重金屬和Bt蛋白聯(lián)合暴露對(duì)細(xì)菌毒性的影響

高帆帆，王莉，2，楊思培，高榕，2，吳志斌，2，方俊，2，梁運(yùn)姍，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，洞庭湖區(qū)農(nóng)村生態(tài)系統(tǒng)健康湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省豬場(chǎng)廢棄物無害化處理與資源化利用工程研究中心，長(zhǎng)沙 410128）

重金屬污染一直受到國(guó)際、國(guó)內(nèi)社會(huì)的高度關(guān)注。重金屬沿著食物鏈，通過生物積累對(duì)生物體造成嚴(yán)重的健康威脅[1]。我國(guó)南方地區(qū)有色金屬開采和冶煉活動(dòng)的快速擴(kuò)張導(dǎo)致鎘、銅及其他金屬污染嚴(yán)重，其中稻田鎘污染導(dǎo)致稻米中鎘含量超過食品安全標(biāo)準(zhǔn)限值[2]。不同重金屬種類、有效性、存在形態(tài)及含量對(duì)生物體產(chǎn)生的毒害效果不同[3-5]。大多數(shù)金屬陽離子會(huì)與蛋白質(zhì)有效絡(luò)合，從而形成不同的金屬離子-有機(jī)絡(luò)合物[6]，而目前有關(guān)金屬和其他物質(zhì)聯(lián)合暴露對(duì)生物體的毒性研究較為匱乏。因此探究重金屬與其他物質(zhì)聯(lián)合暴露對(duì)生物體的毒性，可以更好地了解重金屬對(duì)生物體的毒性行為。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌，其分泌的結(jié)晶蛋白（如Cry1Ab 和Cry1Ac）可通過復(fù)雜的毒性機(jī)制控制鱗翅目昆蟲[7]。Bt 轉(zhuǎn)基因作物被大規(guī)模商業(yè)化推廣種植，從而導(dǎo)致大量Bt毒素蛋白通過植物根系分泌、秸稈還田和花粉飄落的方式進(jìn)入土壤和水生生態(tài)系統(tǒng)[8-10]，Bt蛋白進(jìn)入土壤初期會(huì)對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生影響[11]。研究表明Bt毒素進(jìn)入土壤環(huán)境后會(huì)與其他污染物，如殺蟲劑、抗生素、重金屬等相互結(jié)合[12-13]。Bt蛋白因富含酸性氨基酸結(jié)構(gòu)而具有較強(qiáng)的金屬絡(luò)合能力，其傾向與過渡金屬離子形成復(fù)合物[14]，目前關(guān)于Bt抗蟲蛋白和重金屬聯(lián)合暴露對(duì)微生物的毒理作用研究較少。因此，評(píng)估兩者聯(lián)合暴露對(duì)微生物活性的影響具有重要意義[15]。

本研究以Cry1Ac 蛋白作為Bt 蛋白代表，以Zn2+、Cd2+作為重金屬代表，以大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為受試模式生物，分析Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)兩種細(xì)菌的毒性作用，以期為重金屬與Bt 毒素聯(lián)合暴露對(duì)微生物的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行有效評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基配制

1.1.1 菌種來源

大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Ba?cillus subtilis）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；發(fā)光細(xì)菌為費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri），購自浙江清華長(zhǎng)三角研究院。

1.1.2 LB培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超純水1 L、121 ℃滅菌25 min。

固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超純水1 L、加入1.5%瓊脂、121 ℃滅菌25 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

將1 mL 不同濃度的Zn2+、Cd2+、Cry1Ac 蛋白單一及復(fù)合體系分別與1 mL 菌懸液和8 mL 液體培養(yǎng)基混合，最終Zn2+濃度為2、4、8、12、16、20 μg?mL-1，Cd2+濃度為2、4、6、8、10 μg?mL-1，Cry1Ac 蛋白濃度為0.2、0.8、1、2、4 μg?mL-1，復(fù)合體系的濃度配比為1∶1，濃度為0.2、1、2、4 μg?mL-1，培養(yǎng)24 h。不添加Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白的對(duì)照組加入1 mL蒸餾水。

