禽肉、禽蛋中硝基呋喃代謝物殘留的UPLC-MS/MS 檢測方法研究

田 蘊(yùn) 陶 威 徐 偉 葛 敏 張競男 張?zhí)K珍 賀 燕 王益軍 徐顥瑋

（1連云港市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，江蘇連云港 222001；2宿遷市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，江蘇宿遷 223800）

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對大多數(shù)的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌及原蟲等病原體均有殺滅作用[1]。主要作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類的代謝，從而起抑菌作用，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于細(xì)菌性傳染病的治療和預(yù)防[2]。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體具有毒性，存在致癌、致畸和致突變的風(fēng)險(xiǎn)[3]，日本、歐盟和美國分別在1977、1995 和2002 年全面禁止將硝基呋喃類藥物用于食源性動(dòng)物[4]。我國也先后發(fā)布相關(guān)公告，將硝基呋喃類藥物列入禁用清單。2002 年4 月，農(nóng)業(yè)部第193 號(hào)公告將硝基呋喃類呋喃唑酮、呋喃它酮及制劑列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》；2005 年10 月，農(nóng)業(yè)部第560 號(hào)公告將呋喃妥因和呋喃西林及其鹽、酯及制劑列入首批《獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》中禁用獸藥類別；2019年12 月，農(nóng)業(yè)部第250 號(hào)公告將呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》。

硝基呋喃類藥物結(jié)構(gòu)中含有5 元雜環(huán)，化學(xué)穩(wěn)定性較差，原型藥在生物體內(nèi)代謝很快，但其代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)結(jié)合物比較穩(wěn)定，所以通常以其代謝物為目標(biāo)分析物來測定其含量。硝基呋喃代謝物的檢測方法主要有膠體金免疫法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5]。近年來，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，硝基呋喃類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法不斷得到優(yōu)化[6-7]，因其快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用。由于雞蛋中蛋白、脂肪含量非常高且基質(zhì)復(fù)雜，關(guān)于禽蛋與禽肉同時(shí)檢測硝基呋喃代謝物鮮有報(bào)道[8-9]。為此，本研究建立了同時(shí)檢測禽肉、禽蛋中4 種硝基呋喃代謝物（分子結(jié)構(gòu)見圖1）殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析法，以供參考。

圖1 4種硝基呋喃代謝物分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters UPLCTQS Micro）；電子天平（賽多利斯CPA225D）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma 3-30KS）；OasisHLB 固相萃取柱（Waters）等。

1.2 藥品與試劑

硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)品：呋喃它酮純度99.69%，呋喃西林純度99.80%，呋喃妥因純度99.38%，呋喃唑酮純度99.32%。硝基呋喃代謝物內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品：呋喃它酮-D5純度97.33%，呋喃西林-13C純度99.20%，呋喃妥因-D6 純度97.9%，呋喃唑酮-D4純度99.32%。甲醇、乙腈（色譜純，Supelco公司）；乙酸乙酯、鹽酸、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、2-硝基苯甲醛（分析純，國藥集團(tuán)）；甲酸（色譜純，aladdin公司）。鹽酸溶液，0.2 mol/L；磷酸氫二鉀溶液，0.1 mol/L；氫氧化鈉溶液，1.0 mol/L；衍生劑：0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛二甲亞砜溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 000 μg/mL：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，于10 mL 容量瓶中，分別用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL單標(biāo)儲(chǔ)備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取1.00 mL 的各單標(biāo)儲(chǔ)備液至同一10 mL 容量瓶，甲醇稀釋得100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18 ℃避光保存。混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：臨用前按上述方法稀釋得1 μg/mL、100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法同上。

1.4 樣品前處理

1.4.1 衍生準(zhǔn)確稱?。?.00±0.02）g試樣于50 mL離心管中，依次加入100 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液100μL、0.2 mol/L 鹽酸溶液5 mL，再加入0.05 mol/L 衍生劑100 μL。渦旋混勻，37 ℃恒溫烘箱中避光放置過夜（約16 h）。

1.4.2 凈化衍生后取出離心管冷卻至室溫，加入1 mL 0.1 moL/L 磷酸氫二鉀溶液，再用100 μL 的1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.4±0.2。10 000 r/min離心10 min，上清液用Oasis? HLB 固相萃取柱凈化。Oasis? HLB 固相萃取柱（Waters 公司，200 mg，6cc）分別用3.0 mL甲醇和3.0 mL水活化，所有樣液全部過柱，保持2～3 mL/min流速，用5.0 mL超純水淋洗固相萃取柱并吹干。加入5.0 mL 乙酸乙酯洗脫，洗脫液于40 ℃下氮吹至近干，殘?jiān)尤? mL 20%甲醇水溶液溶解，過0.2 μm濾膜得待測液。

