基于UPLC指紋圖譜結(jié)合色度值的槐花炮制前后變化規(guī)律研究

黃瑤,陳巧華,方朝纘,鄧怡芳,王文麗,胡懿,張志鵬

(廣東一方制藥有限公司,廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室,廣東 佛山 528244)

槐花為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花及花蕾,夏季采收,花開放時,稱為“槐花”,花未開放時,稱為“槐米”,味苦,性微寒,歸肝、大腸經(jīng),具有清肝瀉火,涼血止血的功效[1]。2020年版《中國藥典》中收載的槐花炮制品有炒槐花和槐花炭[1]。生品槐花性寒,多用于治療肝熱目赤,頭痛眩暈,炒黃后的槐花苦寒之性減弱,炒炭后的槐花則澀性增強,多用于出血證的治療。槐花主要含有的蘆丁、槲皮素等黃酮類化學(xué)成分[2]是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)?；被ㄅ谥七^程中藥效的變化通常伴隨著化學(xué)成分的改變,馬艷琴等[3]發(fā)現(xiàn)不同槐花炮制品中總黃酮提取率有明顯的不同,炒制槐花最高(14.23%),其次為生品槐花(13.17%),最后是槐花炭(9.31%)。朱洪劍等[4]對比了槐花炮制前后蘆丁、槲皮素以及鞣質(zhì)的含量變化,發(fā)現(xiàn)蘆丁和鞣質(zhì)的含量高低順序為:炒槐花>槐花生品>槐花炭,而槲皮素的含量高低順序則為:槐花炭>槐花生品>炒槐花。研究發(fā)現(xiàn),中藥飲片炮制過程中飲片的外觀色澤與內(nèi)在化學(xué)成分的變化存在一定關(guān)聯(lián)性[5-6]?；被ǔ粗坪?顏色亦發(fā)生了明顯的變化,槐花生品呈黃綠色,炒槐花呈深黃色,槐花炭則呈焦褐色[1]?？梢?研究槐花炮制過程中整體化學(xué)成分與飲片外觀顏色的變化規(guī)律對指導(dǎo)槐花的炮制與鑒別具有重要意義。中藥指紋圖譜是能夠呈現(xiàn)中藥整體化學(xué)組分的一種綜合、可量化的鑒定手段,主要用于評價中藥及其制劑的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性[7]。本研究擬建立槐花炮制前后的UPLC指紋圖譜,并結(jié)合多模式識別分析方法對槐花生品、炒槐花及槐花炭化學(xué)成分進行系統(tǒng)的分析;采用分光測色儀采集槐花生品、炒槐花及槐花炭飲片粉末的色度值;同時分析槐花炮制過程中指紋圖譜與色度值的動態(tài)變化規(guī)律,以期為槐花生品及其炮制品的鑒別以及炮制工藝研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

C21-WK2102型多功能電磁爐(美的集團有限公司);H-Class型超高效液相色譜儀(美國沃特世公司);MilliQDirect型超純水系統(tǒng)(德國默克公司);ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);111B型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司);TS7700型分光測色儀(深圳市三恩時科技有限公司)。

1.2 試劑與藥材

5-羥甲基糠醛(批號:111626-202215,純度為98.7%)、原兒茶酸(批號:110809-201906,純度為97.7%)、蘆丁(批號:100080-202012,純度為92.2%)、異槲皮苷(批號:111809-201804,純度為97.2%)、水仙苷(批號:111997-201501,純度為93.1%)、槲皮素(批號:100081-201610,純度為99.1%)、山柰素(批號:110861-202013,純度為93.2%)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號:112007-202103,純度為100%)均購自中國食品藥品檢定研究院;色譜級乙腈(德國默克公司);色譜級磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);其余試劑均為分析純,水為超純水。

16批槐花藥材(編號H1～H16)經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定,均為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花。16批炒槐花飲片(編號C1～C16)和16批槐花炭飲片(編號T1～T16)均為廣東一方制藥有限公司技術(shù)中心實驗室自制?；被▉碓淳唧w信息見表1。

