiàn)，因為游離核酸甲基化譜的廣泛應(yīng)用，迎接我們的，將是一個更加健康、更加美好的燦爛明天。

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（本文編輯? 匡靜之）