喀什地區(qū)林奇綜合征錯(cuò)配修復(fù)蛋白檢測(cè)分析

朱君玲，姜會(huì)娟，韓雯，李玉華

結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制與遺傳因素和環(huán)境因素密切相關(guān)［1］。研究認(rèn)為，白種人結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生率更高［2］。也有研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克族因其飲食習(xí)慣導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生率較高［3］，而南疆地區(qū)大多數(shù)為維吾爾族，具有白種人血統(tǒng)且以肉食為主，導(dǎo)致其結(jié)直腸癌發(fā)病率較高。林奇綜合征作為一種遺傳性結(jié)直腸癌，同系家族發(fā)生率較高。其錯(cuò)配修復(fù)（mis?match repair，MMR）蛋白包括MutL 同源物 1（hu?man mutL homolog 1，MLH1）、MutS 同源物2（MutS homolog 2，MSH2）、PMS1 同源物2（PMS1 homolog 2，PMS2）、MutS 同源物6（MutS homolog 6，MSH6），可修復(fù)脫氧核糖核酸（DNA）錯(cuò)配堿基對(duì)，發(fā)揮修復(fù)基因損傷作用，而MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 功能異常可增加結(jié)直腸癌發(fā)生率［4-5］。本研究旨在分析喀什地區(qū)林奇綜合征患者M(jìn)LH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白的表達(dá)情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016 年6 月至2020 年6 月在喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院接受手術(shù)的300 例林奇綜合征患者的標(biāo)本。300 例林奇綜合征患者中男性178 例，女性122 例；年齡21～92 歲［（56.11 ± 10.78）歲］；腫瘤部位：左半結(jié)腸癌97 例，右半結(jié)腸癌78 例，直腸癌125 例；腫瘤大?。骸? cm 142 例，<5 cm 158 例；分化程度：低分化91 例，中分化99 例，高分化110 例；腫瘤形態(tài)：潰瘍型186 例，隆起型114 例；浸潤(rùn)程度：漿膜外142 例，漿膜內(nèi)158 例；有神經(jīng)侵犯72 例，無(wú)神經(jīng)侵犯228 例；有脈管侵犯75 例，無(wú)脈管侵犯225 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移236 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《遺傳性結(jié)直腸癌臨床診治和家系管理中國(guó)專家共識(shí)》［6］中關(guān)于林奇綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）經(jīng)病理學(xué)檢查確診；（3）均行腸癌根治術(shù)；（4）均為維吾爾族；（5）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腹膜轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移；（2）活檢標(biāo)本；（3）合并惡性腫瘤；（4）有嚴(yán)重肝腎疾??；（5）術(shù)前接受化療及放療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)［2018 快審第（105）號(hào)］。

1.2 方法

1.2.1 MMR 蛋白檢測(cè) 采集患者手術(shù)切除的組織標(biāo)本，使用4%的中性甲醛固定，石蠟包埋，切片。采用免疫組化法檢測(cè)MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白表達(dá)水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，抗體及試劑盒來(lái)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照采用正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞。細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色或黃褐色顆粒判定為陽(yáng)性，否則為陰性。MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白中任一蛋白表達(dá)為陰性即判定為錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失（deficient mismatch repair，dMMR），全部陽(yáng)性判定為錯(cuò)配修復(fù)蛋白完整（proficient mismatch re?pair，pMMR）。根據(jù)林奇綜合征患者M(jìn)MR 蛋白表達(dá)缺失情況將其分為dMMR 組和pMMR 組。

1.2.2 資料收集 收集患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、腫瘤形態(tài)、浸潤(rùn)程度、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床資料。

1.2.3 隨訪及預(yù)后分析 術(shù)后對(duì)dMMR 組和pMMR 組患者隨訪觀察2 年，每3 個(gè)月電話、門(mén)診、復(fù)查隨訪1 次，記錄其生存情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 處理所得數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。采取Kaplan?Meier 法行生存分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 林奇綜合征患者M(jìn)MR 蛋白表達(dá)情況

