木霉與椰子水復配中量元素水溶肥促進黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長

徐寧 徐秋實 王劍寧 施雨桐 劉震 劉銅

摘 要：木霉菌在綠色農業(yè)病害防控中是一種重要的生防功能微生物，普遍開發(fā)為木霉菌劑用于生物防治、生物肥料及土壤改良劑。傳統(tǒng)木霉菌劑的開發(fā)局限于木霉菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化等，因此探索木霉菌新型應用方式具有重要的意義。椰子水在椰子工業(yè)生產中因其不耐儲存、運輸及開發(fā)成本高常作為廢棄物直接排放丟棄。本研究以木霉孢子粉和熱帶廢棄椰子水為材料，將廢棄椰子水與木霉孢子粉復配成中量元素水溶肥，探究該水溶肥對黃瓜種子萌發(fā)與黃瓜幼苗生理指標的影響。結果表明：椰子水中添加中量元素并調整pH 7 對木霉產孢效果最好，產孢量達到2.32107 CFU/mL；木霉與椰子水復配中量元素水溶肥（A 處理）和椰子水與木霉復配水溶肥（B 處理）黃瓜種子萌發(fā)率分別為94.44%、87.50%，相對于無菌水（CK）提高了28.30%、18.87%，顯著促進黃瓜種子的萌發(fā)。盆栽試驗表明A 處理株高與根長分別為24.01、27.76 cm，較CK 分別提高48.03%、47.27%，顯著促進黃瓜幼苗的生長；同時該處理組黃瓜幼苗莖鮮重與莖干重以及根鮮重與根干重也顯著高于CK。進一步測定黃瓜幼苗的總葉綠素、還原糖與可溶性蛋白含量以及過氧化物酶（POD）與過氧化氫酶（CAT）活性，相較于CK 分別提高97.46%、66.32%、58.85%、32.67%、40.31%；并且能顯著降低丙二醛（MDA）含量，較CK 降低79.96%。綜上，木霉與椰子水復配中量元素水溶肥處理組可以顯著促進黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長，提高了幼苗的總葉綠素、還原糖、可溶性蛋白含量以及POD 和CAT 活性，降低MDA 含量，增強黃瓜抵抗逆境脅迫的能力。

關鍵詞：木霉；椰子水；水溶肥；黃瓜

中圖分類號：S147.5 文獻標識碼：A

椰子水是椰子果實腔內的液體胚乳[1]，其主要成分有糖、維生素、生長促進因子、蛋白質和氨基酸等，具有較高的營養(yǎng)和保健價值[2-3]。然而在椰子產品的加工過程中因為椰子水不耐儲存、運輸及開發(fā)成本高等問題常作為廢棄物直接傾倒、遺棄，無法有效將廢棄椰子水大規(guī)模利用。

據(jù)統(tǒng)計，我國年加工椰子約25 億個，每年廢棄椰子水約6.25105～6.25106 t[4]。因椰子水中含有促生長因子，可將其加工制作成發(fā)酵基質以促進微生物的生長[5]。廢棄椰子水中含有脂質、懸浮固體和揮發(fā)性脂肪酸，直接排放易造成環(huán)境微生物群落失衡、pH 變化，對環(huán)境安全有著極大的威脅。

因此合理開發(fā)利用椰子水，減少過度廢棄對環(huán)境造成的污染是海南椰子產業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。

木霉（Trichoderma spp.）是自然界廣泛存在的生防功能微生物，具有促進植物生長、誘導并增強植物抗逆性等功能[6]。研究表明，使用木霉等有益微生物可能會促進作物的初級或次級代謝，提高作物產量[7-8]，改善作物品質[9]。研究報道木霉能與廢棄物復配促進作物生長并提高產量。ARAUJO 等[10]發(fā)現(xiàn)污水污泥生物炭和哈茨木霉聯(lián)合使用對大豆的產量具有增效作用。在木霉與水稻秸稈提取物中添加一定量的污泥水解物能夠促進黃瓜和小白菜生長[11]。

