基于GEO數據庫篩選濾泡性甲狀腺癌關鍵基因及生物信息學分析

陳保林 李佳陽 姜焱 羅承敏 鮑宇翔 閆忠梁 程曉明 呂俊遠

[摘要]?目的?濾泡性甲狀腺癌（follicular?thyroid?carcinoma，FTC）臨床上較少見，其在疾病早期即可發(fā)生血行轉移。本研究利用生物信息學方法探索FTC發(fā)生發(fā)展的關鍵基因、發(fā)掘FTC的致病機制及治療靶點。方法?從基因表達綜合數據庫（gene?expression?omnibus，GEO）下載基因芯片GSE82208，利用R軟件分析以獲得差異表達基因（differentially?expressed?genes，DEGs），利用數據庫注釋、可視化和綜合發(fā)現（database?for?annotation，visualization?and?integrated?discovery，DAVID）在線網站對DEGs進行基因本體論（gene?ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）富集分析。對DEGs行蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein?interaction，PPI）分析，并篩選核心基因，對核心基因進行生存分析。結果?共篩選獲得74個DEGs，其中表達上調基因61個，表達下調基因13個。GO富集在細胞對鋅離子的反應、細胞對鎘離子反應、細胞核及金屬離子結合等過程。KEGG信號通路富集在礦物質吸收信號通路。通過對PPI網絡分析，篩選出核心差異表達基因MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M、MT1X和MT2A共7個金屬硫蛋白基因。生存分析發(fā)現MT1F和MT1M與甲狀腺癌患者預后相關（P<0.05）。結論?金屬硫蛋白介導的金屬離子代謝紊亂與FTC密切相關，有望成為FTC的診治靶點。

[關鍵詞]?濾泡性甲狀腺癌；濾泡狀腺瘤；差異表達基因；生物信息學；金屬硫蛋白

[中圖分類號]?R736.1??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.010

Screening?and?bioinformatics?analysis?of?key?genes?for?follicular?thyroid?carcinoma?based?on?GEO?databases

CHEN?Baolin1，2，?LI?Jiayang3，?JIANG?Yan1，2，?LUO?Chengmin1，2，?BAO?Yuxiang1，2，?YAN?Zhongliang1，2，?CHENG?Xiaoming1，2，?LYU?Junyuan1，2

1.Department?of?General?Surgery，?the?Affiliated?Hospital?of?Zunyi?Medical?University，?Zunyi?563099，?Guizhou，?China;?2.Department?of?Thyroid?and?Breast?Surgery，?the?Affiliated?Hospital?of?Zunyi?Medical?University，?Zunyi?563099，?Guizhou，?China;?3.Office?of?Drug?Clinical?Trial?Institution，?the?Affiliated?Hospital?of?Zunyi?Medical?University，?Zunyi?563099，?Guizhou，?China

[Abstract]?Objective?Follicular?thyroid?carcinoma?（FTC）?is?rare，?and?hematogenous?metastasis?occurs?more?commonly?in?the?early?phase.?In?the?present?study，?a?bioinformatics?approach?was?used?to?identify?key?genes?and?investigate?the?pathogenesis?and?therapeutic?targets?of?FTC.?Methods?The?gene?microarray?data?GSE82208?was?downloaded?from?the?gene?expression?omnibus?（GEO）?database.?We?used?R?software?to?screen?the?differentially?expressed?genes?（DEGs）?from?the?gene?microarray?datas.?The?database?for?annotation，?visualization?and?integrated?discovery?（DAVID）?online?database?was?used?to?perform?the?gene?ontology?（GO）?function?analysis，?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）.?The?protein-protein?interaction?（PPI）?network?of?DEGs?was?analyzed，?screen?the?hub?genes，?and?patient?survival?analysis?were?performed.?Results?A?total?of?74?DEGs?were?screened?out?from?gene?expression?profile，?of?which?61?were?up-regulated?and?13?were?down-regulated.?GO?is?enriched?in?cellular?response?to?zinc?ion，?cellular?response?to?cadmium，?nucleus?and?metal?ion?binding.?KEGG?signaling?pathway?involves?in?mineral?absorption?signaling?pathway.?A?total?of?7?metallothionein?genes?were?screened?out?through?the?PPI?network，?including?MT1E，?MT1F，?MT1G，?MT1H，?MT1M，?MT1X?and?MT2A.?Finally，?we?found?MT1F?and?MT1M?had?a?significant?impact?on?the?survival?rate?of?thyroid?carcinoma?patients?（P<0.05）.?Conclusion?The?disorder?of?metal?ion?metabolism?mediated?by?metallothionein?is?closely?related?to?FTC，?and?is?expected?to?become?a?diagnostic?and?therapeutic?target?for?FTC.

