SLFN11基因表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞L-OHP敏感度的影響

田 力 張寧坤 楊 璐 夏 菁 彭朝勝

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC),全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)生率及病死率分居腫瘤第3位及第2位,我國(guó)CRC發(fā)生率及病死率也具此特點(diǎn)[1,2]。40%～60%初診CRC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)就已為進(jìn)展期[3];40%早期根治性手術(shù)切除術(shù)后的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]?？鼓[瘤藥物是患者的主要治療手段,奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)是治療CRC的重要化療藥物之一,但其有效率因耐藥和毒瘤性反應(yīng)而降低。因此,尋找L-OHP藥物的療效預(yù)測(cè)因子、制定合理的個(gè)體化治療方案,是腫瘤治療的一個(gè)重要方向。

SLFN11(Schlafen 11)基因?qū)偃嗽葱許lfn(Schlafen)家族成員之一。Slfns基因家族包括 10 種鼠源和 5 種人類亞型,據(jù)基因同源性和編碼蛋白的大小可以分成 3 組[5]。研究發(fā)現(xiàn),SLFN蛋白為 SLFN1,在NIH-3T3 成纖維細(xì)胞中異位表達(dá)時(shí)觀察到 G0/G1期細(xì)胞周期停滯的情況,故而將其命名為 Schlafen1[6]。該家族基因具有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起重要的負(fù)調(diào)控作用,作為潛在的抑癌基因而被逐漸重視。眾多臨床研究證實(shí)SLFN11基因可影響抗腫瘤細(xì)胞鉑類藥物(順鉑、卡鉑)的敏感度[7,8]。

L-OHP與順鉑、卡鉑同屬于烷化劑抗腫瘤藥物,屬于第3代鉑類藥物。但目前還沒(méi)有關(guān)于SLFN11基因表達(dá)和L-OHP敏感度相關(guān)的細(xì)胞學(xué)研究,臨床研究也很少,研究顯示,SLFN11高表達(dá)可影響CRC以L-OHP為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療的患者預(yù)后。這提示SLFN11與L-OHP療效可能存在一定的相關(guān)性,但由于此研究?jī)H為單中心小樣本量臨床研究,其結(jié)果的可靠性需要進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)及臨床上得到證實(shí)。因此本項(xiàng)目擬從細(xì)胞學(xué)層面體外驗(yàn)證SLFN11對(duì)L-OHP抑制人直腸癌細(xì)胞(SW480)作用的影響,探索SLFN11表達(dá)水平對(duì)L-OHP療效的評(píng)估意義,為尋找該藥預(yù)測(cè)因子提供依據(jù)。

材料與方法

1.主要材料和試劑:SLFN11siRNA序列(漢恒生物科技有限公司)、mock序列(漢恒生物科技公司)、SLFN11基因和內(nèi)參基因GAPDH序列[生工生物工程(上海)股份公司]、Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(C0526,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、AG RNAex Pro reagent(AG21102,湖南艾科瑞生物工程公司)、Evo M-MLV RT Premix for qPCR(AG11706,湖南艾科瑞生物工程公司)、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11701,湖南艾科瑞生物工程公司),SLFN11一抗(26060-1-AP,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(ZB-2301,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒(C1052,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、L-OHP(HY-17371,美國(guó)MedChemExpres公司)。

2.SW480細(xì)胞培養(yǎng):使用含10%胎牛血清L-15培養(yǎng)液,培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480(CL-0223A,武漢普諾賽生命科技有限公司)。待鋪板率達(dá)到80%～90%時(shí),經(jīng)0.25%胰酶消化,1000r/min離心5min,重懸后按1∶2進(jìn)行傳代,隨后選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了避免實(shí)驗(yàn)誤差并保證數(shù)據(jù)可重復(fù)性,每批實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中每組均設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

3.小干擾RNA(small interfering RNA,SLFN11siRNA)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:設(shè)計(jì)3組SLFN11siRNA序列和1組mock序列(表1),以1×105/孔密度將SW480細(xì)胞接種于6 孔板中,培養(yǎng)過(guò)夜,待細(xì)胞鋪板率達(dá)到 30%～40%分組處理:①空白對(duì)照組(Control):未進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作;②陰性對(duì)照組:siRNA-NC:mock序列轉(zhuǎn)染組;③3個(gè)序列驗(yàn)證組:分別轉(zhuǎn)染SLFN11-siRNA1-A3。轉(zhuǎn)染過(guò)程依Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后6h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。用于后續(xù)RT-qPCR、Western blot法、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。