氨基酸水溶肥具有能被植物快速吸收，增加作物產量和改善果實品質等優(yōu)勢，能有效減少農業(yè)生產中大量施用無機化肥和農藥造成的環(huán)境污染[12]和農藥殘留等問題。隨著人們生態(tài)環(huán)保意識的不斷深化，氨基酸水溶肥的研究和應用越來越受到人們的重視[13]。目前木霉與椰子水復配成水溶肥的研究尚未見報道，單一施用木霉菌劑的效果并不理想，為了合理利用廢棄椰子水，減少環(huán)境污染，同時挖掘木霉與氨基酸水溶肥復配的潛力，本研究將木霉與椰子水復配成中量元素水溶肥，探究木霉和廢棄椰子水復配在農業(yè)生產中的應用，為推動綠色、高效的木霉水溶肥開發(fā)以及廢棄椰子水的利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試作物為成都好特園藝有限公司川綠十一號黃瓜種子。供試菌株：Trichoderma asperellumFJ069（由海南省綠色農用生物制劑工程研究中心提供），已保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為CGMCCNo.17976。供試椰子水：海南工業(yè)廢棄椰子由椰樹集團提供。供試土壤：PINDSTRUP 草炭土。

供試 PDA 培養(yǎng)基[14]：200 g 馬鈴薯煮熟后濾液，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，ddH2O 定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 木霉孢子懸浮液制備將供試菌株T. asperellumFJ069 接種在PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃光照培養(yǎng)5 d 后，刮取平板上的木霉孢子，用無菌水調整孢懸液濃度為1.0109 CFU/mL。

1.2.2 椰子水和中量元素對木霉產孢量的影響為探究椰子水和中量元素對木霉菌產孢能力的影響，試驗共設置6 個處理組：（1）Y-Z（pH 7）：椰子水與中量元素復配并調整pH 7 ， 氯化鈣58.275 g，硝酸鎂55.5 g，椰子水定容至1 L；（2）Y-Z：椰子水與中量元素復配不調整pH，氯化鈣58.275 g，硝酸鎂55.5 g，椰子水定容至1 L；（3）Y（pH 7）：椰子水并調整pH 7；（4）Y：椰子水不調整pH；（5）Z：中量元素，氯化鈣58.275 g，硝酸鎂55.5 g，ddH2O 定容至1 L；（6）CK：無菌水。將上述處理組與1.0109 CFU/mL 木霉孢子懸浮液混合，搖勻后室溫放置12 h，在無菌工作臺均勻地涂布于PDA 固體培養(yǎng)基平板，每個處理組設置3 個重復，于28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后，用1 mL無菌水沖洗刮取不同處理組的PDA 平板，在光學顯微鏡下利用血球計數(shù)板計算木霉孢子數(shù)量。

1.2.3 木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜發(fā)芽率的影響設置如下5 個供試各處理水溶肥配方。（1）處理A（木霉與椰子水復配中量元素）：T. asperellum FJ069 孢子含量1.0×109 CFU/mL，氯化鈣58.275 g，硝酸鎂55.5 g，椰子水（pH 7）定容至1 L；（2）處理B（椰子水與木霉復配）：T. asperellum FJ069 孢子含量1×109 CFU/mL，椰子水（pH 7）定容至1 L；（3）處理C（單施椰子水）：椰子水（pH 7）1 L；（4）處理D（單施木霉）：T. asperellum FJ069 孢子含量1×109 CFU/mL；（5）處理E（單施中量元素）：氯化鈣58.275 g，硝酸鎂55.5 g，ddH2O（pH 7）定容至1 L。

按照上述水溶肥配方設置 A、B、C、D、E處理，以無菌水為CK，共6 個處理組，探究各處理水溶肥對黃瓜發(fā)芽率的影響。預先用3%次氯酸鈉將黃瓜種子消毒10 min，每個處理24 顆黃瓜種子，試驗重復3 次。將黃瓜種子置于28 ℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d 后調查黃瓜種子發(fā)芽率。