[Key?words]?Follicular?thyroid?carcinoma;?Follicular?adenoma;?Differentially?expressed?genes;?Bioinformatics;?Metallothioneins

近年來，甲狀腺癌發(fā)病率居高不下，在過去30年間呈現急劇增長[1]。據統(tǒng)計，2023年全世界將新增甲狀腺癌病例43?720例[2]。濾泡性甲狀腺癌（follicular?thyroid?carcinoma，FTC）是一種少見的分化型甲狀腺癌，具有明顯血管侵犯性，在疾病早期即可通過血行轉移至肺、肝、骨及中樞神經系統(tǒng)，使患者預后不良[3-4]。由于FTC較少見，目前缺乏大宗病例研究，對其致病機制及治療靶點知之甚少。因此，本研究利用生物信息學方法分析FTC的關鍵基因，探索其致病機制，并尋找潛在治療靶點。

1??資料與方法

1.1??一般資料

登錄基因表達綜合數據庫（gene?expression?omnibus，GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），以“follicular?thyroid?carcinoma”為關鍵詞檢索，選擇“homo?sapiens”“tissue”“expession?profiling?by?array”，下載符合條件的基因數據矩陣文件GSE82208，該芯片文件來自GPL570平臺[（HG-U133_Plus_2）Affymetrix?Human?Genome?U133?Plus?2.0?Array]，數據集包含FTC樣本27例，濾泡狀腺瘤樣本25例，樣本信息見表1。

1.2??數據處理和DEGs篩選

下載基因矩陣數據后，利用perl?5.32.1和R?4.0.5軟件及l(fā)imma、ggplot、clusterProfiler等R包處理。通過背景校正、標準化及表達值計算進行差異表達基因（differentially?expressed?genes，DEGs）篩選，定義滿足條件|log2（FC）|>1和校正后P<0.05為有效的DEGs，即在有統(tǒng)計學意義的條件下DEGs表達水平是對照組的2倍。并將篩選參數log2（FC）>1的DEGs定義為上調基因，log2（FC）<–1的DEGs定義為下調基因，分別得到數據集中具有差異表達的上調基因和下調基因。

1.3??GO功能注釋與KEGG通路富集分析

數據庫注釋、可視化和綜合發(fā)現（database?for?annotation，visualization?and?integrated?discovery，DAVID）（https：//david.ncifcrf.gov/）是一種流行的生物信息學資源系統(tǒng)，主要用于基因列表的功能注釋和富集分析[5]。為了解DEGs的生物學功能及參與的信號通路，將DEGs上傳至DAVID網站，進行基因本體論（gene?ontology，GO）注釋分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路富集分析，研究分析生物過程（biological?process，BP）、分子功能（molecular?function，MF）、細胞組成（cellular?component，CC）和參與的信號通路富集情況，設置條件為P<0.05。

1.4??PPI分析與核心基因篩選

String（https：//www.string-db.org）是相互作用信息最大的蛋白質相互作用在線數據庫，可提供大量已知或未知蛋白質之間直接或間接作用關系數據[6]。將所得到的DEGs上傳至String并預測DEGs的蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網絡作用，物種來源選擇“homo?sapiens”。將得到的String結果上傳至Cytoscape?3.7.2軟件中，利用MCODE插件提取關鍵子網，根據節(jié)點得分從大到小的順序提取出表達較為聚集的子集，將其定義為核心基因。

