祖玥,梁研,孫若嵐,趙凡,卞勇,唐德才,尹剛

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,江蘇 南京 210023)

卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤首位[1]。OC發(fā)病具有隱匿性和進(jìn)展迅速性特點(diǎn),大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期,嚴(yán)重影響臨床治療效果,對(duì)婦女生命健康造成極大危害。中醫(yī)藥在卵巢癌防治方面優(yōu)勢(shì)明顯[2-3],卵巢癌在中醫(yī)屬“癥瘕”“積聚”“腸蕈”等范疇,多為陰陽(yáng)失調(diào),臟腑虛弱,外邪入侵人體搏結(jié)氣血,氣血瘀滯,久成積聚而發(fā)病,治療以補(bǔ)氣活血為主[4-5]。黃芪、莪術(shù)配伍在臨床上治療消化道腫瘤效果良好[6],且課題組前期研究證實(shí)黃芪、莪術(shù)配伍能夠有效抑制卵巢癌的生長(zhǎng),與調(diào)控腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)[7-8],但作用機(jī)制尚未明確。本文擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、LC-MS及分子對(duì)接技術(shù),構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”、靶點(diǎn)互作(PPI)、靶點(diǎn)功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡(luò),分析黃芪-莪術(shù)藥對(duì)治療卵巢癌的有效成分和作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 LC-MS技術(shù)定量分析黃芪-莪術(shù)藥對(duì)代表性成分

1.1.1 材料 黃芪為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根,莪術(shù)為溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖,均購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院中藥房,并由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳啟南教授鑒定。

芒柄花素(Formononetin,F27J7S18516)、毛蕊異黃酮(Calycosin,Y24N9Y75652)、黃芪皂苷Ⅱ(Astragaloside Ⅱ,YM0306HD14)、黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,J04M8T30363)、芒柄花苷(Ononin,R28O8F46957)及毛蕊異黃酮葡萄糖苷(Calycosin-7-glucoside,Y27F9H54731)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;大豆皂苷Bb(Soyasaponin Ⅰ,LW18020501)及姜黃素(Curcumin,LW17091410)購(gòu)自南京良緯生物科技有限公司;吉馬酮(Germacron,PS010352);去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin,PS000767);雙去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin,PS010211)購(gòu)自成都普思生物科技有限公司。所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥98%。

1.1.2 儀器 Vanquish UHPLC超高效液相色譜系統(tǒng)(Thermo,USA);TSQ Quantis三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀,配有HESI、APCI離子源(Thermo ScientificTMTSQ QuantisTM,USA);Milli-Q Gradient A10超純水器(Millipore,USA); Labconco CentriVap冷凍離心濃縮儀(Labconco,USA);Centrifuge 5804R大型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf,Germany)。

1.1.3 樣本制備 黃芪-莪術(shù)水煎液的制備:稱(chēng)取黃芪10 g和莪術(shù)5 g,加10倍量純水回流提取2次,每次1 h,裝載揮發(fā)油測(cè)定器收集揮發(fā)油,合并2次上清液,旋蒸濃縮后加入揮發(fā)油定容至15 mL,過(guò)0.22 μm微孔濾膜并稀釋成50 mg·mL-1的供試品溶液。

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制:分別取上述標(biāo)準(zhǔn)品配制1.0 mg·mL-1的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品母液(單標(biāo)),稀釋成500 ng·mL-1,進(jìn)樣確定方法學(xué);后單標(biāo)配成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(混標(biāo)),并梯度稀釋:1、5、10、25、50、100、250、500、1000 ng·mL-1。

1.1.4 檢測(cè)條件 色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,江蘇漢邦),以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相,流速為0.25 mL·min-1,柱溫40 ℃,梯度洗脫(0～0.5 min,10% B;0.5～3 min,10%～25% B;3～9 min,25%～75% B;9～10 min,75%～100% B;10～12 min,100% B;12～12.1 min,100%～10% B;12.1～15 min,10%B)。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離源(H-ESI),正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)掃描,電壓均為3 kV,離子傳輸管溫度325 ℃,氣化溫度350 ℃,鞘氣壓50 arb,輔助氣壓10 arb。

1.1.5 數(shù)據(jù)分析 供試品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣測(cè)定,通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜圖確定相對(duì)分子質(zhì)量、各化學(xué)成分的保留時(shí)間等相關(guān)質(zhì)譜信息,結(jié)合提取離子流圖,獲得裂解的二級(jí)質(zhì)譜信息,與標(biāo)準(zhǔn)品、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)進(jìn)行半定性與定量分析黃芪-莪術(shù)藥對(duì)中的代表性成分。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC有效成分及作用機(jī)制