表1 16批槐花生品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 炒槐花、槐花炭飲片的制備

炒槐花:分別取編號H1～H16的槐花生品藥材,按2020年版《中國藥典》通則0213清炒法炒至表面深黃色,得編號為C1～C16的炒槐花飲片。

槐花炭:分別取編號H1～H16的槐花生品藥材,按2020年版《中國藥典》通則0213炒炭法炒至表面焦褐色,得編號為T1～T16的槐花炭飲片。

2.2 色譜條件

采用Agilent ZORBA XRRHD StableBond C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)為色譜柱;以乙腈為流動相A,以0.1%的磷酸水溶液為流動相B,梯度洗脫(0～5 min,12%～18%A;5～9 min,18%～19%A;9～21 min,19%～35%A;21～22 min,35%～90%A;22～23 min,90%～12%A;23～30 min,12%A);柱溫:40 ℃;流速:0.20 mL·min-1;檢測波長:257 nm;進樣量:1 μL。

2.3 對照品溶液的制備

分別取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解,制成質(zhì)量濃度分別為25.68、36.11、62.75、25.08、25.40、28.77、36.47、31.32 μg·mL-1的混合對照品溶液,即得。

2.4 供試品溶液的制備

取樣品粉末(過2號篩)約0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放至室溫,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密稱取編號H16的樣品粉末1份,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,以8號峰(蘆丁)為參照峰S,計算各共有峰相對保留時間RSD值為0.02%～0.24%,相對峰面積的RSD值為0.14%～2.74%,說明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 精密稱取編號H16的樣品粉末6份,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件進樣測定,以8號峰(蘆丁)為參照峰S,計算各共有峰相對保留時間RSD值為0.04%～0.26%,相對峰面積的RSD值為0.75%～2.54%,說明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取編號H16的樣品粉末1份,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件,分別于0、2、4、8、12、16、24 h進樣測定,以8號峰(蘆丁)為參照峰S,計算各共有峰相對保留時間RSD值為0.04%～0.90%,相對峰面積的RSD值為0.43%～2.77%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 UPLC指紋圖譜研究

2.6.1 UPLC指紋圖譜的生成 取16批槐花生品、炒槐花及槐花炭樣品粉末,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,“2.2”項下色譜條件進樣測定,采集色譜圖,將所得色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》分析軟件,分別以編號H1的槐花生品、編號C1的炒槐花、編號T1的槐花炭色譜圖為參照圖譜,時間窗寬度設(shè)為0.1 min,通過多點校正對16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的色譜圖進行全譜峰匹配,對照圖譜生成方法選擇中位數(shù)法,生成槐花生品、炒槐花及槐花炭的對照圖譜。16批槐花生品、炒槐花及槐花炭UPLC指紋圖譜見圖1～3。16批槐花生品標(biāo)定了15個共有峰,16批炒槐花標(biāo)定了16個共有峰,16批槐花炭標(biāo)定了14個共有峰,其中:峰1和峰2(5-羥甲基糠醛)在槐花生品中均未檢出,在炒槐花中均能檢出;峰1在部分批次槐花炭中能檢出,峰2(5-羥甲基糠醛)在槐花炭中均能檢出;峰17在槐花生品中均能檢出,但在炒槐花和槐花炭中均未檢出。由此說明槐花生品、炒槐花、槐花炭3者的化學(xué)成分組成差異較大,且峰1、峰2(5-羥甲基糠醛)和峰17可用于區(qū)分3者。

圖1 16批槐花生品UPLC指紋圖譜

圖2 16批炒槐花UPLC指紋圖譜

圖3 16批槐花炭UPLC指紋圖譜

2.6.2 色譜峰指認 取“2.3”項下的對照品溶液,按“2.2”項下色譜條件進樣測定,采集色譜圖。通過與對照品色譜圖的對比,指認了峰2、峰3、峰8、峰9、峰10、峰11、峰14、峰15分別為5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素。槐花生品、炒槐花及槐花炭的對照圖譜見圖4,對照品圖譜見圖5。

