黃鱔HSP70理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的生物信息學分析

楊文林　魏紅波　楊代勤

摘要：為了研究黃鱔（Monopterus albus）熱休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，簡稱HSP70）的結(jié)構(gòu)和功能，試驗采用生物信息學方法對黃鱔HSP70的基本理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽、磷酸化位點、糖基化、無序化特征、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)及進化樹進行了研究。結(jié)果表明，黃鱔HSP70由441個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為48146.31，等電點為5.98，整體呈堿性，是較穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，有信號肽，但不存在跨膜結(jié)構(gòu)，屬于分泌型蛋白質(zhì)。黃鱔HSP70存在35個潛在磷酸化位點，其中包括19個Ser、14個Thr和2個Tyr磷酸化位點，有5個典型的N糖基化位點。二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋（39.68％）、延伸鏈（20.41％）、β-折疊（6.58％）和無規(guī)則卷曲（33.33％）為主要結(jié)構(gòu)。熱休克蛋白70（HSP70）作為分子伴侶，在蛋白質(zhì)折疊和運輸、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和精子發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，黃鱔HSP70在抵抗外界應(yīng)激源、環(huán)境應(yīng)激保護等方面起著重要作用。

關(guān)鍵詞：黃鱔（Monopterus albus）；熱休克蛋白70（HSP70）；理化性質(zhì)；分子結(jié)構(gòu)；生物信息學分析

中圖分類號：S963.7文獻標志碼：A

熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是一個保守的細胞蛋白家族，存在于從細菌到哺乳動物[1]的所有生物體中。熱休克蛋白在正常條件下和應(yīng)激條件下都起著重要的生物學作用[2]。在正常情況下，熱休克蛋白作為分子伴侶，參與蛋白質(zhì)折疊和運輸、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和精子發(fā)生[3]。當生物體受到應(yīng)激源時，如存在溫度、溶解氧水平和滲透壓的變化，以及重金屬和微生物感染時，熱休克蛋白的表達顯著增加，使其能夠抵抗這些應(yīng)激源，并維持穩(wěn)態(tài)[4]。

根據(jù)其分子量，HSPs可分為HSP110（HSPH）、HSP90（HSPC）、HSP70（HSPA）、HSP60（HSPD）和小HSPs（HSPB）。在熱休克蛋白中，熱休克蛋白70（HSP70）家族是最保守的家族之一[5]。HSP70家族包含兩個不同的基因，一個是誘導型HSP70，另一個是構(gòu)成型HSC70（熱休克同源基因70）[6]。如在人、羊、鼠、魚、蝦、水稻和小麥等物種中均有廣泛研究。研究證明HSP70會在人類腫瘤細胞中廣泛表達，并且涉及腫瘤細胞的增殖、入侵、轉(zhuǎn)移和凋亡[7]。在山羊中，急性熱應(yīng)激能增加山羊血清TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子含量，可能與HSP70家族基因介導了熱應(yīng)激導致山羊炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)控過程有關(guān)[8]。在魚類中，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激使HSP70在魚類體內(nèi)的合成速度顯著增加，以提高魚類的抗應(yīng)激能力，同時也會使caspase-3基因被激活，誘導細胞發(fā)生凋亡[9]。在小麥中，HSP70可以顯著提升小麥在脅迫后的抗氧化酶活性，從而參與小麥對脅迫的應(yīng)答過程[10]。在水稻中，HSP70在水稻應(yīng)對稻瘟病菌脅迫中具有重要作用[11]。據(jù)報道，HSP70可激活先天免疫，并在應(yīng)激誘導損傷[12]中對應(yīng)激的適當反應(yīng)和生存中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HSP70家族的成員還參與了胚胎和性腺的發(fā)育、精子的發(fā)生，以及對環(huán)境應(yīng)激的保護。

目前，HSP70在人、羊、鼠、魚、蝦、水稻和小麥等常見動植物方面均有研究，但在黃鱔中的研究較少。該研究利用生物信息學方法對黃鱔HSP70的基本理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽、磷酸化位點、糖基化、無序化特征、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和進化樹等進行預測和分析，為后續(xù)的黃鱔HSP70研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黃鱔HSP70基因（XM_020600302.1）及氨基酸序列（XP_020455958.1）在美國國家生物信息中心NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中查詢得到。

1.2 方法

利用表1中的在線軟件工具對黃鱔HSP70的基本理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽、磷酸化位點、糖基化、無序化特征、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和進化樹進行預測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSP70基本理化性質(zhì)分析

