異槲皮苷-β-環(huán)糊精包合物的制備及溶解度研究

朱伶俐，周委

（1.武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，湖北武漢 430205；2.武漢市藥物增溶工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430205）

異槲皮苷（isoquercitrin，IQ）屬于黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、降糖、降血壓及清除自由基的作用，還具有植物雌激素活性，對(duì)癌癥、心血管疾病有一定的療效，因此常被用在藥物或健康食品中[1]。盡管異槲皮苷用途廣泛，但溶解度低，極大地限制了其在醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域的開發(fā)利用[2]。

β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）是近年來頗受歡迎的藥用輔料，由于其內(nèi)疏水外親水的性質(zhì)，能與很多藥物分子形成藥物分子膠囊，且價(jià)格低廉，是包合材料的首選物質(zhì)[3]。為了解決異槲皮苷溶解度低的問題，本文引入環(huán)糊精的包合技術(shù)[4]，并對(duì)比異槲皮苷包合前后溶解度變化，以期為相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異槲皮苷（含量＞98%），四川省維克奇生物科技有限公司；β-環(huán)糊精，分析純，上海源葉生物科技有限公司；甲醇，分析純，上海邁瑞兒生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3900 型紫外分光光度計(jì)，日本日立公司；WQF-520 型傅里葉變換紅外光譜儀，北京瑞利分析儀器有限公司；JP-020B 型超聲波清洗機(jī)，深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；DF101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；LVO-6020 型電熱恒溫真空干燥箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；DF-4 型壓片機(jī)，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.3 包合物的制備與表征

1.3.1 包合物的制備方法

采用共沉淀法制備包合物。精密稱取0.244 g β-環(huán)糊精于15 mL 蒸餾水中，50 ℃溶解。稱取0.1 g 異槲皮苷溶于5 mL 甲醇中，緩慢將其滴加到上述β-環(huán)糊精溶液中，于25 ℃持續(xù)攪拌10 h，冰箱中冷藏30 h，抽濾，用少量甲醇輕輕淋洗。將沉淀物于50 ℃干燥12 h，即得IQ-β-CD 固體包合物。

1.3.2 表征方法

1.3.2.1 紫外光譜法

等摩爾稱取IQ、β-CD 和IQ-β-CD 包合物，分別用50%甲醇溶液溶解后，稀釋至適當(dāng)濃度，平行實(shí)驗(yàn)3 次。以50%甲醇溶液為空白，在225 ～450 nm進(jìn)行紫外掃描。

1.3.2.2 紅外光譜法

用KBr 壓片，掃描范圍為4 000 ～500 cm-1，測(cè)定IQ、β-CD 以及IQ-β-CD 包合物的紅外光譜。

1.4 異槲皮苷含量測(cè)定方法

1.4.1 紫外可見分光光度計(jì)工作參數(shù)

波長掃描方式：Wavelength scan；設(shè)置光譜掃描條件為光度方式：Abs；掃描速度：300 nm/min；采樣間隔：0.5 nm；波長范圍：225 ～450 nm；狹縫寬度：5 nm；用石英比色皿50%甲醇溶液基線調(diào)零后備用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法

精密稱取10 mg IQ 于50 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶液定容，即為貯備液（0.2 mg/mL）。分別精密移取上述貯備液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL 于10 mL 比色管中，配制成濃度為6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL、14 μg/mL、16 μg/mL、18 μg/mL 的IQ 溶液。以50%甲醇溶液為空白，于356 nm 處測(cè)定吸光度。以異槲皮苷濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 精密度與回收率測(cè)定

（1）日內(nèi)精密度：精密移取上述貯備液0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL 于10 mL 比色管中，以50%甲醇溶液定容，配制成6 μg/mL、12 μg/mL、18 μg/mL 的IQ溶液。以50%甲醇溶液為空白，在356 nm 處測(cè)定其吸光度值，同日內(nèi)各濃度平行測(cè)定5 次。

（2）日間精密度：精密移取貯備液0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL 于10 mL 比色管中，以50%甲醇溶液定容，配制成6 μg/mL、12 μg/mL、18 μg/mL 的IQ 溶液，將不同濃度的IQ 溶液連續(xù)測(cè)5 d，每天測(cè)1 次。

（3）回收率：同法配制濃度分別為6 μg/mL、12 μg/mL、18 μg/mL 的IQ 溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，每天測(cè)定1 次，連續(xù)測(cè)定5 d。

1.5 異槲皮苷相溶解度的測(cè)定方法

稱取過量的IQ 5 份，分別置于10 mL 比色管中，加入不同濃度（0 ～1×10-2mol/L）的β-CD 溶液10 mL，密閉。超聲波振蕩30 min，于室溫放置一周，待固液平衡后，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾。取適當(dāng)濾液用50%甲醇溶液稀釋，在356 nm 處測(cè)定其吸光度。根據(jù)異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算IQ 的溶解度。以β-CD 濃度為橫坐標(biāo)，IQ 溶解度為縱坐標(biāo)，繪制相溶解度曲線。穩(wěn)定常數(shù)K值代表IQ-β-CD 包合物的包合常數(shù)，是表征包合作用強(qiáng)弱的特征參數(shù)，按公式（1）計(jì)算。