圖4 槐花生品(H-R)、炒槐花(C-R)和槐花炭(T-R)對照圖譜

注:2.5-羥甲基糠醛;3.原兒茶酸;8.蘆丁;9.異槲皮苷;10.山柰酚-3-O-蕓香糖苷;11.水仙苷;14.槲皮素;15.山柰素

2.6.3 相似度評價 分別以槐花生品、炒槐花及槐花炭的對照圖譜為參照,計算16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的相似度,結(jié)果見表2。16批槐花生品的相似度范圍為0.996～1.000,16批炒槐花的相似度范圍為0.999～1.000,16批槐花炭的相似度范圍為0.979～1.000,表明槐花樣品批間質(zhì)量差異較小,且炮制后的樣品批間質(zhì)量也較穩(wěn)定。

表2 16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的UPLC指紋圖譜相似度

2.7 槐花生品與炮制品的色度值測定

采用分光測色儀對16批槐花生品與炮制品的樣品粉末色度值進行測定,光源設(shè)置為D65,視場選擇10度視角,測定孔徑4 mm,進行儀器黑白校正后,分別取16批槐花生品、炒槐花、槐花炭粉末適量,均勻平鋪于載玻片上,平鋪的厚度約為1 mm,測定粉末色度值L*、a*、b*,平行測定3 次,取平均值。16批槐花生品、炒槐花及槐花炭樣品粉末色彩圖像見圖6,色度值結(jié)果見表3。

圖6 16批槐花生品、炒槐花及槐花炭樣品粉末色彩圖像

表3 16批槐花生品與炮制品的色度值結(jié)果

表4 16批槐花生品到炮制品色度值變化結(jié)果

2.8 槐花生品與炮制品的多元統(tǒng)計分析

2.8.1 單因素方差分析 將16批槐花生品及炮制品UPLC指紋圖譜的17個共有峰的峰面積(缺失的色譜峰峰面積以0計)按峰面積/稱樣量/1 000計算比值后與色度值(L*、a*、b*)導(dǎo)入SPSS20.0軟件,進行單因素方差分析,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,與槐花生品相比,炒槐花中的峰1、2、3、7、8、9、10、12、13、14、16、17的峰面積/稱樣量/1 000比值及色度值(L*、a*)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與槐花生品相比,槐花炭中的峰1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、15、17的峰面積/稱樣量/1 000比值及色度值(L*、a*、b*)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與炒槐花相比,槐花炭中的峰1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16的峰面積/稱樣量/1 000比值及色度值(L*、a*、b*)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),這說明槐花生品經(jīng)炮制后其內(nèi)在質(zhì)量與外在顏色均發(fā)生了較大的變化,其中炒炭后變化較為明顯。

表5 槐花生品與炮制品共有峰的峰面積/稱樣量/1 000比值及色度值方差分析結(jié)果

2.8.2 聚類分析及主成分分析 將16批槐花生品及炮制品UPLC指紋圖譜的17個共有峰的峰面積(缺失的色譜峰峰面積以0計)按峰面積/稱樣量/1 000計算比值后與色度值(L*、a*、b*)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件,進行聚類分析和主成分分析。結(jié)果提取到3個特征值大于1的主成分,其中主成分1的方差貢獻率為51.629%,主成分2的方差貢獻率為27.095%,主成分3的方差貢獻率為11.456%,3個主成分累積方差貢獻率為90.179%,說明提取到的3個主成分即可反映槐花生品、炒槐花及槐花炭UPLC指紋圖譜90.179%的信息,結(jié)果見表6。