1.5??生存預后分析

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）是一個基于TCGA、CPTAC、CBTTC等多平臺的開放數據庫，可進行全面的基因分析，如表達譜分析、臨床特征分析、生存分析、泛癌分析等[7]。鑒于目前缺乏FTC基因表達數據庫，筆者利用UALCAN中的“TCGA分析”功能，分析核心基因對甲狀腺癌患者生存預后的影響曲線，觀察基因高表達與低表達樣本之間的預后差異性。

2??結果

2.1??DEGs的篩選結果

在數據校正及標準化后（圖1），通過對比分析FTC組和濾泡狀腺瘤組表達差異的基因，GSE82208共篩選出74個DEGs，其中表達上調基因61個：LIMK2、ZFYVE21、SLC5A3、MAFB、ITIH5、CBX7、MT1M、C2orf42、SLC43A3、SGK223、GJA1、RSPH1、MIOX、GLUL、LMOD1、IER2、FOS、SCN4B、FCGBP、AFAP1L2、LTF、ID1、MT1G、DUSP1、CSGALNACT1、LOC101929122、SLCO2A1、CRABP1、TIMP3、MT1F、LOC101928303、SELENBP1、SMCO4、TPST2、MT1E、CA4、LRP1B、MT1X、SSPN、GLT8D2、MT1H、RAMP3、RP11-389C8.2、PLAT、DNALI1、CTB-50L17.7、SDF2L1、PRICKLE2、CYYR1、CRELD2、TSHZ3、MT2A、CPQ、CLIC3、GNA14、EMCN、AOC3、MT1HL1、FNDC1、PHYHD1、ID3。表達下調基因13個：ELOVL4、HIST3H2A、CENPK、TOP2A、UBE2C、C2orf88、MKX、MANEAL、SLC7A5、CIART、MST4、EPHX4、UBE2T。筆者通過R語言顯示出數據集的差異基因火山圖（圖2A），并繪制DEGs熱圖，體現出差異基因的聚集程度（圖2B）。

2.2??GO功能注釋與KEGG通路富集分析

將74個DEGs通過DAVID進行GO功能注釋分析和KEGG通路富集分析。GO功能分析顯示，生物過程主要集中在細胞對鋅離子反應、細胞對銅離子反應、負性調控增長和細胞對鎘離子反應等；細胞組成分布在細胞核和高爾基體；分子功能有鋅離子結合和金屬離子結合，見表2。DEGs的KEGG通路富集分析顯示涉及礦物質吸收，見表3。

2.3??PPI分析與核心基因篩選

通過String對74個DEGs進行PPI分析，見圖3A。將得到的String文件上傳至Cytoscape3.7.2軟件，利用MCODE插件按節(jié)點得分從大到小的順序分析得到兩簇交點最多的基因簇，分值為6分，具有7個節(jié)點和18條線，將其定義為核心基因，共獲得7個核心基因，且全部為上調基因，包括MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M、MT1X和MT2A，均屬于金屬硫蛋白（metallothioneins，MTs）基因家族，見圖3B。

2.4??核心基因生存預后

使用UALCAN對MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M、MT1X和MT2A進行生存分析發(fā)現，MT1F和MT1M與甲狀腺癌患者生存預后相關（P<0.05），見圖4，高表達組較低/中表達組預后差，生存時間更短。

3??討論

甲狀腺癌發(fā)病率在全世界已引起廣泛的關注，FTC作為少見的分化型甲狀腺癌，在早期經常侵犯血管或包膜，患者預后較差[8]。因此，早期準確診斷FTC尤為重要。隨著生物信息學的發(fā)展，微陣列技術已廣泛應用于各種癌癥的診斷與治療研究，其中包括甲狀腺癌[9]。因此，應用生物信息學技術探索FTC的有效診斷標志物成為可能。