使用ProtPARam在線軟件[13]對黃鱔HSP70進行基本理化性質(zhì)分析，得出該段氨基酸序列總共編碼441個氨基酸，相對分子質(zhì)量為48146.31，由2162個碳（C）原子、3469個氫（H）原子、589個氮（N）原子、638個氧（O）原子、7個硫（S）原子組成，推測其分子式為C2162H3469N589O638S7，其等電點PI=5.98，不穩(wěn)定系數(shù)為39.60，親水性平均值為-0.001，消光系數(shù)為18910M-1cm-1，因此推測該蛋白為堿性、較穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。20種氨基酸含量由高到低排序依次是亮氨酸Leu（11.3%）、纈氨酸Val（9.3%）、甘氨酸Gly（8.4%）、丙氨酸Ala（7.7%）、谷氨酸Glu（7.3%）、異亮氨酸Ile（6.3%）、絲氨酸Ser（6.1%）、精氨酸Arg（5.4%）、脯氨酸Pro（5.4%）、蘇氨酸Thr（5.4%）、谷氨酰胺Gln（4.8%）、苯丙氨酸Phe（4.5%）、天冬酰胺Asn（4.3%）、賴氨酸Lys（4.3%）、天冬氨酸Asp（3.6%）、絡(luò)氨酸Tyr（2.0%）、組氨酸His（1.8%）、甲硫氨酸Met（1.4%）、半胱氨酸Cys（0.2%）、色氨酸Trp（0.2%）。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、生理功能和作用機制的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的酸堿性作為蛋白質(zhì)的重要理化性質(zhì)之一，其酸堿性是由蛋白質(zhì)側(cè)鏈上酸性氨基酸和堿性氨基酸上帶有的可解離的基團所決定的，這些可解離基團可以決定蛋白質(zhì)的酸堿性，因此蛋白質(zhì)的酸堿性取決于該蛋白中酸性氨基酸與堿性氨基酸的數(shù)量之比[14]。蛋白質(zhì)的等電點主要是由可電離氨基酸的pKR值決定的，而且也受其氨基酸組成及分子量分布的影響[15]。

影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的原因有很多，如脫酰胺反應(yīng)會導致其親水性發(fā)生改變，蛋白質(zhì)氧化作用會導致蛋白質(zhì)失活或聚集等，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可以通過蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)來進行預測，若蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，則該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，若蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，則該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)[16]。蛋白質(zhì)的消光系數(shù)指的是蛋白質(zhì)對某段波長光的吸收能力，且與該蛋白質(zhì)中半胱氨酸的數(shù)量有較大關(guān)系[17]，在HSP70中只存在一個半胱氨酸，蛋白質(zhì)中沒有二硫鍵，所以HSP70的消光系數(shù)僅為18910M-1cm-1。

2.2 HSP70親/疏水性分析

利用在線軟件ProtScale[18]對黃鱔HSP70親/疏水性進行預測分析，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)K-D標度定義疏水性氨基酸較高打分值>0表示疏水性，<0表示親水性得出，黃鱔HSP70有22個區(qū)域具有疏水性，最強疏水區(qū)在Gly9～Leu16區(qū)間，疏水區(qū)最強位點為第12位的異亮氨酸，分值為2.689；HSP70有15個區(qū)域具有親水性，最強親水區(qū)在Asp178～Asn183親水區(qū)最強位點為180位的精氨酸，分值為-2.778。

氨基酸的親/疏水性的分布對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的作用。親水性氨基酸和疏水性氨基酸能預測蛋白質(zhì)跨膜的位置，疏水氨基酸的疏水基團可以構(gòu)成疏水的二級結(jié)構(gòu)便于蛋白質(zhì)的跨膜形成更高級結(jié)構(gòu)，是維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及驅(qū)動蛋白質(zhì)折疊的最主要的動力，疏水性氨基酸也常作為水溶性蛋白質(zhì)的內(nèi)部支撐結(jié)構(gòu)[19]。

2.3 HSP70信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)分析

利用在線程序SignalP5.0對HSP70進行信號肽預測分析，結(jié)果如圖2所示。黃鱔HSP70信號肽分析發(fā)現(xiàn)在20～24位氨基酸之間存在裂解位點，存在信號肽，故推測該蛋白為分泌型蛋白質(zhì)，結(jié)合其親/疏水性分析發(fā)現(xiàn)20～25位氨基酸為疏水性氨基酸，表明HSP70前段信號肽的疏水性較強。信號肽處于蛋白質(zhì)N端，是引導新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，對蛋白質(zhì)的引導和定位起著重要的作用，是分泌型蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學功能不可或缺的一部分。

利用在線程序TMHMM2.0對HSP70進行跨膜結(jié)構(gòu)預測分析，結(jié)果如圖3所示。黃鱔HSP70跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)HSP70不存在跨膜結(jié)構(gòu)，所以推測HSP70在細胞外或細胞膜表面發(fā)揮其生物學功能，不通過跨膜發(fā)揮生物學作用。跨膜結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)跨越細胞膜的通道，對蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能和蛋白質(zhì)的定位具有重要作用。