表6 特征值、方差貢獻率及累積方差貢獻率

聚類分析樹狀圖(圖7)和主成分分析二維得分圖(圖8)均可明顯區(qū)分槐花生品、炒槐花和槐花炭。

圖7 16批槐花生品及炮制品聚類分析樹狀圖

圖9 16批槐花生品及炮制品的OPLS-DA得分圖

圖10 16批槐花生品及炮制品VIP值圖

2.9 槐花炒制過程指紋圖譜與色度值動態(tài)變化分析

2.9.1 槐花炒制過程飲片樣品的制備 取槐花藥材(H1),按2020年版《中國藥典》槐花炮制項下規(guī)定,除去雜質(zhì)及灰屑,得槐花飲片。將電磁爐溫度加熱至160 ℃左右時,投入槐花飲片,自0 min起,每間隔2 min取樣1次(共炒制46 min),放冷,得24份不同取樣時間點的槐花炒制的飲片樣品。

2.9.2 指紋圖譜的采集 分別取上述24份不同取樣時間點槐花炒制的飲片樣品粉末,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件進樣測定,記錄每份樣品的色譜圖和17個色譜峰的峰面積,缺失的色譜峰峰面積以0計,所得峰面積按峰面積/稱樣量/1 000計算比值,結(jié)果見表7。24份不同取樣時間點的樣品UPLC指紋圖譜見圖11。

圖11 槐花炒制過程不同取樣時間點飲片樣品UPLC指紋圖譜

由表7可知,峰1～2在0 min時峰面積/稱樣量/1 000比值為0,炒制2 min時該比值分別為10、4,由此推測峰1和峰2為炒制過程中新增的化合物。在46 min內(nèi),隨著炒制時間的延長,峰1～峰16峰面積/稱樣量/1 000比值整體上均呈現(xiàn)先增大后減小的規(guī)律,峰17則呈現(xiàn)一直減小的規(guī)律,其中有7個色譜峰(峰1、4、5、6、7、13、17)分別在炒制18、46、32、44、32、30、10 min時峰面積/稱樣量/1 000比值下降為0,其余色譜峰在炒制一段時間后峰面積/稱樣量/1 000比值也發(fā)生了不同程度的下降,表明槐花在炒制過程中其化學(xué)成分受熱極不穩(wěn)定,同時也說明了控制炮制時間對化學(xué)成分的保留至關(guān)重要,以保證臨床用藥的有效性。

由“2.6.2”項下結(jié)果可知,峰2、峰3、峰8、峰9、峰10、峰11、峰14、峰15分別指認為5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素,其中蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素,均為黃酮類成分。研究表明,黃酮類成分具有抑菌抗炎、抗自由基、抗氧化等多種生物活性,是槐花生品及其炮制品的主要藥效成分。峰8(蘆丁)、峰10(山柰酚-3-O-蕓香糖苷)和峰11(水仙苷)的峰面積/稱樣量/1 000比值在炒制0～8 min內(nèi)均變化不大,在2 min左右均處于最大值,與0 min時相比,炒至46 min時該比值分別下降了99%、99%、97%;峰15(山柰素)在6 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達到最大值,其中0～8 min內(nèi)變化不明顯;峰14(槲皮素)在8 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達到最大值,其中4～8 min內(nèi)變化不明顯,與0 min時相比,炒至46 min時該比值下降了74%;峰9(異槲皮苷)在10 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達到最大值。表明槐花主要黃酮類成分在炒制10 min內(nèi)含量可達到最大值,峰8(蘆丁)為槐花最主要的有效成分,其峰面積/稱樣量/1 000比值最大,在炒制2 min左右該比值已達到最大。

峰2(5-羥甲基糠醛)為炒制2 min內(nèi)新產(chǎn)生的化合物,在12 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達到最大值,峰3(原兒茶酸)在8 min左右峰面積/稱樣量/1 000比值達到最大值。相關(guān)藥理研究表明,5-羥甲基糠醛具有雙向的作用,在具有較好的抗氧化、抗炎、抗過敏、保護神經(jīng)細胞等作用的同時,也具有刺激眼睛、黏膜、皮膚,神經(jīng)毒性等毒副作用[9-11]。因此,在炮制過程中控制5-羥甲基糠醛的含量對臨床用藥的安全性亦不可忽視。