4.RT-qPCR檢測(cè):利用RT-qPCR檢測(cè)(表2)SLFN11基因mRNA水平。提取細(xì)胞總RNA,依試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組樣本對(duì)空白對(duì)照組目的基因相對(duì)表達(dá)量,SLFN11基因相對(duì)表達(dá)量= 2-[ΔCT(SLFN11)-ΔCT(GAPDH)]。

表2 SLFN11基因RT-qPCR序列

5.Western blot法檢測(cè)SLFN11蛋白表達(dá):收取各組細(xì)胞,加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液,于冰上裂解30min。4℃、12000r/min離心5min,進(jìn)行總蛋白定量。取總蛋白30μg經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、SLFN11 一抗、HRP-IgG二抗孵育后,利用Image J圖像分析軟件分析灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量:SLFN11蛋白相對(duì)表達(dá)量(%)=siRNA轉(zhuǎn)染組灰度值/control組灰度值×100%。

6.L-OHP藥物毒性實(shí)驗(yàn):結(jié)合RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果,將SW480細(xì)胞分為兩組,即mock組和SLFN11基因沉默組(SLFN11-/-)。用PBS配制5mmol/L藥物母液,并稀釋0、0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30、40、50μmol/L 9個(gè)濃度。作用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后,清洗細(xì)胞,采用MTT檢測(cè)方法讀取吸光度A值。細(xì)胞抑制率(%)=1-(各藥物濃度A值/未加藥物A值)×100%。據(jù)藥物毒性數(shù)據(jù),選取L-OHP濃度3.75μmol/L作用于SW480細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞周期及凋亡實(shí)驗(yàn)。

7.細(xì)胞凋亡:細(xì)胞隨機(jī)分為4組:control-BL組:SW480+siRNA-NC;control-L-OHP組:SW480+siRNA-NC+3.75μmol/L L-OHP;SLFN-/--BL組:SW480+SLFN11siRNA;SLFN-/--L-OHP組:SW480+SLFN11siRNA+3.75μmol/L L-OHP。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后更換含有3.75μmol/L L-OHP培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h。收取細(xì)胞按AnnexinⅤ-FITC凋亡染色試劑盒中的要求進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率(%)=右下象限細(xì)胞比例(%)+右上象限細(xì)胞比例(%)。

8.細(xì)胞周期:依上述操作過(guò)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并收集細(xì)胞。經(jīng)1ml PBS洗細(xì)胞1次,加入500μl PBS 4℃避光孵育30min。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè),一般計(jì)數(shù)(2～3)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)使用正常SW480細(xì)胞,分析單個(gè)細(xì)胞上PI的熒光強(qiáng)度,軟件自動(dòng)擬合細(xì)胞周期。

結(jié) 果

1.SLFN11基因mRNA低表達(dá)有效siRNA篩選:結(jié)合RT-qPCR和Western blot法分別對(duì)SLFN11基因mRNA和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照比較,siRNA-NC組、SLFN siRNA-1和SLFN siRNA-2組對(duì)SW480細(xì)胞SLFN11mRNA和蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性影響(圖1),而SLFN siRNA-3顯著降低了SLFN11mRNA和蛋白的表達(dá),分別降低約90%和80%。

2.SLFN11基因沉默后對(duì)L-OHP抑制細(xì)胞生長(zhǎng)影響:以SLFN siRNA-3為刺激物制備SW480 SLFN11基因沉默模型,并進(jìn)行藥物L(fēng)-OHP檢測(cè)。結(jié)果表明,SLFN11siRNA干擾組(SLFN siRNA-3)較未干擾(mock)組,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯減低(P<0.05),未干擾組IC50值為36.19μmol/L,SLFN11siRNA干擾組IC50值為43.55μmol/L。說(shuō)明SLFN11基因沉默可有效降低L-OHP對(duì)SW480抑制作用的敏感度(圖2)。

圖2 SLFN 11沉默對(duì)L-OHP抑制SW480細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響