1.2.4 木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜幼苗生長生理指標測定將育苗基質草炭土于烘箱中181 ℃高溫滅菌2 h，自然冷卻后備用。將黃瓜種子用3%次氯酸鈉消毒10 min，并催芽，催芽3 d 后將幼芽置于育苗盤中培養(yǎng)2 周，待黃瓜長出3 片真葉后選取長勢一致的黃瓜幼苗移栽至育苗盆中培養(yǎng)7 d，再分別用A、B、C、D、E 五個處理，以無菌水為CK 灌根處理黃瓜幼苗，處理14 d 后調查黃瓜幼苗的莖長、根長、鮮重、干重以及黃瓜幼苗中總葉綠素含量、還原糖含量、可溶性蛋白含量、MDA 含量以及POD 和CAT 活性，其中可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法[15]，總葉綠素含量、還原糖含量、MDA 含量以及POD和CAT 活性均采用Solarbio 試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2016 和IBM SPSS Statistics 25 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用最小顯著差異法（leastsignificant difference， LSD）檢驗進行多重比較；使用GraphPad Prism 9.3.1 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 椰子水與中量元素對木霉菌產孢量的影響

如圖 1 所示，Y-Z（pH 7）和Y（pH 7）對木霉菌產孢效果較好，第5 天產孢量分別為2.32107、2.06107 CFU/mL，和其他處理組相比存在顯著差異。其中Y（pH 7）處理與Y 處理存在極顯著差異（圖1）。上述結果表明木霉菌在pH 達到中性條件下的椰子水中的產孢效果最好。

2.2 木霉與椰子水復配中量元素對黃瓜萌發(fā)率的影響

如圖 2 所示，試驗結果表明A、B 處理萌發(fā)率分別為94.44%、87.50%，相較CK 分別提高28.30%、18.87%，顯著促進黃瓜種子的萌發(fā)；A處理與C、D、E 處理組相比，存在極顯著差異，萌發(fā)率顯著提高，同時C、D、E 處理與CK 差異不顯著，說明單施椰子水、木霉和中量元素對黃瓜種子的萌發(fā)效果并不理想；其中A、B 兩處理差異不顯著，說明在木霉與椰子水復配中量元素水溶肥中促進黃瓜種子萌發(fā)的主要因素在于木霉與椰子水的協(xié)同增效作用，可以顯著提高黃瓜種子的萌發(fā)率，促進黃瓜種子萌發(fā)。

2.3 木霉與椰子水復配中量元素對黃瓜幼苗生理水平的影響

2.3.1 木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜幼苗生長的影響通過對黃瓜幼苗的株高調查發(fā)現(xiàn)（圖3，表1），各處理組相較于CK 差異極顯著，A、B、E 處理分別提高48.03%、40.51%、39.09%，A、B 兩處理差異不顯著； A 處理根長與其它處理組存在極顯著差異，相較于B 處理提高21.97%，同時A、B、C、D 處理與CK 同樣存在極顯著差異，分別提高47.27%、20.74%、14.80%、12.20%，E 處理與CK 差異不顯著。以上結果說明椰子水、木霉和中量元素單施或者復配均可以顯著提高黃瓜幼苗株高，復配效果最好；木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜幼苗根系生長具有顯著促進作用，中量元素對于黃瓜幼苗的作用效果主要集中于莖葉，對于根系無明顯促進作用。