圖12 槐花炒制過程不同取樣時間點飲片樣品粉末色彩圖像

圖13 槐花炒制過程中色度值的變化情況

結(jié)果顯示,槐花炒制過程中,0～46 min內(nèi)明度值L*、黃藍色值b*以及總色值E*總體均呈現(xiàn)下降趨勢,其中下降最明顯的為明度值L*,下降幅度為54,下降了約84%,黃藍色值b*在0～8 min變化不大,8～46 min下降明顯,0～46 min下降幅度為26,下降了約81%,紅綠色值a*則先增大后減小,但整體變化不明顯,表明樣品明度由亮變暗,顏色由黃色到焦黑色轉(zhuǎn)變。色差ΔE*隨著炒制時間的延長呈現(xiàn)不斷升高的趨勢,其值越大,代表與參照樣品色值相差越大,當(dāng)炒制2 min時樣品ΔE*=8,大于3.5[6],表明炒制2 min時飲片顏色變化即可被肉眼識別。炒制4～6 min時,飲片的色度值L*、a*、b*、E*基本落在“2.7”項下炒槐花的色度值浮動范圍內(nèi),故以飲片色澤為評價指標(biāo)時,在160 ℃的炒制溫度下,炒槐花的炒制時間以4～6 min為宜。炒制14～18 min時,飲片的色度值L*、a*、b*、E*基本落在“2.7”項下槐花炭的色度值浮動范圍內(nèi),故以飲片色澤為評價指標(biāo)時,在160 ℃的炒制溫度下,槐花炭的炒制時間以14～18 min為宜。

2.10 槐花炒制過程關(guān)鍵指標(biāo)成分的相對含量與色度值的相關(guān)性分析

“2.8.3”項下結(jié)果表明,蘆丁和槲皮素的相對含量是槐花生品、炒槐花、槐花炭差異的關(guān)鍵指標(biāo)。此外,5-羥甲基糠醛也是炮制后新增的化學(xué)成分。因此,為驗證槐花炮制過程中,上述指標(biāo)成分相對含量與飲片色度值的關(guān)聯(lián)性,本研究采用SPSS20.0對槐花炒制過程關(guān)鍵指標(biāo)成分5-羥甲基糠醛、蘆丁、槲皮素的相對含量與色度值進行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果見表8。結(jié)果顯示,槐花炮制過程中,5-羥甲基糠醛的相對含量與色度值a*及色差值Δa*呈顯著正相關(guān);蘆丁和槲皮素的相對含量與色度值L*、a*、b*、E*及色差值ΔL*、Δa*、Δb*呈顯著正相關(guān),與色差值ΔE*呈顯著負相關(guān)。

圖14 槐花炒制過程中色差值的變化情況

表8 槐花炒制過程中關(guān)鍵指標(biāo)成分的相對含量與色度值的相關(guān)性

3 討論

3.1 槐花生品、炒槐花及槐花炭的指紋圖譜與色度值分析

傳統(tǒng)的飲片炮制主要是依賴于人的感官與經(jīng)驗,通過判斷飲片的外觀顏色從而決定飲片的炮制終點,這存在一定的主觀性和模糊性。1976年由照明委員會(CIE)提出的CIELAB均勻顏色空間理論,可以實現(xiàn)對顏色的準(zhǔn)確描述,使樣品顏色可以量化表達,已廣泛應(yīng)用于印染顏料制造、涂料、塑料著色等領(lǐng)域中[12]。近年來,基于該理論,不少學(xué)者利用色差儀測定中藥的外觀顏色以獲取樣品的色度值,從而對樣品顏色進行客觀量化,用于彌補傳統(tǒng)中藥鑒別中對顏色判斷的不足。