式中：K為穩(wěn)定常數(shù)，L/mol；slope為斜率；S0為固有溶解度，mol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果表征

2.1.1 紫外光譜

紫外光譜表征結(jié)果如圖1。在225 ～450 nm，IQ 的兩吸收峰分別在356 nm 和256 nm 處，IQ-β-CD 包合物的兩吸收峰分別在358 nm 和256 nm 處，β-CD 在225 ～450 nm 范圍內(nèi)幾乎無紫外吸收。由此可見，β-CD 包合IQ 后，IQ 在356 nm 處的吸收峰紅移2 nm（此結(jié)果經(jīng)過3 次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證），說明形成了IQ-β-CD 包合物。

圖1 紫外光譜圖

2.1.2 紅外光譜

如圖2 所示，IQ 圖譜中，3 376 cm-1處特征峰為-OH 伸縮振動(dòng)峰，2 831 cm-1處為亞甲基伸縮振動(dòng)峰，1 596 cm-1處為C=O 伸縮振動(dòng)峰，1 550 ～1 200 cm-1為芳環(huán)骨架振動(dòng)峰，1 160 ～1 000 cm-1為C-O-C 吸收峰。在β-CD 的紅外圖譜中，1 000 ～3 400 cm-1有多個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，分別為O-H 伸縮振動(dòng)峰、C-H 伸縮振動(dòng)峰、H-O-H 彎曲振動(dòng)和C-O-C伸縮振動(dòng)。包合物的紅外光譜基本上顯示兩種物質(zhì)紅外吸收?qǐng)D譜的疊加，特征峰強(qiáng)度和峰位置基本一致。在1 200 cm-1、1 061 cm-1、1 013 cm-1處，IQ 的特征峰在包合物的紅外圖上基本消失，說明IQ 某些芳環(huán)和C-O-C 吸收峰可能被環(huán)糊精包合，進(jìn)一步證明形成了IQ-β-CD 包合物。

圖2 紅外光譜圖

2.2 異槲皮苷含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 波長確定

稱取10 mg 異槲皮苷，用50%甲醇溶液溶解并稀釋至適當(dāng)濃度。以50%甲醇溶液為空白進(jìn)行紫外掃描，見圖3。IQ 在256 nm 和356 nm 處有最大吸收峰，因在356 nm 處吸收峰形更好，故選擇356 nm 作為異槲皮苷含量測(cè)定的最大吸收波長。

圖3 異槲皮苷的紫外吸收光譜圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

異槲皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4 所示，經(jīng)回歸處理得線性回歸方程為A=0.041 9C+0.005 1，R2=0.999 6。

圖4 異槲皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 精密度與回收率

濃度為6 μg/mL、12 μg/mL、18 μg/mL 的IQ溶液日內(nèi)RSD分別為0.801%、0.613%和0.336%；日間RSD分別為1.51%、1.88%和1.97%。如表1 所示，IQ 的平均回收率為96.04%～99.88%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%。由此可以看出，本方法準(zhǔn)確度較高，RSD均小于2%，符合《中華人民共和國藥典》的規(guī)定[5]。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果（n=5）

2.3 異槲皮苷的相溶解度

由圖5 可知，隨著β-CD 濃度的增大，IQ 的溶解度呈線性增加。根據(jù)相溶解度的分類方法[6]，該相溶解度圖為AL型，且體系中IQ 和β-CD 形成了1∶1 型包合物，其回歸方程為Y=0.032 3X+0.067 2（R2=0.991 7，n=6），固有溶解度為5.2×10-5mol/L。根據(jù)公式（1）計(jì)算得到穩(wěn)定常數(shù)K值為642 L/mol。

圖5 IQ 在β-CD 中的相溶解度曲線

2.4 β-環(huán)糊精的增溶效應(yīng)

表2 顯示了在不同β-CD 濃度下，IQ 的溶解度變化規(guī)律。結(jié)果表明，在0 ～1.0×10-2mol/L 的濃度范圍內(nèi)，隨著β-CD 濃度的增加，IQ 的溶解度逐漸增大，最大增溶倍數(shù)為7.31 倍。

表2 β-CD 對(duì)IQ 的增溶效應(yīng)

3 結(jié)論

本研究利用共沉淀法制備了IQ-β-CD 固體包合物，并用紫外、紅外光譜法對(duì)包合物進(jìn)行了表征。同時(shí)采用紫外分光光度法建立了IQ 含量的測(cè)定方法，精密度和回收率實(shí)驗(yàn)表明，本方法操作簡便，準(zhǔn)確度高。相溶解度法結(jié)果表明，β-CD 對(duì)IQ 的增溶效果明顯，包合后的IQ 溶解度得到顯著提高，在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)最大為包合前的7.31 倍。因此，運(yùn)用此方法有利于提高異槲皮苷的體內(nèi)吸收和生物利用度，有利于相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)。