Toll樣受體激活對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響

孫 玥 耿林玉 黃賽賽 王 紅 丁從珠

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)是中胚層系的起源細(xì)胞,具有自我更新、多向分化、支持造血和組織修復(fù)的潛能。同時(shí),MSC具有強(qiáng)大的免疫抑制功能,可以對(duì)體內(nèi)多種免疫細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1]。因此,在自身免疫性疾病的治療方面,MSC具有潛在的治療價(jià)值與廣闊的應(yīng)用前景。

許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)MSC的免疫調(diào)節(jié)功能受外源性刺激的影響[2]。在某些情況下,由于機(jī)體內(nèi)環(huán)境因子的不適刺激,MSC可能并不能有效發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。在機(jī)體內(nèi)環(huán)境中,Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)刺激信號(hào)會(huì)影響MSC的免疫調(diào)節(jié)功能[3]。MSC表達(dá)多種功能性的TLR,很多研究證實(shí)TLR及其配體可以影響MSC的多種細(xì)胞功能包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和免疫調(diào)節(jié)等[4]。有研究顯示,TLR4或TLR3的激活通過(guò)下調(diào)Jagged1表達(dá),降低骨髓MSC對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。但是也有研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)誘導(dǎo)吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)產(chǎn)生,TLR3或TLR4激活增強(qiáng)了骨髓MSC的免疫調(diào)節(jié)功能[6]。

近年來(lái)研究顯示,與骨髓MSC比較,臍帶來(lái)源的MSC在臨床治療方面可能更有優(yōu)勢(shì)[7]。本研究觀察了TLR4或TLR3激活對(duì)臍帶、骨髓兩種不同來(lái)源MSC免疫調(diào)節(jié)功能的影響,同時(shí)分析了兩種MSC中TLR4和TLR3的基礎(chǔ)表達(dá)情況。

材料與方法

1.試劑及儀器:DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基與胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自挪威Axis-Shield公司。TLR4、TLR3流式抗體與熒光染料CFSE購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。TLR4激動(dòng)劑脂多糖(LPS)、TLR3激動(dòng)劑聚肌胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid, Poly(I:C)]購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。抗人CD3、CD28抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。Trizol、PrimeScriptTMRT與SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Sheldon公司。CIMO超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。倒置顯微鏡(CKX53)購(gòu)自日本Olympus公司。FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。Step-one PlusTM熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

2.MSC分離培養(yǎng):實(shí)驗(yàn)中骨髓來(lái)自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院骨科關(guān)節(jié)置換術(shù)患者,臍帶來(lái)自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦。實(shí)驗(yàn)中所需外周血來(lái)自于健康志愿者。所有實(shí)驗(yàn)均得到南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):2021-544-01),本研究獲得研究對(duì)象的知情同意。將關(guān)節(jié)置換術(shù)中所得松質(zhì)骨碎片及骨髓液,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)充分沖洗,離心后用紅細(xì)胞裂解液裂解,裂解充分后加入PBS混勻,有效離心半徑15cm,1500r/min離心5min,棄上清,PBS重復(fù)洗滌1次,完畢后將細(xì)胞用含10%FBS的DMEM-F12完全培養(yǎng)基混勻,以105個(gè)/毫升的密度種植。細(xì)胞放置于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右融合時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)中所用3例骨髓MSC為P3代。臍帶無(wú)菌采集后,于DMEM-F12完全培養(yǎng)基4℃保存,在24h內(nèi)處理。無(wú)菌狀態(tài)下,采用無(wú)菌器械去除靜脈及動(dòng)脈,分離剝?nèi)∧殠е械娜A通氏膠。采用貼壁法,將膠組織剪成約1mm3的小塊接種入10cm培養(yǎng)皿中,靜置5min至組織塊黏合培養(yǎng)瓶/皿壁充分時(shí),緩慢加入DMEM-F12完全培養(yǎng)基,置于溫度37℃、5% CO2的孵箱中。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)中所用3例臍帶MSC為P3代。

3.細(xì)胞處理:本實(shí)驗(yàn)中,將臍帶或者骨髓MSC以每孔5×104個(gè)的密度種植于24孔板,培養(yǎng)上清均為500μl,細(xì)胞貼壁后分別加入LPS、Poly(I:C)刺激處理,LPS刺激濃度為10ng/ml,Poly(I:C)刺激濃度為1μg/ml,處理時(shí)間為24h,同時(shí)留取未刺激處理的MSC組。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組為:①外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)單獨(dú)組(PBMC);②MSC與PBMC共培養(yǎng)組(+MSC);③LPS預(yù)處理MSC與PBMC共培養(yǎng)組(+LPS預(yù)處理MSC);④Poly(I:C)預(yù)處理MSC與PBMC共培養(yǎng)組[+Poly(I:C)預(yù)處理MSC]。