3.SLFN11基因沉默對(duì)L-OHP誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的影響:對(duì)SW480凋亡率統(tǒng)計(jì)分析得出,與control-BL組(4.51%±0.25%)比較,L-OHP藥物干預(yù)(control-L-OHP組, 29.86%±0.28%)SW480細(xì)胞凋亡率極顯著升高,提高25.35%(P<0.05)。與SLFN-/--BL組比較(6.56%±0.30%),SLFN-/--L-OHP組細(xì)胞凋亡率 (12.79%±0.29%)極顯著地增加,提高6.23%(P<0.05)。與control-L-OHP組比較,SLFN-/--L-OHP組細(xì)胞凋亡率極顯著降低(P<0.05),降低17.07%。與control-BL組比較,SLFN-/--BL組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。檢測(cè)結(jié)果顯示,一方面L-OHP可有效誘導(dǎo)SW480凋亡;另一方面SLFN11基因沉默后能夠有效抑制L-OHP誘發(fā)的腸癌細(xì)胞凋亡行為(圖3、圖4)。

圖3 SLFN11對(duì)L-OHP阻滯SW480細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響A.control-B組凋亡細(xì)胞百分比;B.SLFN-/--BL組凋亡細(xì)胞百分比;C.control-L-OHP 組凋亡細(xì)胞百分比;D.SLFN-/--L-OHP組凋亡細(xì)胞百分比

圖4 SLFN11基因沉默對(duì)L-OHP誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡率與control-BL組比較,*P<0.05;與control-L-OHP組比較,#P<0.05;與SLFN-/--BL組比較,ΔP<0.05

4.SLFN11基因沉默對(duì)L-OHP阻滯SW480細(xì)胞周期的影響:對(duì)SW480細(xì)胞周期G2/M期比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,與control-BL組(23.30%±0.13%)比較,control-L-OHP組(32.04%±0.41%)SW480細(xì)胞G2/M期比例極顯著增加,升高8.74%(P<0.05)。與SLFN-/--BL組(24.37%±0.30%)比較,SLFN-/--L-OHP組(27.21%±0.31%)G2/M期比例顯著增加(P<0.05),升高2.84%。SLFN11-/--L-OHP組與control-L-OHP組比較G2/M期比例顯著降低(P<0.05),減少了4.83%。與control-BL組比較,SLFN-/--BL組對(duì)細(xì)胞周期比例無(wú)顯著影響(P>0.05,圖4)。一方面表明L-OHP能夠有效誘發(fā)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞周期阻滯。另一方面說(shuō)明SLFN11敲除后能夠有效抑制L-OHP誘發(fā)的腸癌細(xì)胞周期阻滯行為(圖5、圖6)。

圖5 SLFN11基因沉默對(duì)L-OHP誘導(dǎo)SW480周期變化影響A.control-BL組細(xì)胞周期分布;B.SLFN-/--BL組細(xì)胞周期分布;C.control-L-OHP 組細(xì)胞周期分布;D.SLFN-/--L-OHP組細(xì)胞周期分布

圖6 SLFN11對(duì)L-OHP阻滯SW480細(xì)胞周期G2/M期比例影響A.與control-BL組比較,*P<0.05;與control-L-OHP組比較,#P<0.05;與SLFN-/--BL組比較,ΔP<0.05

討 論

化療是進(jìn)展期CRC患者重要治療手段,可有效提高患者總生存期和無(wú)疾病進(jìn)展生存期。治療基本按照腫瘤治療NCCN(The National Comprehensive Cancer Network)指南給予以L-OHP為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療FOLFOX(L-OHP+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣)或XELOX方案(L-OHP+卡培他濱)。但因鉑類藥物包括L-OHP單藥在腫瘤中的有效率不超過(guò)20%,聯(lián)合用藥有效率不超過(guò)50%,使用效果不夠理想[9,10]。至今在臨床上仍未發(fā)現(xiàn)一個(gè)能夠預(yù)測(cè)L-OHP療效的標(biāo)志物。因此,探索L-OHP療效預(yù)測(cè)因子的研究是實(shí)現(xiàn)腫瘤患者個(gè)體化治療面臨的迫切問(wèn)題。