B2C企業(yè)技術(shù)能力包括核心技術(shù)水平和技術(shù)創(chuàng)新能力兩個(gè)方面。核心技術(shù)水平主要由信息技術(shù)水平和物流技術(shù)水平等構(gòu)成。信息技術(shù)水平指B2C企業(yè)的網(wǎng)站系統(tǒng)建設(shè)、信息化水平的建設(shè)等；物流技術(shù)能力是指物流軟技術(shù)，包括系統(tǒng)工程技術(shù)、價(jià)值工程技術(shù)、配送技術(shù)等。技術(shù)創(chuàng)新能力是引領(lǐng)市場(chǎng)需求、減少成本、增大企業(yè)市場(chǎng)規(guī)模的物質(zhì)基礎(chǔ)，B2C企業(yè)的信息技術(shù)和物流技術(shù)的學(xué)習(xí)創(chuàng)新在優(yōu)化企業(yè)產(chǎn)品/服務(wù)組合、降低企業(yè)成本、提升企業(yè)主營(yíng)業(yè)務(wù)的異質(zhì)性、獨(dú)特性方面發(fā)揮重要作用。

1.2.2 平板計(jì)數(shù)

在固體LB 培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的Zn2+、Cd2+及Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac 復(fù)合體系（Zn2+：4、8、12、16、20 μg?mL-1；Cd2+：2、4、6、8、10 μg?mL-1；復(fù)合體系：2、4 μg?mL-1）溶液，將對(duì)數(shù)期的E.coli和B.subti?lis 菌液稀釋6 倍，分別取100 μL 均勻涂布于各平板上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。以不添加Zn2+、Cd2+和Cry1Ac 蛋白培養(yǎng)的細(xì)菌菌落數(shù)作為對(duì)照活菌數(shù)（CK），用平板計(jì)數(shù)器對(duì)活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄各平板上的菌落數(shù)，選取菌落數(shù)在30~300 個(gè)之間的平板用于計(jì)算，求出同一處理組平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。由公式（1）計(jì)算存活率：1.2.3 細(xì)菌活性氧測(cè)定

按照1.2.2的步驟收集處理后的E.coli和B.subtilis菌液至50 mL離心管，6 000 r?min-1離心10 min；用pH為7.02 的PBS 緩沖液洗滌，6 000 r?min-1離心5 min，渦旋去除殘留；取10 μL 的活性氧（ROS）熒光探針（濃度為10 mol ?L-1的DCFH-DA）工作液染色30 min，避光37 ℃孵育30 min，每隔10 min 輕輕搖動(dòng)；孵育結(jié)束用磷酸鹽緩沖液充分洗滌；用酶標(biāo)儀在發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度。

1.2.4 急性毒性實(shí)驗(yàn)

在超凈無菌工作臺(tái)內(nèi)將-20 ℃保存的Vibrio fisch?eri 凍干粉西林瓶打開，取復(fù)蘇液1 mL 于室溫下平衡復(fù)蘇10 min，振蕩搖勻。吸取發(fā)光菌液1 mL，用2%NaCl 稀釋至40 mL。將不同濃度樣品（Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白和復(fù)合體系）溶液放在96孔板中，不同物質(zhì)每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)平行，第一行設(shè)置為陰性質(zhì)控（2%NaCl），為初始發(fā)光強(qiáng)度，第二行為陽性質(zhì)控（10 mg?L-1的ZnSO4溶液），為樣品發(fā)光強(qiáng)度。各孔中加入樣品液180 μL 和發(fā)光菌液20 μL，總體積200 μL，15 min 后放入檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。根據(jù)Vibrio fischeri的熒光強(qiáng)度計(jì)算抑制率（RI，%），計(jì)算公式如下：

式中：C0為陰性質(zhì)控初始發(fā)光強(qiáng)度；St為t時(shí)樣品的發(fā)光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，采用SPSS 22 進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)差異的顯著性，采用Origin 9繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度Zn2+、Cd2+對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

重金屬對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生抑制作用，濃度愈高抑制作用愈強(qiáng)[16]。Zn2+、Cd2+濃度增加對(duì)B.subtilis 和E.coli 的抑制增強(qiáng)（圖1），E.coli 細(xì)胞壁具有帶負(fù)電荷的脂多糖，其可與更多的金屬陽離子結(jié)合[17-18]，B.subtilis耐性強(qiáng)于E.coli。不同金屬對(duì)生物體的毒性不同，Cd2+對(duì)B.subtilis 和E.coli生長(zhǎng)的抑制作用大于Zn2+。Cd 是強(qiáng)毒性元素，低濃度就有很強(qiáng)的毒性；Zn 是生物體必需元素，低濃度Zn 可保護(hù)細(xì)胞免受傷害[19]。Zn2+和Cd2+的加入均對(duì)兩種細(xì)菌產(chǎn)生了不同程度的毒害，如圖1 所示，Cd2+對(duì)兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制效果強(qiáng)于Zn2+。不同濃度的Zn2+和Cd2+脅迫培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)0~24 h 時(shí)，OD 值均低于對(duì)照組。隨著金屬濃度的增加，0~11 h 為B.subtilis 的生長(zhǎng)期，此時(shí)生長(zhǎng)曲線呈快速生長(zhǎng)趨勢(shì)，吸光值增大，12~15 h 處于穩(wěn)定期，15 h 以后OD 值減弱，此時(shí)為衰亡期。Zn2+和Cd2+濃度分別在20 μg?mL-1和8 μg?mL-1時(shí)完全抑制E.coli生長(zhǎng)。