2.4 HSP70的磷酸化位點

通過在線程序NetPhos3.1對HSP70進行預測分析，結(jié)果如圖4所示。通過對黃鱔HSP70的磷酸化位點分析表明，HSP70有35個潛在磷酸化位點，其中包括19個Ser、14個Thr和2個Tyr磷酸化位點。結(jié)果分析表明，HSP70存在多個磷酸化位點，這些位點可能是調(diào)控HSP70活性的靶位點。

蛋白質(zhì)的磷酸化指的是通過蛋白激酶催化，把磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程，蛋白質(zhì)的磷酸化主要集中在肽鏈中的絲氨酸、蘇氨酸和絡(luò)氨酸等殘基上，當磷酸化作用后，使蛋白質(zhì)帶有了電荷，從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進一步引起蛋白質(zhì)活性的變化，蛋白質(zhì)的磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的重要機制[20]。

2.5 HSP70的糖基化分析

通過在線程序NetNGlyc對HSP70的糖基化位點進行預測分析，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果分析表明，黃鱔HSP70有5個典型的N糖基化位點，分別位于126、136、183、297、397位，此范圍內(nèi)有多個糖基化修飾位點，預測該區(qū)段內(nèi)的氨基酸對HSP70發(fā)揮其生物學功能具有重要的意義。

糖基化的主要作用是在蛋白質(zhì)成熟過程中折疊成正確的構(gòu)想和增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是由糖基轉(zhuǎn)移酶催化的單糖與蛋白質(zhì)上的某些殘基形成共價連接，是蛋白質(zhì)的一種重要的翻譯后修飾，在蛋白質(zhì)的機構(gòu)和功能中發(fā)揮極其重要的作用[21]。

2.6 二級結(jié)構(gòu)預測及三級結(jié)構(gòu)同源建模

通過在線程序SOPMA對黃鱔HSP70的二級結(jié)構(gòu)進行預測分析，結(jié)果如圖6所示。預測結(jié)果表明，HSP70含有α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲四種結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲占比較大，分別為39.68％、33.33％，延伸鏈和β-折疊占比分別為20.41％、6.58％。

通過在線程序SWISS﹣MODEL對HSP70的三級結(jié)構(gòu)進行預測分析，得到HSP70的三級結(jié)構(gòu)圖（圖7），目標蛋白與模板蛋白結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.74±0.05，GMQE為0.69。黃鱔HSP70以α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)，圖中藍色表示α-螺旋、黃色表示無規(guī)則卷曲、紅色表示延伸鏈、綠色表示β-折疊。三級結(jié)構(gòu)圖中以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致。

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)通常包括蛋白質(zhì)一級、二級和三級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ)；二級結(jié)構(gòu)進一步盤繞、折疊成三級結(jié)構(gòu)，而蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)分子的早期折疊階段，是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)；蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)確定了蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并進一步影響蛋白質(zhì)的功能特性[22]。蛋白質(zhì)生物功能的行使與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其功能調(diào)控也主要依賴于蛋白質(zhì)構(gòu)象和相互作用的動態(tài)調(diào)節(jié)[23]。

2.7 進化樹分析

在NCBI搜索到HSP70在人、黃牛、家鼠、野豬、雞、中華鱉和大黃魚中的同源序列，在利用Clustal Omega軟件進行同源序列比對后，利用MEGA-X軟件構(gòu)建進化樹，結(jié)果如圖8所示，HSP70基因的進化樹分為兩大支，黃鱔一支，其他七個物種一支，黃鱔與其他幾個物種的親緣關(guān)系都比較遠，而人與黃牛較近，其次是家鼠，再者是野豬；雞與中華鱉之間較近，其次是大黃魚。

3 討論

該研究在生物信息學的基礎(chǔ)上通過各種生物信息分析軟件對黃鱔HSP70的基本理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點、糖基化、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行分析和預測。分析結(jié)果表明，在黃鱔HSP70中亮氨酸Leu、纈氨酸Val等的含量最高，半胱氨酸Cys和色氨酸Trp的含量最低，在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中，亮氨酸等水溶性氨基酸常作為水溶性蛋白質(zhì)的內(nèi)部支撐結(jié)構(gòu)，而半胱氨酸所形成的二硫鍵對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用，可推測黃鱔HSP70穩(wěn)定性較低，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的酸堿性是由蛋白質(zhì)側(cè)鏈上酸性氨基酸和堿性氨基酸上帶有的可解離的基團所決定的，這些可解離基團可以決定蛋白質(zhì)的酸堿性，因此蛋白質(zhì)的酸堿性取決于該蛋白中酸性氨基酸與堿性氨基酸的數(shù)量之比，在黃鱔HSP70中堿性氨基酸的數(shù)量遠多于酸性氨基酸的數(shù)量，可推測黃鱔HSP70為堿性蛋白質(zhì)，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的消光系數(shù)與蛋白質(zhì)中半胱氨酸的數(shù)量有較大關(guān)系，在黃鱔HSP70中半胱氨酸僅占該精氨酸總數(shù)的0.2％，所以黃鱔HSP70的消光系數(shù)較低，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