4.MSC調(diào)節(jié)PBMC增殖實(shí)驗(yàn):LPS、Poly(I:C)刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)束后PBS洗滌MSC,然后接種PBMC細(xì)胞懸液共培養(yǎng)。人淋巴細(xì)胞分離液(1.077g/ml)分離健康志愿者外周血PBMC,5μmol/L CFSE 37℃染色10min后,用4℃的RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)5min,1500r/min離心10min,棄上清。RPMI 1640完全培養(yǎng)基混勻PBMC,加入2μg/ml的抗CD3/CD28抗體刺激淋巴細(xì)胞增殖,PBMC以每孔5×105個(gè)的細(xì)胞數(shù)量與MSC共培養(yǎng)。共培養(yǎng)4天后收集PBMC,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE熒光衰減的百分率,即為細(xì)胞增殖百分率。

5.PCR檢測(cè)TLR4、TLR3基因水平:將臍帶MSC、骨髓MSC接種到6孔板,待細(xì)胞80%融合,胰酶消化,PBS洗滌收集細(xì)胞。用Trizol裂解液提取RNA后,用日本TaKaRa公司PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在Step-one PlusTM熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化后的2-ΔΔCt值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4、TLR3蛋白水平:將臍帶MSC、骨髓MSC接種到6孔板,待細(xì)胞80%融合,胰酶消化,PBS洗滌收集細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4、TLR3的蛋白水平,以幾何平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)分析統(tǒng)計(jì)。

結(jié) 果

1.LPS或Poly(I:C)預(yù)處理對(duì)骨髓MSC免疫調(diào)節(jié)功能的影響:分別以TLR4激動(dòng)劑LPS、TLR3激動(dòng)劑Poly(I:C)預(yù)處理骨髓MSC 24h,觀察TLR激活對(duì)骨髓MSC調(diào)節(jié)PBMC增殖的影響。結(jié)果顯示,與單獨(dú)培養(yǎng)的PBMC增殖情況比較,未處理的骨髓MSC、Poly(I:C)預(yù)處理的骨髓MSC均可以顯著抑制PBMC增殖(P<0.05),但是LPS預(yù)處理的骨髓MSC并不能有效抑制PBMC增殖(P>0.05)。與未處理的骨髓MSC比較,LPS預(yù)處理的骨髓MSC抑制PBMC增殖的能力顯著下降(P<0.05),詳見(jiàn)圖1。

圖1 LPS或Poly(I:C)預(yù)處理對(duì)骨髓MSC免疫調(diào)節(jié)功能的影響A.各組PBMC增殖的流式圖;B.各組PBMC增殖百分率比較。*P<0.05,n=3

2.LPS或Poly(I:C)預(yù)處理對(duì)臍帶MSC免疫調(diào)節(jié)功能的影響:除了骨髓來(lái)源的MSC,臍帶來(lái)源的MSC也具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能,可以抑制淋巴細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)以臍帶MSC為研究對(duì)象,繼續(xù)觀察LPS、Poly(I:C)激活TLR對(duì)臍帶MSC調(diào)節(jié)PBMC增殖的影響。結(jié)果顯示,與單獨(dú)培養(yǎng)的PBMC比較,未處理的臍帶MSC、LPS預(yù)處理的臍帶MSC與Poly(I:C)預(yù)處理的臍帶MSC均可以顯著抑制PBMC增殖(P<0.05)。同時(shí),與未處理的臍帶MSC比較,LPS或者Poly(I:C)預(yù)處理的骨髓MSC抑制PBMC增殖的能力比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見(jiàn)圖2。

3.臍帶MSC與骨髓MSC的TLR表達(dá)水平:本研究進(jìn)一步比較了骨髓和臍帶兩種不同來(lái)源MSC中TLR4和TLR3的基礎(chǔ)表達(dá)量。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與骨髓MSC比較,臍帶MSC中TLR4、TLR3的基因相對(duì)表達(dá)量較低(P<0.05),詳見(jiàn)圖3中A、B。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MFI,分析臍帶MSC與骨髓MSC中TLR4、TLR3的蛋白表達(dá)水平。與基因檢測(cè)結(jié)果一致,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與骨髓MSC比較,臍帶MSC中TLR4、TLR3的蛋白表達(dá)水平明顯更低(P<0.05),詳見(jiàn)圖3中C、D。

圖3 臍帶MSC與骨髓MSC的TLR表達(dá)水平A.TLR4基因表達(dá);B.TLR3基因表達(dá);C.TLR4蛋白表達(dá);D.TLR3蛋白表達(dá)。*P<0.05,n=3