2.3.2 木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜幼苗鮮重與干重的影響如表 1 所示，各處理組相對于CK 莖鮮重存在極顯著差異，A、B、C、D、E 處理分別提高52.61%、12.85%、17.67%、18.47%、19.00%，其中A 處理顯著高于其它處理組，B、C、D、E 處理之間差異不顯著；對黃瓜幼苗的根鮮重（表1）調查發(fā)現(xiàn)，各處理組較CK存在極顯著差異，A、B 兩處理分別較CK 提高35.87%、28.80%，D 處理與C、E 兩處理差異不顯著；由表1 莖干重結果可知，除C 處理外其余處理組相對于CK 存在極顯著差異，其中A、B兩處理之間無顯著差異，分別較CK 分別提高32.39%、28.17%；據(jù)表1 根干重結果所示，A 處理較其它處理組差異極顯著，高于B處理10.00%，相對CK 提高120.00%，C 處理與D、E 兩處理差異不顯著。以上結果表明，木霉與椰子水復配中量元素水溶肥能顯著提高黃瓜幼苗莖、根鮮重與莖、根干重，椰子水、木霉和中量元素三者復配要顯著好于單施效果，三者的協(xié)同增效作用可以顯著促進黃瓜幼苗根莖生長，提高根莖生物量的積累。

2.3.3 木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜幼苗總葉綠素和還原糖含量的影響如圖 4 所示，5 個處理組總葉綠素含量與CK 相比均有顯著性提升，其中A 處理的效果最佳，達到33.43 mg/L，相較CK 提高97.46%，與其它處理組均存在極顯著差異。B 處理顯著高于C、D 處理組，分別增加34.66%、9.17%；由圖4 可知，A、B、D、E處理組黃瓜幼苗還原糖含量與CK 相比均有顯著提升，分別提高66.32%、46.84%、28.95%、24.74%，其中D、E 兩處理差異不顯著，同時C處理與CK 無顯著差異。上述結果表明各處理對于總葉綠素和還原糖含量的影響趨勢基本一致，其中以A 處理效果最好，說明木霉與椰子水復配中量元素水溶肥能顯著促進黃瓜幼苗總葉綠素和還原糖的產生，另外C 處理總葉綠素含量在各處理相較于CK 中差異最小，在還原糖含量中無差異，表明在木霉、椰子水和中量元素三者中促進黃瓜幼苗總葉綠素和還原糖產生的主要因素在于木霉和中量元素的共同作用。

2.3.4 木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜幼苗可溶性蛋白和丙二醛含量的影響由圖 5 可知，A、B、C、D 處理與CK 可溶性蛋白含量相比存在極顯著差異，分別增加58.85%、24.73%、14.07%、14.50%，其中A 處理相較于其它處理對于提升可溶性蛋白含量的效果最為顯著，B、C、D 處理之間差異不顯著，說明木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對于黃瓜幼苗產生可溶性蛋白的效果要好于三者單施以及椰子水與木霉復配；如圖5 所示，各處理組相較CK 均能顯著降低黃瓜幼苗丙二醛的產生，A、B、C、D、E 處理分別降低79.96%、68.22%、22.34%、68.63%、39.75%，C 處理降幅最小，說明椰子水相較木霉和中量元素對于減少黃瓜幼苗MDA 含量的影響效果最小，MDA 含量水平的高低可以作為考察黃瓜幼苗受到脅迫嚴重程度的指標之一，直接反映黃瓜葉片膜脂過氧化程度。在CK 中以無菌水處理的黃瓜幼苗正常生長的生理水平下，木霉、椰子水和中量元素不論單施還是復配均能減少MDA的產生，減弱膜脂過氧化程度，減少脂質過氧化對黃瓜幼苗的傷害。

2.3.5 木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜幼苗過氧化物酶與過氧化氫酶活性的影響如圖6 所示，A、B、D、E 處理的過氧化物酶（POD）活性與CK 相比均顯著提高，分別提高32.67%、25.85%、11.45%、17.25%，其中以A、B 處理的POD 活性最高，顯著高于C、D、E 處理組。由圖6 可知，各處理過氧化氫酶（CAT）活性相對CK 均存在極顯著差異，分別增加40.31%、35.34%、12.52%、20.85%、18.16%，A 處理CAT活性為7 5 6.97 U/ g ， B 處理CAT 活性為730.13 U/g，均顯著高于C、D、E 處理，但A、B處理之間差異并不顯著。上述結果中各處理分別對黃瓜幼苗POD 和CAT 活性的影響接近一致，椰子水、木霉和中量元素三者復配相較于單施對于黃瓜幼苗抗氧化酶活性的提高均有顯著影響，表明木霉與椰子水復配中量元素水溶肥有利于提高黃瓜幼苗POD 和CAT 活性，增強ROS 的清除能力。