黃鱔HSP70親/疏水性分析發(fā)現(xiàn)，20～25位氨基酸為疏水性氨基酸，表明HSP70前段信號肽的疏水性較強。分析表明黃鱔HSP70不存在跨膜區(qū)，所以推測HSP70在細胞外或細胞膜表面發(fā)揮其生物學功能，不通過跨膜發(fā)揮生物學作用[19]。

蛋白質(zhì)的磷酸化是生物體內(nèi)重要的共價修飾方式之一，與信號轉(zhuǎn)導、基因表達以及細胞生長發(fā)育等眾多生物體機制調(diào)控起著重要作用，在磷酸化反應(yīng)中，蛋白質(zhì)的酯化作用會導致其構(gòu)型和生物活性發(fā)生改變[20]。對黃鱔HSP70磷酸化位點預測分析發(fā)現(xiàn)存在多個磷酸化位點，這些位點可能是調(diào)控黃鱔HSP70生物活性的靶位點。

蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化都是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的組成部分，在細胞免疫、信號傳導、蛋白翻譯調(diào)控、蛋白降解等諸多生物過程中也起著重要作用[24]。根據(jù)黃鱔HSP70的糖基化位點分析發(fā)現(xiàn)，糖基化位點分布在126～397位，可知發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)域可能在126～397位，其他的堿基可能主要起修飾蛋白質(zhì)的作用。

黃鱔HSP70的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，黃鱔HSP70以α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)。黃鱔HSP70的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)及其生物功能與其他生物HSP70相似。

在不同種屬的HSP70中，黃鱔HSP70與其他幾個物種親緣關(guān)系較遠，但除黃鱔HSP70外其余幾個物種HSP70關(guān)系較近，其序列也高度相似，屬于保守性蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)決定功能，故而可以推測除黃鱔外的幾個物種HSP70所行使的生物功能類似。

4 結(jié)論

該研究利用生物信息學分析的方法分析黃鱔HSP70的基本理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，結(jié)果得出黃鱔HSP70由441個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為48146.31，等電點為5.98，整體呈堿性、較穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，有信號肽，但不存在跨膜結(jié)構(gòu)，屬于分泌型蛋白質(zhì)。存在多個磷酸化和糖基化位點，二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)以α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)。該研究將為進一步研究黃鱔HSP70的結(jié)構(gòu)和功能提供參考。

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Bioinformatics analysis of physical and chemical properties and molecular structure of Monopterus albus HSP70

YANG Wenlin1，WEI Hongbo1，YANG Daiqin1，2

（1.College of Animal Sciences，Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei China; 2. Hubei Province Monopterus albus Technology Research Center， Jingzhou 434025， Hubei China）

Abstract：In order to study the structure and function of Monopterus albus Heat Shock Protein 70（HSP70）， bioinformatics methods were used to study the basic physical and chemical properties， hydrophilicity/hydrophobicity， signal peptides， phosphorylation sites， glycosylation， disorder characteristics， secondary structure， tertiary structure， interaction protein network and evolutionary tree of Monopterus albus Hsp70. The results showed that Monopterus albus HSP70 was composed of 441 amino acids， with a relative molecular weight of 48146.31 and an isoelectric point of 5.98. It was an alkaline， relatively stable hydrophilic protein with signal peptides， but no transmembrane structure， belonging to a secretory protein. There are 35 potential phosphorylation sites in Monopterus albus HSP70， including 19 ser， 14 thr and 2 Tyr phosphorylation sites， and 5 typical N-glycosylation sites. Secondary structure with α- Spiral（39.68%）， extended chain（20.41%） β- Folding（6.58%） and irregular curling （33.33%） are the main structures. As a molecular chaperone， Heat Shock Protein 70（HSP70） plays an important role in protein folding and transport， cell cycle regulation， apoptosis and spermatogenesis. These results indicate that eel HSP70 plays an important role in resisting external stressors and protecting environmental stress.

Keywords：Monopterus albus; HSP70; physical and chemical properties; molecular structure; bioinformatics analysis

基金項目：財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目（CARS-46）。

作者簡介：楊文林（1998- ），男，碩士研究生。研究方向：特色淡水魚類增養(yǎng)殖。E-mail：2587022061@qq.com。

通信作者：楊代勤（1966- ），男，教授。研究方向：特色淡水魚類增養(yǎng)殖學。E-mail：yangdaiq@163.com。