圖1 不同濃度Zn2+、Cd2+對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響Figure 1 Effects of different concentrations of metal ions on bacterial growth curve

2.2 Cry1Ac 蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖2 為Cry1Ac 蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露條件下的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。在0~16 h，各處理組細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的OD600值均低于對(duì)照組。在0~10 h 內(nèi)細(xì)菌處于生長(zhǎng)期，Cry1Ac 蛋白和Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac 聯(lián)合暴露對(duì)B.subtilis 和E.coli 生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，且隨濃度增加細(xì)菌生長(zhǎng)受到的抑制作用增強(qiáng)，且E.coli 比B.subtilis 更為敏感。Cd2+單獨(dú)及復(fù)合體系對(duì)兩種細(xì)菌的毒性明顯強(qiáng)于Zn2+單獨(dú)及其復(fù)合體系，Zn在短期內(nèi)的毒性可能與生物體內(nèi)貯存濃度有關(guān)，當(dāng)Zn 在生物體內(nèi)積累到一定濃度就會(huì)啟動(dòng)金屬硫蛋白，促使其與金屬硫蛋白結(jié)合而降低毒性[20]。同時(shí)Zn2+和Cd2+都會(huì)與Cry1Ac 蛋白結(jié)合，從而減輕重金屬對(duì)細(xì)菌的毒害[21]。

2.3 Cry1Ac 蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露下菌落平板生長(zhǎng)狀況觀察

采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)Zn2+、Cd2+及Cry1Ac 蛋白聯(lián)合暴露時(shí)對(duì)E.coli和B.subtilis存活的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著重金屬濃度的增加，細(xì)菌的存活率顯著降低（P<0.05）。重金屬會(huì)抑制細(xì)菌酶活性及其生長(zhǎng)，高濃度重金屬甚至?xí)?dǎo)致細(xì)菌死亡[22]。Cd2+濃度為10 μg?mL-1時(shí)E.coli和B.subtilis的存活率均為0，表明Cd2+濃度為10 μg?mL-1時(shí)對(duì)兩種細(xì)菌的抑制率達(dá)到最大。當(dāng)Zn2+濃度為16 μg?mL-1時(shí)，E.coli 的存活率為0，Zn2+濃度為20 μg?mL-1時(shí)，B.subtilis 的存活率為0，表明Zn2+濃度為16、20 μg?mL-1時(shí)分別對(duì)兩種細(xì)菌抑制率達(dá)到最大。當(dāng)Zn2+-Cry1Ac 的濃度為4 μg?mL-1時(shí)，對(duì)E.coli 和B.subtilis 的存活率分別為74.7%和76.8%，當(dāng)Cd2+-Cry1Ac濃度為4 μg?mL-1時(shí)，E.coli和B.subtilis的存活率分別為66.1%和71.2%，即Cd2+-Cry1Ac對(duì)兩種細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制效果強(qiáng)于Zn2+-Cry1Ac。

圖3 不同濃度Zn2+、Cd2+及其與Cry1Ac蛋白聯(lián)合處理的細(xì)菌存活菌落電鏡圖Figure 3 Electron microscopic images of different concentrations of Zn2+，Cd2+and their combined with Cry1Ac protein against bacteria

2.4 細(xì)菌ROS活性檢測(cè)