3 討論

木霉是目前應用最為廣泛的生防真菌之一，能有效促進作物生長[16]。研究發(fā)現(xiàn)，木霉對玉米苗期的根系、株高、鮮重和干重等生長指標都有顯著的提高作用[17]；還可以促進黃瓜種子萌發(fā)、幼苗生長和生物量積累[18]。椰子水中含有促生長因子等營養(yǎng)物質，可將其加工制作成發(fā)酵基質以促進微生物的生長[5]。有研究表明，利用廢棄椰子水處理后可以顯著提高木霉的孢子含量[19]；同時椰子水可以等效替代馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基促進木霉菌絲生長[20]；VIJI 等[21]發(fā)現(xiàn)椰子水基質可以增加T. asperellum 的菌落數(shù)量。中量元素是植物生長過程中所必須的元素，在水溶肥中添加中量元素能夠為作物補充鈣、鎂等營養(yǎng)元素，改善作物的品質，提高作物的產量。孟素梅等[22]發(fā)現(xiàn)中量元素水溶肥對水稻增產效果顯著；何峰等[23]研究表明中量元素水溶肥能促進黃瓜果實膨大及增長，提高果實品質，增加產量。本研究結果表明，椰子水和中量元素復配并調整pH=7 時相較于CK對T. asperellum FJ069 的產孢效果提升顯著，第5天產孢量達到2.32107 CFU/mL，另外Y-Z（pH 7）、Y（pH 7）處理的產孢量均高于未調整pH 的Y-Z、Y處理；與研究報道的結果一致，說明椰子水和中量元素復配能促進木霉產孢，并且在中性環(huán)境下效果更為顯著。椰子水中含有豐富的氨基酸[3]，中量元素和中性環(huán)境的存在為木霉提供了產孢所需的充足條件，使木霉與椰子水復配中量元素成為可能。目前尚未有研究報道木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對作物生長的影響，因此本研究以廢棄椰子水再利用為出發(fā)點，探究椰子水與中量元素復配對木霉產孢的影響以及木霉與椰子水復配中量元素水溶肥對黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。

有研究表明，木霉與椰子水分別處理植物種子均能顯著促進萌發(fā)，提高發(fā)芽率。謝琳淼等[24]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉提取液對紫羊茅和草地早熟禾種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等都有顯著提升。丁長春等[25]發(fā)現(xiàn)添加10%的椰子水會增加黃兜蘭種子的萌發(fā)率。在培養(yǎng)基中添加椰子水可以提高鳳蘭種子的發(fā)芽速率[26]。本研究結果也發(fā)現(xiàn)木霉與椰子水復配中量元素水溶肥（A 處理）、椰子水與木霉復配水溶肥（B 處理）相較于CK 均顯著提高黃瓜種子萌發(fā)率，分別提高28.30%、18.87%，其中A、B 兩處理差異不顯著，說明在木霉與椰子水復配中量元素水溶肥中促進黃瓜種子萌發(fā)的主要因素在于木霉與椰子水的協(xié)同增效作用。

生物水溶肥將傳統(tǒng)水溶肥與微生物菌劑結合在一起，是目前以綠色農業(yè)發(fā)展為背景下的大勢所趨，生物水溶肥相對于傳統(tǒng)肥料的優(yōu)點在于能節(jié)約水肥資源、減少環(huán)境污染、促生抗病等[27]。