1.2.1 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)成分靶點(diǎn)收集 在上述LC-MS定量分析結(jié)果的基礎(chǔ)上,應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,收集篩選黃芪-莪術(shù)藥對(duì)活性成分及作用靶點(diǎn),在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取藥對(duì)活性成分PubChem CID編號(hào)及分子SDF結(jié)構(gòu)式,將其導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swiss target prediction.ch)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),以此作為T(mén)CMSP數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)信息的補(bǔ)充,最后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)進(jìn)行靶點(diǎn)名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.2 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的作用靶點(diǎn)獲取 以“Ovarian cancer”和“Ovarian carcinoma”為關(guān)鍵詞,通過(guò)Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)檢索、收集、合并OC的疾病靶點(diǎn)并標(biāo)準(zhǔn)化,將其與“1.2.1”中黃芪-莪術(shù)藥對(duì)成分靶點(diǎn)取交集,交集靶點(diǎn)即為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2.3 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC關(guān)鍵靶點(diǎn)及生物信息學(xué)分析 將“1.2.2”中黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.string-db.org/)獲得蛋白互作關(guān)系(protein-protein interaction,PPI),并在CytoScape中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),分析獲得相互作用網(wǎng)絡(luò)的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。并通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/gp/index.htmL)對(duì)黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能注釋(GO)和京都基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析。

1.2.4 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的確定 將黃芪-莪術(shù)藥對(duì)的所有活性成分、抗OC潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)及富集的前10條信號(hào)通路導(dǎo)入CytoScape構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò),并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)確定黃芪-莪術(shù)藥對(duì)發(fā)揮抗OC的核心成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及主要通路。

1.3 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

通過(guò)RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org)獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu),用PyMOL軟件(www.pymol.org)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水,利用AutoDockTools 1.5.6軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白受體和配體小分子進(jìn)行加氫等常規(guī)處理,以原配體為中心設(shè)置Grid Box,應(yīng)用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證,以結(jié)合自由能的高低作為與化合物結(jié)合程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS技術(shù)分析黃芪-莪術(shù)藥對(duì)代表性成分

比較相同色譜、質(zhì)譜條件下黃芪-莪術(shù)混合標(biāo)準(zhǔn)品及水煎液圖譜,根據(jù)質(zhì)譜所提供的保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片來(lái)定量分析其所含成分。總離子流圖見(jiàn)圖1,在正、負(fù)離子同時(shí)掃描的模式下從黃芪-莪術(shù)水煎液中共定量出11種成分,見(jiàn)表1。其中芒柄花素(Formononetin)、毛蕊異黃酮(Calycosin)、黃芪皂苷Ⅱ(Astragaloside Ⅱ)、黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)、芒柄花苷(Ononin)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(Calycosin-7-glucoside)、大豆皂苷Bb(Soyasaponin Ⅰ)來(lái)源于黃芪;吉馬酮(Germacron)、姜黃素(Curcumin)、去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin)及雙去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin)來(lái)源于莪術(shù)。

表1 正負(fù)離子模式下,黃芪-莪術(shù)水煎液中成分特征信息及含量

注:A.混合標(biāo)準(zhǔn)品;B.黃芪-莪術(shù)水煎液;C.定量的11種成分

2.2 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC成分及作用機(jī)制

2.2.1 活性成分篩選及其靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在前期研究[9]及上述LC-MS定量分析結(jié)果的基礎(chǔ)上,以ADME屬性值“口服利用度(Oral bioavailability, OB)≥30%”“藥物相似性(Drug likeness, DL)≥0.18”在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)篩選黃芪-莪術(shù)藥對(duì)活性成分,未出現(xiàn)在該數(shù)據(jù)庫(kù)或不滿足上述參數(shù)設(shè)定條件但通過(guò)查閱文獻(xiàn)(https://www.cnki.net)報(bào)道有明確抗腫瘤活性的化學(xué)成分也納入研究[10-17]。共確定67個(gè)化合物為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)潛在活性成分,見(jiàn)表2。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取藥對(duì)成分靶點(diǎn)682個(gè),SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充成分靶點(diǎn)2 673個(gè),經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化及合并、去重后共獲得黃芪-莪術(shù)藥對(duì)潛在成分靶點(diǎn)684個(gè),為后續(xù)相關(guān)通路的預(yù)測(cè)及核心成分的確定做準(zhǔn)備。