過量ROS 會(huì)造成細(xì)菌氧化損傷，甚至使細(xì)菌活性受到影響[23]。重金屬氧化損傷所產(chǎn)生的ROS 可攻擊膜脂，導(dǎo)致膜功能障礙，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)、DNA 和細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng)造成損害。圖4 為暴露于Zn2+和Cd2+后細(xì)菌體內(nèi)的ROS 產(chǎn)生量變化。單一金屬對(duì)細(xì)菌毒性影響的結(jié)果表明：Zn2+濃度從2 μg?mL-1增加到20 μg?mL-1，E.coli 和B.subtilisti 產(chǎn)生的ROS 變化顯著（P<0.05）。Zn在酶催化反應(yīng)、細(xì)胞代謝、信號(hào)傳遞等生理調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，有助于抑制自由基和ROS的產(chǎn)生，從而可增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和抗氧化酶的活性[24]。然而過量的Zn 會(huì)起到毒性作用，Zn 會(huì)與其他金屬發(fā)生錯(cuò)金屬化阻斷蛋白質(zhì)硫醇表達(dá)，從而引發(fā)基本生物功能的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性[25]。Cd2+濃度從2 μg?mL-1增加到10 μg?mL-1，E.coli 和B.subtilisti 產(chǎn)生的ROS 變化顯著（P<0.05），雖然Cd2+濃度低，但其毒性很高[20]。Cd2+濃度的增加會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生過量的ROS，造成DNA 損傷，最后使生物體發(fā)生細(xì)胞凋亡[26]。此外，細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生量的增加可能與金屬引起的抗氧化劑消耗（如谷胱甘肽）有關(guān)[27]。直接影響重金屬對(duì)生物體毒性效應(yīng)的不是吸附金屬離子的數(shù)量，而是能夠與酶、蛋白質(zhì)、DNA 以及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能基團(tuán)反應(yīng)的離子或分子的數(shù)量[28-30]。

圖4 Zn2+和Cd2+對(duì)兩種細(xì)菌ROS產(chǎn)生量的影響Figure 4 Effects of Zn2+and Cd2+on ROS production of two kinds of bacteria

細(xì)菌處于Zn2+、Cd2+和Cry1Ac 蛋白聯(lián)合暴露的條件下時(shí)，隨著濃度增加兩種菌體ROS 的產(chǎn)生量整體呈現(xiàn)先上升后降低趨勢(shì)（圖5），各處理組細(xì)菌ROS 產(chǎn)生量都低于對(duì)照組（除了濃度為2 μg?mL-1的Zn2+-Cry1Ac復(fù)合體對(duì)E.coli的ROS產(chǎn)生量為103.1%）。如圖5 所示，聯(lián)合暴露下E.coli 和B.subtilis 的ROS 產(chǎn)生量呈顯著性變化（P<0.05），這與單獨(dú)金屬離子暴露下細(xì)菌ROS 產(chǎn)生量呈現(xiàn)的趨勢(shì)不同，是與金屬離子與色氨酸的吲哚基團(tuán)之間的N 配位有關(guān)。在Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac體系中，Zn2+和Cd2+對(duì)吲哚基團(tuán)（色氨酸）中的N具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，導(dǎo)致其對(duì)細(xì)菌的氧化損傷降低，從而進(jìn)一步降低金屬毒性[31]。Zn2+-Cry1Ac 處理比Cd2+-Cry1Ac 處理下E.coli 體內(nèi)ROS 產(chǎn)生量多：一方面，Cd2+會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌防御機(jī)制響應(yīng)誘導(dǎo)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和金屬硫蛋白（MT）等幾種保護(hù)酶的升高，這些酶能夠拮抗Cd 的毒性，更多的抗氧化酶能夠清除生物體中Cd脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子和過氧化氫等[7]。另一方面，用純Cd2+溶液（如CdCl2）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其對(duì)細(xì)菌的毒性大于Zn2+溶液。Cd2+-Cry1Ac 較Zn2+-Cry1A對(duì)細(xì)菌的毒性低，這是因?yàn)镃d2+與其他物質(zhì)（例如各種離子或有機(jī)成分）之間的相互作用通常會(huì)改變Cd2+的毒性，此時(shí)Zn2+-Cry1A 聯(lián)合暴露對(duì)細(xì)菌毒性更強(qiáng)[20]。

圖5 Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白聯(lián)合暴露對(duì)兩種細(xì)菌ROS產(chǎn)生量的影響Figure 5 Effects of combined exposure of Zn2+，Cd2+and Cry1Ac protein binary systems on ROS production of the two bacteria

2.5 發(fā)光細(xì)菌急性毒性檢驗(yàn)