本研究根據(jù)現(xiàn)行版《中國藥典》槐花項下規(guī)定,對炒槐花和槐花炭進行了炮制,并基于CIELAB均勻顏色空間理論,采用分光測色儀對槐花生品、炒槐花以及槐花炭的顏色進行量化。在炒槐花和槐花炭炮制過程中,不僅存在顏色的變化,同時也會伴隨著化學(xué)成分組成與含量的變化,外在顏色是判斷炒槐花及槐花炭炮制程度的重要參考指標(biāo),而內(nèi)在化學(xué)成分含量則是評價二者質(zhì)量的重要依據(jù)。因此,本研究基于UPLC指紋圖譜與色度值,對槐花炮制前后飲片的差異進行多元統(tǒng)計分析。

由單因素方差分析結(jié)果可知,槐花生品、炒槐花、槐花炭不僅外觀顏色有差異,化學(xué)成分的組成與含量也存在較大差異,峰1和峰2(5-羥甲基糠醛)為炒黃后產(chǎn)生的化學(xué)成分,而峰17則為炒黃和炒炭后消失的成分?；被ㄉ肪哂泻軓姷那甯螢a火、清熱涼血作用,多用于血熱妄行,肝熱目赤,頭痛眩暈,瘡毒腫痛;炒槐花苦寒之性緩和,清熱涼血作用減弱,止血作用增強但弱于槐花炭,多用于脾胃虛弱的出血患者;槐花炭清熱涼血作用極弱,澀性增強,以止血力勝,多用于咯血、便血、崩漏下血等出血證。故在臨床使用時,止血多炒炭用,而清熱瀉火則生用,這可能與槐花經(jīng)過炮制后化學(xué)成分的組成與含量發(fā)生變化有關(guān)[3]。

聚類分析、主成分分析以及OPLS-DA均可將槐花生品、炒槐花和槐花炭明顯區(qū)分,且蘆丁和槲皮素是引起槐花生品、炒槐花和槐花炭之間差異的主要成分。蘆丁為槐花生品及其炮制品中含量最高的黃酮類成分,其次是槲皮素,因此,槐花生品、炒槐花及槐花炭中蘆丁和槲皮素含量的差異可能是導(dǎo)致3者臨床療效差異的主要原因之一。

3.2 槐花炮制過程的指紋圖譜與色度值動態(tài)變化分析

為了進一步明確各色譜峰的峰面積隨炮制時間的延長其變化趨勢以及炮制過程中飲片顏色的變化情況,本研究對槐花炒制46 min內(nèi)17個色譜峰的峰面積/稱樣量/1 000比值和顏色值進行了研究。結(jié)果表明,炒制過程中峰1～16的峰面積/稱樣量/1 000比值均先增大后減小,峰17則一直減小,17個色譜峰的峰面積/稱樣量/1 000比值在炒制12 min內(nèi)均可達到最大值。在顏色變化方面,炒制過程中槐花飲片的外觀明亮度由明到暗,顏色由黃色到焦黑色轉(zhuǎn)變。5-羥甲基糠醛是葡萄糖等單糖在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的化合物[13],槐花炒制過程中5-羥甲基糠醛含量的升高可能是導(dǎo)致樣品顏色加深的原因。此外,蘆丁等黃酮類成分是槐花黃色素的主要成分,其在炒制一段時間后含量明顯下降,二者共同作用可能是導(dǎo)致L*和b*明顯降低的原因,故槐花炒制過程中樣品表觀顏色逐漸加深,整體從黃色到焦黑色轉(zhuǎn)變。

綜上,本研究建立的UPLC指紋圖譜結(jié)合色度值的方法可有效區(qū)分槐花生品、炒槐花和槐花炭,同時考察了槐花隨炮制時間的延長UPLC指紋圖譜與色度值的動態(tài)變化情況,可為槐花生品及其炮制品的鑒別以及炮制工藝研究提供參考。