表2 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)活性成分信息

2.2.2 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的作用靶點(diǎn)獲取 Drugbank、DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、收集、合并OC的疾病靶點(diǎn)并標(biāo)準(zhǔn)化后獲得OC疾病靶點(diǎn)1 518個(gè)。將其與“2.2.1”中684個(gè)黃芪-莪術(shù)藥對(duì)成分靶點(diǎn)在Venny 2.1.0中取交集繪制韋恩圖,252個(gè)交集靶點(diǎn)即為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的潛在作用靶點(diǎn),將“2.2.1”中67個(gè)黃芪-莪術(shù)藥對(duì)潛在活性成分與252個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的潛在核心成分可能為黃芪中黃酮類(lèi)化合物及莪術(shù)中姜黃素類(lèi)化合物。

注:A.交集靶點(diǎn)韋恩圖;B.黃芪-莪術(shù)藥對(duì)“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖;黃色菱形為藥物成分;紅色圓形為蛋白靶點(diǎn);節(jié)點(diǎn)大小與Degree值成正比

2.2.3 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 將“2.2.2”中黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白互作關(guān)系(Protein-protein interaction,PPI),并導(dǎo)入CytoScape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?經(jīng)“度中心性”(Degree),“中介中心性”(Betweenness),“接近中心性”(Closeness)3個(gè)參數(shù)均比中位數(shù)大為依據(jù)篩選得到前21個(gè)靶點(diǎn)作為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn),并通過(guò)degree值排序,使用CytoScape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),如圖3所示,圖中節(jié)點(diǎn)大小與degree值成正比關(guān)系。其中度值最高的TP53(Tumor suppressor p53)可與182個(gè)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行互作。

圖3 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.2.4 生物信息學(xué)分析 基于Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合R軟件對(duì)252個(gè)黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析得到的生物過(guò)程(Biological process,BP)、分子功能(Molecular function,MF)、細(xì)胞組分(Cellular component,CC)富集結(jié)果如圖4A～C所示,主要涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移、化學(xué)應(yīng)激調(diào)控等生物過(guò)程,其影響的分子功能主要為蛋白激酶活性及其結(jié)合等方面。KEGG分析共得到40條與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的信號(hào)通路,前10條與黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC相關(guān)度最高,如圖4D所示,主要包括MAPK、HIF-1信號(hào)通路等,推測(cè)黃芪-莪術(shù)藥對(duì)可能是通過(guò)關(guān)鍵靶點(diǎn)作用于這些信號(hào)通路從而發(fā)揮抗OC作用,接下來(lái)將進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)-主要通路的網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步驗(yàn)證。

注:A～C.GO富集結(jié)果;D～E.KEGG富集結(jié)果

2.2.5 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)核心成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、主要通路的確定 將篩選到的黃芪-莪術(shù)藥對(duì)前10個(gè)潛在核心成分、21個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)、10條信號(hào)通路運(yùn)用Cytoscape構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)。如圖5所示,黃芪中的黃酮類(lèi)化合物槲皮素(AR2,Quercetin)、山柰酚(AR15,Kaempferol)、異鼠李素(AR6, Isorhamnetin)等和莪術(shù)中姜黃素類(lèi)化合物去甲氧基姜黃素(CR8,Demethoxycurcumin)、雙去氧基姜黃素(CR23,Bisdemethoxycurcumin)連接度相對(duì)較高(前10,Degree>60),推測(cè)其可能為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)發(fā)揮抗OC作用的核心活性成分。結(jié)合“2.2.3”中PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果,HSP90AA1、EGFR、ESR1、AKT1、SRC、VEGFA等靶點(diǎn)連接度較高(PPI前21,Degree>110),可能為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)發(fā)揮抗OC的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。如圖所示,21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)無(wú)孤立靶點(diǎn),均能與主要通路產(chǎn)生連接,進(jìn)一步說(shuō)明黃芪-莪術(shù)藥對(duì)可能是通過(guò)關(guān)鍵靶點(diǎn)作用于這些通路發(fā)揮抗OC作用,但相互作用網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜,多個(gè)潛在靶點(diǎn)與多種化合物相互作用、與多條信號(hào)通路產(chǎn)生聯(lián)系,提示黃芪-莪術(shù)藥對(duì)是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路調(diào)節(jié)方式發(fā)揮抗OC作用。

注:黃色菱形為藥物成分;紅色圓形為蛋白靶點(diǎn);綠色菱形為信號(hào)通路;節(jié)點(diǎn)大小與Degree值成正比

2.3 分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證黃芪-莪術(shù)藥對(duì)潛在核心成分與靶點(diǎn)結(jié)合能