300 例林奇綜合征患者中，dMMR 發(fā)生率為16.67%（50/300），pMMR 發(fā)生率為83.33%（250/300），其中MLH1 蛋白表達(dá)缺失率為3.67%（11/300），MSH2 蛋白表達(dá)缺失率為8.00%（24/300），PMS2 蛋白表達(dá)缺失率為3.00%（9/300），MSH6 蛋白表達(dá)缺失率為2.00%（6/300），MLH1 和PMS2 蛋白表達(dá)缺失率為6.00%（18/300），MSH2 和MSH6蛋白表達(dá)缺失率為5.67%（17/300），MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白同時(shí)表達(dá)缺失率為1%（3/300）。根據(jù)林奇綜合征患者M(jìn)MR 蛋白表達(dá)缺失情況將其分為dMMR 組（n=50）和pMMR 組（n=250）。

2.2 MMR 蛋白表達(dá)缺失與林奇綜合征患者病理特征的關(guān)系

dMMR 組與pMMR 組患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤形態(tài)、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；dMMR 組患者腫瘤在右半結(jié)腸、分化程度低、浸潤(rùn)至漿膜外中的占比高于pMMR 組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 MMR 蛋白表達(dá)缺失與林奇綜合征患者病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.3 dMMR 組與pMMR 組患者生存率比較

在術(shù)后2 年的隨訪觀察中，dMMR 組有10 例失訪，pMMR 組有17 例失訪，dMMR 組2 年生存率為87.50 %（35/40），pMMR 組2 年 生 存 率 為72.10 %（168/233）。Kaplan?Meier 生存分析顯示，dMMR 組和pMMR 組患者的2 年生存率比較差異有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（Log Rank=5.156，P=0.023）。見(jiàn)圖1。

注：dMMR 為錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失，pMMR 為錯(cuò)配修復(fù)蛋白完整

3 討論

結(jié)直腸癌為消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤。隨著生活方式和飲食方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康［7］。結(jié)直腸癌臨床表現(xiàn)不明顯，早期患者無(wú)明顯癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往處于腫瘤晚期，導(dǎo)致其預(yù)后較差［8］。目前放化療、手術(shù)治療、靶向治療等治療方法可延長(zhǎng)患者生存期及改善生存質(zhì)量，但某些患者對(duì)目前的治療方式存在不敏感現(xiàn)象，故結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)及有效性篩查對(duì)提高其診療精準(zhǔn)性具有重要價(jià)值［9］。結(jié)直腸癌根據(jù)發(fā)病特點(diǎn)可分為散發(fā)性和遺傳性，林奇綜合征是遺傳性結(jié)直腸癌中較為特殊的一種類型，為MMR 蛋白突變而形成的一種顯性遺傳性疾病。目前通過(guò)MMR 蛋白檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)dMMR而確診林奇綜合征，有助于家族遺傳篩查［10］。目前臨床上主要采用免疫組織化學(xué)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)MMR 蛋白表達(dá)情況，前者檢測(cè)簡(jiǎn)單快捷，后者為MMR 蛋白檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠更加客觀地評(píng)估功能性dMMR，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高且價(jià)格相對(duì)昂貴。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，二代測(cè)序是近年來(lái)出現(xiàn)的新的檢測(cè)方法。早期應(yīng)用免疫組化分析MMR 蛋白的研究主要集中在MLH1 和MSH2 上，但研究顯示其在篩選林奇綜合征患者時(shí)敏感度和特異度不高，檢測(cè)MLH1 和MSH2 蛋白無(wú)法完全預(yù)測(cè)林奇綜合征的基因突變［11］。隨著研究的進(jìn)展，MLH1 和MSH2 蛋白聯(lián)合PMS2 和MSH6 蛋白檢測(cè)可有效提高M(jìn)MR 蛋白的預(yù)測(cè)價(jià)值，與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)效果相當(dāng)［12］。吳暢等［13］在對(duì)湖南地區(qū)的MMR 蛋白表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白表達(dá)缺失率分別為8.90%、2.60%、14.70%、2.60%；在歐洲的一項(xiàng)研究中，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋 白 表 達(dá) 缺 失 率 分 別 為15.00%、21.00%、15.00%、13.00%［14］；而韓國(guó)的一項(xiàng)研究中，MLH1、MSH2、MSH6 蛋白表達(dá)缺失率分別為3.70%、2.00%、5.20%［15］。目前報(bào)道的MMR蛋白缺失率與本研究結(jié)果存在一定差異，表明dMMR 可能和生活方式、病理特征、遺傳及地理等因素有關(guān)。本研究中MLH1 和PMS2 蛋白表達(dá)缺失率為6.00%，MSH2 和MSH6 蛋白表達(dá)缺失率為5.67%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白同時(shí)表達(dá)缺失率為1%，說(shuō)明MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6蛋白可能存在共同缺失的情況，分析原因可能是有多個(gè)分子和酶參與MMR 蛋白修復(fù)DNA 的過(guò)程，MLH1 和MSH2 蛋白通過(guò)與同源性MMR 蛋白形成二聚體發(fā)揮主要作用，MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6 蛋白之間能夠分別合成功能性二聚體復(fù)合物。MLH1 和MSH2 蛋白屬于主導(dǎo)蛋白，PMS2 和MSH6 蛋白屬于配對(duì)蛋白，MLH1 和MSH2 蛋白發(fā)生突變后二聚體蛋白降解，從而使MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6 蛋白表達(dá)缺失［16］。