1.5 分析條件

①色譜條件：色譜柱Waters Acquity BEH-C18（2.1 mm×100.0 mm，1.7μm）；進(jìn)樣量4μL；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水，流動(dòng)相B：甲醇；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表1。②質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓0.6 kV；去溶劑氣溫度500 ℃；去溶劑氣流速1 000 L/Hr。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件（電噴霧離子源正離子掃描ESI+模式）

用100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10 μL/min 的流速，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，獲得合適的母離子條件[10]，再對母離子進(jìn)行二級(jí)掃描，調(diào)節(jié)碰撞能量和錐孔電壓，篩選信號(hào)最強(qiáng)和次強(qiáng)子離子信號(hào)分別作為定量離子和定性離子，得出多反應(yīng)監(jiān)測條件。離子對、錐孔電壓、碰撞能量見表2。

表2 4種硝基呋喃代謝物及其同位素內(nèi)標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測條件

2.2 方法線性

精密量取適量硝基呋喃混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)混合溶液于50 mL離心管中，按照樣品同法處理，得濃度為0.5、1、2、5、10、20 ng/mL（內(nèi)標(biāo)物濃度為5 ng/mL）系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)特征離子峰面積比為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程及相關(guān)系數(shù)見表3。從表3可以看出，4中硝基呋喃濃度在0.5～20 ng/mL 呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2在0.999 11~0.999 54。

表3 4種硝基呋喃代謝物回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3 方法靈敏度

添加濃度為0.5 μg/kg時(shí)，測得S/N=10，得出4種硝基呋喃定量限為0.50 μg/kg。

2.4 回收率與精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，做添加回收試驗(yàn)。稱取禽肉、禽蛋的空白樣品，制成0.5、5.0、10.0 μg/kg 3 個(gè)濃度的添加樣品，每個(gè)樣品添加5個(gè)平行樣，按照上述方法進(jìn)行前處理，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表4可知，4種硝基呋喃回收率在禽肉中為90.0%～108.2%，RSD 2.0%～9.7%；禽蛋中為91.7%～108.7%，RSD在2.4%～9.8%。

表4 雞肉、雞蛋中硝基呋喃代謝物平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

每個(gè)濃度樣品重復(fù)測定3次，連續(xù)測定3 d，計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果見表5。禽肉中4種硝基呋喃代謝物日內(nèi)精密度為3.1%～9.8%，日間精密度為4.2%～9.5%；禽蛋中硝基呋喃代謝物日內(nèi)精密度為3.2%～9.4%，日間精密度為3.0%～7.9%。5.0 μg/kg禽肉加標(biāo)樣品4種藥物及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色譜見圖2。

表5 禽肉、禽蛋中硝基呋喃代謝物日內(nèi)、日間精密度

圖2 5.0 μg/kg禽肉加標(biāo)樣品4種藥物及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色譜

3 結(jié)論與討論

3.1 衍生劑用量

衍生劑的用量對測定結(jié)果有一定的影響，若用量不足，則衍生反應(yīng)不完全，實(shí)際測定值低于理論值；過量的衍生劑易產(chǎn)生結(jié)晶，影響譜圖基線，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。經(jīng)試驗(yàn)證明，本方法衍生劑量100 μL 較為合適。

3.2 pH值

樣品溶液的pH 對測定結(jié)果的影響較大，為提高硝基呋喃代謝物的衍生物提取和凈化效率，需要確保pH 值為7.4±0.2，用pH 計(jì)測定樣品pH 操作不便且耗時(shí)。經(jīng)大量試驗(yàn)，確定了禽肉、禽蛋樣品中調(diào)節(jié)pH 為7.4±0.2 時(shí)，所消耗1.0 moL/L 磷酸氫二鉀和2.0 moL/L 氫氧化鈉溶液的體積經(jīng)驗(yàn)值分別為1 mL、100 μL，為批量檢測節(jié)約了大量時(shí)間。

3.3 凈化條件

為了降低基質(zhì)效應(yīng)，本研究用Oasis? HLB 固相萃取柱凈化，用乙酸乙酯洗脫目標(biāo)分析物，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇水溶液復(fù)溶，獲得了理想的凈化效果和回收率。

3.4 分析條件

采用電噴霧離子源正離子掃描獲取化合物母離子和子離子信息，確定最佳定量離子對和定性離子對。通過對離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得了較好的響應(yīng)值。

3.5 注意事項(xiàng)

硝基呋喃類代謝物見光易分解，所有操作盡可能避光操作，所用溶液用棕色瓶存放，樣品經(jīng)處理后盡快上機(jī)分析。

4 結(jié)論

當(dāng)硝基呋喃代謝物濃度為1.0~10.0 μg/kg，禽肉中回收率為90.0%～108.2%，禽蛋中回收率為91.7%~108.7%，硝基呋喃代謝物檢出限為0.50 μg/kg。本試驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，操作簡便，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，適合大批量禽肉、禽蛋產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留的檢測分析。