據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果,利用AutoDock Vina[18]對(duì)“2.2.5”結(jié)果中的21個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)(PPI前21,Degree值>110)與“2.2.2”結(jié)果黃芪、莪術(shù)中10個(gè)核心活性成分(成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)前10,degree值>60)進(jìn)行分子對(duì)接以驗(yàn)證分析黃芪-莪術(shù)藥對(duì)能否通過(guò)上述潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮抗OC的作用。如果活性成分能夠與靶點(diǎn)蛋白發(fā)生相互作用,這必然在蛋白靶點(diǎn)的活性位點(diǎn)附近發(fā)生,如此能夠引起蛋白結(jié)構(gòu)功能的改變,進(jìn)而影響相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生變化。以大分子原配體位置為活性口袋,即Grid Box模塊以原配體位置為中心(原配體見(jiàn)表3);其他參數(shù)設(shè)置“x: 40, y: 40, z: 40”“Spacing: 0.375”進(jìn)行分子對(duì)接,通常配體與受體結(jié)合能越低,結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定。結(jié)合能小于-4.25 kcal·mol-1(1 kcal≈4.185 85 kJ)提示配體與受體有一定的結(jié)合活性,小于-5.0 kcal·mol-1有較好的結(jié)合活性,小于-7.0 kcal·mol-1有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[19]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),10種活性成分與21個(gè)蛋白靶點(diǎn)均有較強(qiáng)烈的結(jié)合能力,見(jiàn)表3。用PyMOL軟件對(duì)黃芪、莪術(shù)單個(gè)藥味中結(jié)合能最強(qiáng)的成分與靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化(Quercetin-ERBB2、Demethoxycurcumin-MAPK3),可見(jiàn)分子對(duì)接預(yù)測(cè)槲皮素會(huì)通過(guò)MET-125以及LYS-71在ERBB2的活性口袋與兩個(gè)氫鍵結(jié)合。去甲氧基姜黃素被預(yù)測(cè)通過(guò)氫鍵連接LYS-753結(jié)合至MAPK3的活性口袋,見(jiàn)圖6。

表3 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果(kcal·mol-1)

圖6 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接模式圖

3 討論

卵巢癌作為死亡率較高的婦科腫瘤疾病,其病理機(jī)制復(fù)雜,涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究表明,中藥可通過(guò)多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用,且毒副作用低、不易產(chǎn)生耐藥性,是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[3]。針對(duì)氣虛血瘀的腫瘤基本病機(jī),在臨床上運(yùn)用補(bǔ)氣活血化瘀法截?cái)嗄[瘤發(fā)展之勢(shì)是當(dāng)代臨床抗腫瘤治法中核心法則之一,張錫純?cè)凇夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中以黃芪配伍莪術(shù)為主藥治療“一切臟腑癥瘕、積聚”。黃芪、莪術(shù)相使為用,黃芪味甘性溫,有溫中益氣、補(bǔ)陽(yáng)利水之功,是補(bǔ)氣要藥;莪術(shù)辛散苦泄,溫通行滯,既能破血行氣,又能消積止痛。黃芪得莪術(shù)流通之性,補(bǔ)氣而不壅中,攻破并不傷正,補(bǔ)而不滯,增強(qiáng)扶正之效,脾氣旺盛則血循通暢,繼而激發(fā)莪術(shù)破血消癥,抑瘤削結(jié)。兩藥相伍,養(yǎng)祛并存,散中寓收,共奏扶正祛邪,修榮新脈之功,達(dá)遏制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的目的。

本研究通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)定量分析了黃芪-莪術(shù)藥對(duì)中代表性成分,如藥典中規(guī)定的黃芪質(zhì)量控制指標(biāo)黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷,及其他經(jīng)過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)含量較高、活性較好的成分,如芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花苷等;莪術(shù)主要含揮發(fā)油和姜黃素類(lèi)成分,前期我們對(duì)莪術(shù)中揮發(fā)油成分Curcumenol、Curdione、Isocurcumenol、Furanodienone、Curcumol和Germacrone進(jìn)行了定量分析[9],本實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充分析了姜黃素類(lèi)成分中的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和揮發(fā)油中的吉馬酮。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究基于LC-MS分析結(jié)果,分析得到黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的核心成分(有效成分),包括黃芪中的黃酮類(lèi)成分槲皮素、山柰酚、異鼠李素等及莪術(shù)中的姜黃素類(lèi)化合物去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素。本研究的數(shù)據(jù)收集不僅結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái),同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充了化學(xué)成分,可以較全面地將黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC活性成分考察在內(nèi)。