發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制率反映重金屬對(duì)細(xì)菌的毒性效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)Zn 濃度大于1.2 mg?L-1時(shí)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度有明顯抑制作用，Cd 和Pb 濃度改變對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響不顯著[32]。如圖6 所示，不同濃度Zn2+、Cd2+均對(duì)Vibrio fischeri 產(chǎn)生抑制，且抑制率隨金屬濃度增加而變大（P<0.05）。Zn2+濃度從2 μg?mL-1增加到20 μg?mL-1，Zn2+對(duì)Vibrio fischeri的發(fā)光抑制率由41%增加到85%；Cd2+濃度從2 μg?mL-1增加到10 μg?mL-1，Cd2+對(duì)Vibrio fischeri 的發(fā)光抑制率由39%增加到61%；即不同濃度金屬離子的毒性效果不同，濃度愈高，毒性愈強(qiáng)。相同濃度下Zn2+對(duì)Vibrio fischeri的抑制率大于Cd2+，即Zn2+對(duì)Vibrio fischeri的毒性較大。青?；【鶴67 和費(fèi)氏弧菌的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明Zn2+的毒性大于Cd2+，可能是Zn2+與硫的親和力強(qiáng)于Cd2+，導(dǎo)致其對(duì)發(fā)光細(xì)菌毒性較大[33]。

圖6 不同濃度Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白及復(fù)合體系對(duì)費(fèi)氏弧菌生長(zhǎng)抑制率的影響曲線Figure 6 Influence curves of different concentrations of Zn2+，Cd2+，Cry1Ac proteins and their complex systems on growth inhibition rate of Vibrio fischeri

從圖6（c）中可以看出，各處理對(duì)細(xì)菌作用15 min后，隨著Cry1Ac 蛋白濃度升高，Vibrio fischeri 的發(fā)光抑制率由負(fù)到正，這是由于Cry1Ac 蛋白本身含有具有內(nèi)源熒光特性的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），其中最主要的是色氨酸[34-35]。具有熒光特性的Cry1Ac 蛋白與Vibrio fischeri 結(jié)合導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，因此抑制率為負(fù)，隨著Cry1Ac 蛋白濃度的增加，抑制率逐漸增大，但不會(huì)對(duì)細(xì)菌造成毒性影響。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因Bt 稻草（Cry1Ab 蛋白）在淹水條件下分解的Cry1Ab 蛋白對(duì)細(xì)菌不會(huì)造成毒害作用，即Bt蛋白不會(huì)對(duì)土壤微生物構(gòu)成危害[15，36]。

Zn2+、Cd2+與Cry1Ac 聯(lián)合暴露下Vibrio fischeri 的生長(zhǎng)抑制率也由負(fù)到正，這是由于發(fā)出熒光的Cry1Ac 蛋白和Zn2+、Cd2+結(jié)合使自身熒光強(qiáng)度有所減弱。研究表明，具有熒光特性的Cry1Ac 蛋白與不發(fā)光的金屬離子相互作用，降低了Vibrio fischeri 產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度[37]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。仇愛鋒等[38]的研究表明隨著Cd2+和Cu2+對(duì)費(fèi)氏弧菌暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，毒性增大。本研究中，隨著濃度的升高各處理對(duì)Vibrio fischeri 的抑制效果增強(qiáng)，相同濃度下各處理對(duì)Vibrio fischeri 的抑制效果 表 現(xiàn) 為 Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。

3 結(jié)論

（1）高濃度的Zn2+、Cd2+會(huì)對(duì)E.coli、B.subtilis 生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，細(xì)菌存活率也顯著降低（P<0.05），兩種細(xì)菌相比B.subtilis的耐受性強(qiáng)于E.coli。

（2）Cry1Ac 蛋白不會(huì)對(duì)細(xì)菌造成毒性損傷；二元體系聯(lián)合暴露時(shí)Zn2+、Cd2+均與Cry1Ac 蛋白（吲哚基團(tuán)）結(jié)合，使得Zn2+、Cd2+對(duì)兩種細(xì)菌的毒性降低。

（3）兩種細(xì)菌活性氧產(chǎn)生量表明Zn2+和Cd2+對(duì)E.coli 和B.subtilis 造 成 了 嚴(yán) 重 損 傷，Zn2+-Cry1Ac 和Cd2+-Cry1Ac 聯(lián)合暴露對(duì)E.coli 和B.subtilis 沒有造成嚴(yán)重?fù)p傷。

（4）Zn2+、Cd2+及Cry1Ac 蛋白濃度增加對(duì)Vibrio fischeri的發(fā)光強(qiáng)度抑制增強(qiáng)，相同濃度下各處理體系的發(fā)光抑制效果為Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。