本研究通過GEO下載的基因數據集，以濾泡狀腺瘤為對照組，對數據集進行整合分析，篩選得到74個DEGs，包括表達上調基因61個，表達下調基因13個。GO功能注釋和KEGG富集分析顯示，DEGs主要富集于細胞對鋅離子反應、細胞對銅離子反應、細胞對鎘離子反應、細胞核及金屬離子結合。這些結果表明FTC的惡性發(fā)展機制可能與細胞對某些金屬離子結合吸收存在根本的聯(lián)系或相關性。已有研究報道，當DNA結合區(qū)域中鋅離子缺失或結合力改變時，突變的TP53蛋白將形成無法降解的超穩(wěn)定的微觀或宏觀聚集體在腫瘤細胞中積累，促進癌細胞的侵襲和轉移，甚至形成耐藥[10]。鎘離子在人體中過度積累易導致肝腎功能障礙、骨軟化及造血系統(tǒng)損害[11]。礦物質是人體七大營養(yǎng)素之一，對維持生命至關重要。研究發(fā)現，礦物質的缺乏和不足可能與癌癥有關或增加患癌風險，如維生素D的有效補充和吸收可預防結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等[12-13]。

本研究通過構建差異表達基因PPI網絡，利用MCODE插件計算出7個核心基因，分別為MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M、MT1X、MT2A，均為上調基因并同屬于MTs亞型。MTs是一種低分子量的富含半胱氨酸的胞質蛋白，大量研究表明MTs的表達與癌癥進展及預后有關[14-15]。研究證實MTs在癌組織中的表達與Ki-67呈正相關，包括基底細胞癌、脂肪肉瘤及滑膜肉瘤等，提示MTs與腫瘤細胞增殖相關[16-17]。此外，MTs的過表達可促進胸膜間皮瘤、大腸癌、卵巢癌等多種腫瘤對鉑類藥物的耐藥性[18-20]。Weinlich等[21]通過對1270例黑色素瘤患者隨訪分析，發(fā)現MTs的過表達嚴重降低患者的生存率。而對甲狀腺癌，MTs可能扮演雙重角色。一方面Królicka等[22]與Schmid等[23]研究均證實MTs在FTC中高表達，盡管目前仍缺乏相關研究明確MTs表達上調對FTC的作用機制，但結合本研究生存分析發(fā)現，MT1F、MT1M與甲狀腺癌預后呈負相關，提示MTs可能是促進FTC發(fā)生發(fā)展的關鍵因子；另一方面，研究表明MTs在甲狀腺癌中高表達而在甲狀腺良性病變中低表達，因此MTs還可作為鑒別甲狀腺癌良惡性病變的標志物[24]。

綜上所述，本研究利用生物信息學方法對公共數據進行分析，闡明FTC發(fā)生發(fā)展的重要生物學過程與信號通路，最終發(fā)現以MT1F、MT1M為代表的MTs家族可能是FTC發(fā)生發(fā)展的關鍵基因，為FTC發(fā)生機制的研究及分子靶向治療提供新的視角。但本研究也有不足之處，由于FTC發(fā)病率低，目前缺乏可提供研究基因表達與FTC預后的數據庫，未能進行MTs與FTC的生存分析，有望后續(xù)結合臨床數據探討MTs對FTC患者生存預后的影響。

[參考文獻][1] SEIB?C?D，?SOSA?J?A.?Evolving?understanding?of?the?epidemiology?of?thyroid?cancer[J].?Endocrinol?Metab?Clin?North?Am，?2019，?48（1）：?23–35.

[10] GARUFI?A，?FEDERICI?G，?GILARDINI?MONTANI?M?S，?et?al.?Interplay?between?endoplasmic?reticulum?（ER）?stress?and?autophagy?induces?mutant?p53H273?degradation[J].?Biomolecules，?2020，?10（3）：?392.

[18] BORCHERT?S，?SUCKRAU?P?M，?WALTER?R?F?H，?et?al.?Impact?of?metallothionein-knockdown?on?cisplatin?resistance?in?malignant?pleural?mesothelioma[J].?Sci?Rep，?2020，?10（1）：?18677.