結(jié) 果

MSC具有多種特征,這些特征使其成為免疫治療的理想候選細(xì)胞[8]。MSC表達(dá)低水平的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)Ⅰ類分子,不表達(dá)HLA Ⅱ類分子和共刺激分子,因此,MSC適用于異基因移植治療,大大拓寬了MSC的應(yīng)用范圍。MSC的另一個(gè)主要特征是其具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用,因而很多研究將MSC用于移植物抗宿主病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫相關(guān)疾病的治療[9]。

MSC可作用于固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng),可抑制絲裂原(如植物凝集素、刀豆蛋白)或抗體(如抗CD2、抗CD3、抗CD28)刺激的淋巴細(xì)胞增殖[10]。MSC能夠通過(guò)直接細(xì)胞接觸或旁分泌效應(yīng)釋放可溶性因子,如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、前列腺素E2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、吲哚胺-2,3-雙加氧酶、一氧化氮、jagged1和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)等,抑制淋巴細(xì)胞增殖[11]。

研究顯示,TLR刺激信號(hào)包括病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP),可能會(huì)極大地影響MSC的免疫調(diào)節(jié)特性,從而影響MSC的治療結(jié)果[4]。TLR是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要識(shí)別受體,是激活機(jī)體免疫反應(yīng)的第一線,它可存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部,識(shí)別PAMP或DAMP,引發(fā)后續(xù)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。MSC表達(dá)多種功能性的TLR亞型包括TLR1～TLR10,其中TLR3和TLR4在人類MSC中表達(dá)量相對(duì)較高[12]。研究發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型中,TLR4激活后的骨髓MSC產(chǎn)生一氧化氮的能力降低,從而影響了骨髓MSC對(duì)EAE的治療效果[13]。另有文獻(xiàn)報(bào)道,LPS刺激骨髓MSC可增加其產(chǎn)生IL-6、IL-8等,并減弱骨髓MSC對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制效應(yīng),但是Poly(I:C)刺激骨髓MSC卻可使其免疫抑制效應(yīng)增強(qiáng)[14]。

與骨髓來(lái)源的MSC比較,臍帶MSC更容易獲得,并表現(xiàn)出更高的增殖效率,所以臍帶MSC已被越來(lái)越多的研究人員考慮使用。本研究評(píng)估了TLR激動(dòng)劑LPS或Poly(I:C)預(yù)處理,是否會(huì)導(dǎo)致骨髓或臍帶MSC免疫調(diào)節(jié)功能的異常,同時(shí)還評(píng)估了臍帶MSC和骨髓MSC之間TLR3和TLR4的表達(dá)是否存在顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與骨髓MSC比較,臍帶MSC對(duì)LPS或Poly(I:C)的刺激存在明顯的“抗性”,即LPS或Poly(I:C)刺激后對(duì)臍帶MSC抑制淋巴細(xì)胞增殖的影響并不顯著。本研究進(jìn)一步分析顯示,臍帶MSC中,TLR3、TLR4的基因和蛋白表達(dá)水平均明顯低于骨髓MSC。這一結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道的一致[15]。這部分解釋了兩種MSC對(duì)TLR刺激信號(hào)的不同反應(yīng)。

既往文獻(xiàn)報(bào)道,骨髓MSC在骨髓細(xì)胞總量中占有的比例極低(0.001%～0.010%),并且骨髓MSC的細(xì)胞數(shù)量和增殖能力受年齡因素影響很大,隨著年齡增長(zhǎng)其增殖能力明顯降低。臍帶MSC與骨髓MSC類似,同樣具有多向分化和免疫調(diào)節(jié)的功能,但是臍帶易于獲取而且資源豐富,細(xì)胞數(shù)量大,屬于醫(yī)療廢棄物,規(guī)避創(chuàng)傷性操作和倫理的束縛。目前MSC在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中未達(dá)到穩(wěn)定的免疫治療效果,可能與選取移植的MSC細(xì)胞來(lái)源相關(guān)。有些個(gè)案報(bào)道臍帶MSC的免疫調(diào)節(jié)功能可能優(yōu)于同一個(gè)體的骨髓MSC[16]。臨床試驗(yàn)也證實(shí),在造血干細(xì)胞移植時(shí)合并臍帶MSC移植,與合并骨髓MSC移植比較,移植排斥事件的發(fā)生率更低。

綜上所述,本研究表明,與臍帶MSC比較,骨髓MSC的免疫調(diào)節(jié)功能更容易受到TLR激動(dòng)劑刺激的影響,并且臍帶MSC中TLR的基礎(chǔ)表達(dá)量明顯低于骨髓MSC。因此,筆者團(tuán)隊(duì)推測(cè)在MSC的免疫治療方面,臍帶MSC可能較骨髓MSC更有優(yōu)勢(shì),但仍然需要大規(guī)模的臨床試驗(yàn)以進(jìn)一步證實(shí),從而優(yōu)化MSC移植治療免疫相關(guān)疾病的策略。