SLFN11是Slfns基因家族之一,由Schwarz等[11]于1998年發(fā)現(xiàn),參與調(diào)控胸腺發(fā)育,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和免疫等功能都有調(diào)節(jié)作用。Barretina等[12]研究發(fā)現(xiàn),其可表達(dá)于多種細(xì)胞系,且不同腫瘤細(xì)胞SLFN11表達(dá)水平不一。SLFN11基因可使多種腫瘤細(xì)胞及多種抗腫瘤藥物敏感,如鉑類衍生物,拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑,DNA合成抑制劑和PARP抑制劑[13]。Zoppoli等[14]研究表明,CRC和卵巢癌腫瘤組織中的SLFN11表達(dá)分布范圍明顯較周圍正常組織增大;但較周圍正常組織,腫瘤組織SLFN11表達(dá)水平明顯減低。隨后的一些基礎(chǔ)研究也證實(shí)了SLFN11基因可影響腫瘤細(xì)胞CPT-11和鉑類藥物(順鉑、卡鉑)的敏感度,如卵巢癌患者的以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療效果顯示,SLFN11基因高表達(dá)患者療效要明顯優(yōu)于低表達(dá)患者[15～17]。另外,SLFN11表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥物的敏感度呈正相關(guān),國(guó)內(nèi)研究者認(rèn)為主要是由于SLFN11高表達(dá),促使復(fù)制蛋白A復(fù)合體(replication protein A complex,RPA)從單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)上脫落,抑制細(xì)胞周期維持和同源重組修復(fù)而造成對(duì)DNA損傷藥物的敏感度[18]。

L-OHP為第3代鉑類藥物,雖與順鉑、卡鉑同屬于致DNA損傷的烷化劑,目前還沒(méi)有關(guān)于SLFN11基因表達(dá)和L-OHP敏感度相關(guān)的細(xì)胞學(xué)研究,臨床研究也相對(duì)較少。2015年一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌患者輔助以L-OHP為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療治療中,KRAS基因野生型患者與突變型患者生存率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但KRAS野生型、SLFN11表達(dá)水平高的CRC患者預(yù)后良好,其3年及5年生存率較SLFN11低表達(dá)的患者明顯升高[19]。另外一項(xiàng)臨床研究結(jié)果也表明,具有高SLFN11表達(dá)的胃癌患者比低SLFN11表達(dá)患者具有更好的生存期,在輔助以鉑類(順鉑或L-OHP)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療后,這種生存期優(yōu)勢(shì)更加明顯。激活SLFN11活性可以增加鉑類藥物的敏感度,而下調(diào)SLFN11表達(dá)水平則引起鉑類藥物的耐藥性。研究還發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期L-OHP治療可抑制SLFN11的表達(dá),從而引起耐藥[20]。這些均提示SLFN11與L-OHP療效可能存在一定的正相關(guān)性,但因這些臨床研究?jī)H為單中心小樣本量臨床研究,其結(jié)果的可靠性需進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)及臨床上得到證實(shí)。

筆者通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察SLFN11對(duì)L-OHP抑制腫瘤細(xì)胞作用的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)干預(yù)處理SLFN11基因表達(dá)減低后,L-OHP抑制SW480生長(zhǎng)作用顯著減弱。說(shuō)明SLFN11基因低表達(dá)可減低SW480細(xì)胞株對(duì)L-OHP的敏感度,這與既往研究SLFN11基因表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物敏感度的結(jié)論相一致,也與臨床研究結(jié)果相符[20,21]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),SLFN11低表達(dá),可顯著減低L-OHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯,主要影響集中在細(xì)胞周期G2/M期,與L-OHP引起腫瘤細(xì)胞 G2/M 期停滯相一致,這更進(jìn)一步證實(shí)了SLFN11表達(dá)水平影響L-OHP抗腫瘤效應(yīng)。

對(duì)于CRC患者,以L-OHP為基礎(chǔ)的化療方案和以伊立替康(CPT-11)為基礎(chǔ)的化療均是重要的一線或二線化療方案,而SLFN11被發(fā)現(xiàn)與包含CPT-11的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑敏感度也密切相關(guān),那么對(duì)于CRC患者,SLFN11基因表達(dá)顯得尤為重要,可以考慮作為化療藥物選擇的預(yù)測(cè)基因,對(duì)患者進(jìn)行L-OHP或CPT-11藥物治療的分層篩選,盡可能指導(dǎo)個(gè)體化治療,從而提高患者的有效治療。