現(xiàn)代研究表明,黃芪、莪術(shù)具有明顯的抗腫瘤效應(yīng),槲皮素可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)多種腫瘤發(fā)揮作用,在防癌抗癌方面抑制多種酶參與的細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)途徑[20-21];山柰酚可顯著抑制小鼠腫瘤模型中的腫瘤生長(zhǎng)與肺轉(zhuǎn)移[22];異鼠李素可通過(guò)抑制缺氧環(huán)境中PI3K介導(dǎo)的適應(yīng)性自噬促進(jìn)MKN-45胃癌細(xì)胞的凋亡[23];姜黃素及其衍生物能夠通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)誘導(dǎo)人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GBM 8401細(xì)胞凋亡[24],還能顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[25],雖然去甲氧基姜黃素相對(duì)上述成分生物利用度較低,但研究表明,與姜黃素相比,其缺少與苯環(huán)直接相連的甲氧基,這種細(xì)微的差異導(dǎo)致去甲氧基姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,并具有顯著的抗癌活性[26],后續(xù)可通過(guò)開(kāi)發(fā)脂質(zhì)分散體、納米顆粒系統(tǒng)等來(lái)提高其生物利用度。在配伍抗腫瘤方面,黃芪甲苷與姜黃素聯(lián)用可降低肝癌細(xì)胞微血管計(jì)數(shù)以及血管生成相關(guān)因子的表達(dá),促進(jìn)血管正常化[27]。黃芪與莪術(shù)配伍的水煎劑抗腫瘤作用亦顯著[28-31],且兩者配伍抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的效果優(yōu)于單用黃芪、莪術(shù)[32]。由此可見(jiàn),以黃酮類(lèi)、姜黃素類(lèi)為代表的活性成分可能為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的物質(zhì)基礎(chǔ)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)亦存在局限性,如對(duì)活性成分的研究未把“量效”等關(guān)系考慮在內(nèi),從藥物作用特點(diǎn)來(lái)看,有些藥物的作用在宏量級(jí),有些藥物的作用在微量級(jí),需后續(xù)運(yùn)用現(xiàn)代儀器結(jié)合化學(xué)分析、組學(xué)分析手段加以?xún)?yōu)化。

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示,大量癌癥相關(guān)功能和信號(hào)通路出現(xiàn)顯著富集,如MAPK、HIF-1信號(hào)通路等,反映了OC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分子功能、生物過(guò)程和信號(hào)通路的紊亂。通過(guò)“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,得到黃芪-莪術(shù)藥對(duì)抗OC的關(guān)鍵靶蛋白HSP90AA1、EGFR、ESR1、AKT1、SRC、VEGFA等,其同一活性成分對(duì)應(yīng)多種靶點(diǎn)與多條疾病途徑或信號(hào)通路,同一靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)多種活性成分與多條疾病途徑或信號(hào)通路,顯示出成分、靶點(diǎn)與信號(hào)通路間的多協(xié)同作用。為了驗(yàn)證黃芪-莪術(shù)藥對(duì)中的核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力,利用AutoDock Vina工具[33-34]驗(yàn)證黃芪-莪術(shù)藥對(duì)中的10種潛在核心成分與相關(guān)度較高的21個(gè)潛在關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力,結(jié)果顯示10種核心活性成分與靶蛋白均具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。氫鍵的能量貢獻(xiàn)是由受體和供體之間的夾角和氫鍵的長(zhǎng)度決定的,氫鍵長(zhǎng)度不大于3.5 ?,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[35]。本次分子對(duì)接結(jié)果中,黃芪中的槲皮素與ERBB2的結(jié)合活性最強(qiáng)(-9.4 kcal·mol-1),其與MET-125以及LYS-71在ERBB2的活性口袋以?xún)蓚€(gè)氫鍵相連。氫鍵距離分別為3.0 ?、3.2 ?。莪術(shù)中的去甲氧基姜黃素與MAPK3的結(jié)合活性最強(qiáng)(-10.0 kcal·mol-1),其與LYS-753結(jié)合通過(guò)氫鍵連接,氫鍵距離分別為3.0 ?。提示黃芪、莪術(shù)中活性成分能夠與潛在核心靶點(diǎn)存在穩(wěn)定的氫鍵相互作用,黃芪-莪術(shù)藥對(duì)能夠通過(guò)作用于相應(yīng)靶蛋白發(fā)揮抗OC作用。

綜上所述,盡管中醫(yī)藥在防癌抗癌方面療效確切,但中藥成分復(fù)雜,明確其有效成分及作用機(jī)制是目前亟待解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用、分子對(duì)接技術(shù)對(duì)黃芪、莪術(shù)抗OC的有效成分及作用機(jī)制進(jìn)行探究,以驗(yàn)證臨床運(yùn)用黃芪、莪術(shù)組方治療OC的合理性,為其后續(xù)療效評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選及深入機(jī)制研究提供思路和理論依據(jù)。