在分析MMR 蛋白表達(dá)缺失與林奇綜合征患者病理特征的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，2 組患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤形態(tài)、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明MMR 蛋白突變發(fā)生在腫瘤的早期階段，與上述病理特征沒(méi)有顯著相關(guān)性。而右半結(jié)腸癌患者dMMR 的發(fā)生率更高，考慮可能與生理功能、胚胎來(lái)源及血管供應(yīng)等生物學(xué)和臨床差異有關(guān)［17］。左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展本身不太一樣，右半結(jié)腸毛細(xì)血管豐富、血液供應(yīng)充足，同時(shí)腸腔較左半結(jié)腸大，壁薄擴(kuò)張、離子交換、基因突變都更容易［18］。dMMR 患者腫瘤分化程度更低，說(shuō)明中低分化的腫瘤更容易出現(xiàn)dMMR，導(dǎo)致錯(cuò)配概率增加，加速癌細(xì)胞增殖分裂，從而加劇腫瘤惡化。dMMR 與腫瘤浸潤(rùn)程度也有一定關(guān)系，PMS2 蛋白缺失的患者浸潤(rùn)至漿膜外更多，可能是因?yàn)榘┙M織侵犯范圍增加，導(dǎo)致MMR 蛋白缺失增多，腫瘤的發(fā)展更加嚴(yán)重。但也有研究顯示［19-24］，dMMR 與性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有一定關(guān)系，與本研究結(jié)果存在一定差異，考慮可能與選取的樣本間差異有關(guān)。另外，本研究顯示，dMMR 患者的生存率顯著高于pMMR 患者，與趙輝等［25］的研究結(jié)果較為一致，但現(xiàn)階段關(guān)于MMR 蛋白影響患者預(yù)后的具體機(jī)制尚不清楚。本研究中dMMR 患者預(yù)后較好，推斷可能與腫瘤組織中二氫嘧啶脫氫酶和胸苷合成酶過(guò)表達(dá)及免疫監(jiān)視功能增強(qiáng)有關(guān)。

綜上所述，MMR 蛋白與林奇綜合征的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，林奇綜合征患者中常見(jiàn)MMR 蛋白缺失，檢測(cè)MMR 蛋白能夠早期診斷dMMR，對(duì)林奇綜合征進(jìn)行預(yù)測(cè)，在患者治療方案的選擇及預(yù)后分析中有著重要意義。