研究報道，生物水溶肥能顯著促進作物生長、提高作物產量并提升果實品質。劉純安[28]研究表明沖施含木霉氨基酸生物水溶肥可以顯著促進茄子植株生長，提高茄子產量并改善果實品質。LIU等[29]基于T. guizhouense NJAU4742 添加氨基酸水溶肥能顯著促進辣椒生長；張常書等[30]用木霉生物腐植酸水溶性肥代替化肥用于瓜果蔬菜根施或沖施追肥，黃瓜產量較化肥提高23.5%～38.4%，草莓、西葫蘆、西蘭花產量提高10%～15%；嚴程明等[31]發(fā)現(xiàn)氨基酸水溶肥可以顯著提高苗期玉米根系干物重、地上部干物重、株高和莖粗。盧云峰等[32]發(fā)現(xiàn)復合微生物液體肥料能顯著提高玉米和白菜的產量。本研究結果符合以上研究報道，木霉與椰子水復配中量元素水溶肥（A 處理）相較于CK 顯著促進黃瓜幼苗的生長，株高、根長提高48.03%、47.27%；E 處理（單施中量元素）株高相對于CK 促進效果顯著，而對于根長無顯著差異，表明中量元素對于黃瓜幼苗的作用效果主要集中于莖葉，對于根系無明顯促進作用。A處理中莖鮮重、根鮮重、莖干重和根干重相較CK存在極顯著差異，分別增加52.61%、35.87%、32.39%、120.00%，并且A 處理始終顯著高于C、D、E 處理，結果表明木霉與椰子水復配中量元素水溶肥能顯著提高黃瓜幼苗莖、根鮮重與莖、根干重，椰子水、木霉和中量元素三者復配要顯著好于單施效果，三者的協(xié)同增效作用可以顯著促進黃瓜幼苗根莖生長，提高根莖生物量的積累。

總葉綠素、還原糖、可溶性蛋白等都是反映植物生理狀況的重要指標；丙二醛（MDA）是膜脂過氧化物的重要產物，其含量的變化可以反映植物細胞膜脂過氧化的水平及細胞損傷的程度[33]。過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）是植物體內重要的抗氧化酶，具有清除活性氧自由基、抵御和修復逆境損傷的作用，是植物體內一類重要的生理活性物質[34]。有研究報道表明，氨基酸生物水溶肥的沖施顯著提高了茄子的還原糖、可溶性蛋白含量，改善了茄子的品質[28]；施用水溶肥能提高黑塌菜葉綠素、還原糖含量[35]；氨基多糖水溶肥明顯提高小麥可溶性蛋白含量，提高POD 的活性，降低MDA 含量[34]；王瑋等[33]發(fā)現(xiàn)適宜濃度的氨基多糖水溶肥可以增強蘿卜葉片的抗氧化酶（POD、CAT）活性，降低MDA含量，提高蘿卜肉質根中可溶性總糖、可溶性蛋白含量；曹焱[36]報道氨基酸水溶肥能降低草莓葉片MDA 含量，提高過氧化物酶和過氧化氫酶活性；李艷娟等[37]發(fā)現(xiàn)2 種不同濃度哈茨木霉與綠色木霉溶液不但可以促進杉木種子萌發(fā)及生長，還可以提升其抗氧化酶活性，降低MDA 含量。

以上研究表明，木霉和水溶肥都可以促進植物生長，優(yōu)化生理指標，降低MDA 含量，提高抗氧化酶活性，這使得木霉與椰子水復配中量元素水溶肥成為了可能。本文研究結果與上述報道相一致，結果表明木霉與椰子水復配中量元素水溶肥相較CK 可以顯著提高黃瓜幼苗總葉綠素、還原糖、可溶性蛋白含量以及POD 和CAT 活性并降低MDA 含量。

綜上所述，木霉與椰子水復配中量元素水溶肥能顯著提高黃瓜種子萌發(fā)，促進幼苗生長并提高黃瓜葉片總葉綠素、還原糖、可溶性蛋白含量以及POD 和CAT 活性，降低MDA 含量，增強黃瓜抵抗逆境脅迫的能力。

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