UHPLC-MS/MS和GC-MS/MS測定甜菜中523種農(nóng)藥及代謝物的殘留量

原海越，史小萌，李備，王雯雯，劉瀟威，賀澤英*

（1.海南省食品檢驗檢測中心，國家市場監(jiān)管重點實驗室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），?？?570311；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；3.安捷倫科技有限公司，北京 100102）

甜菜（Beta vulgaris L.）作為重要的糖料作物，在我國北方種植已有100 多年的歷史[1]。甜菜中具有甜菜堿和甜菜纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，同時也具有一定的藥用價值[2]。但為了防治甜菜生長過程中的病蟲草害，農(nóng)藥的使用是必不可少的，但農(nóng)藥殘留量含量超標最終會影響消費者的健康[3]。許多國際組織和國家（如中國、美國和日本）的法規(guī)均規(guī)定了農(nóng)藥在植物源性等食品中的最大殘留限量（MRL）。我國最新制定的最大殘留限量標準GB 2763—2021 將甜菜中的大部分農(nóng)藥殘留水平設(shè)定為0.01~0.5 mg·kg-1。甜菜中的農(nóng)藥殘留檢測對于確保食品安全和遵循生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范都非常重要。

當前最常用農(nóng)藥多殘留檢測手段基于色譜串聯(lián)質(zhì)譜。如四極離子阱QqLIT[4]、靜電軌道阱Obritrap[5]和飛行時間TOF[6]，可用于復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留的高通量分析，其中最常用的質(zhì)譜檢測器為三重四極桿（QQQ），大量文獻表明使用色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜建立果蔬等農(nóng)產(chǎn)品中幾百種農(nóng)藥的殘留檢測方法是可行的。目前針對甜菜中的農(nóng)藥殘留分析檢測報道較少，僅知甜菜安（desmedipham）和甜菜寧（phenmedipham）在甜菜中有方法開發(fā)及相應(yīng)的殘留檢出[7]，因此本研究建立一種甜菜中農(nóng)藥多殘留檢測方法具有實際意義。

針對前處理的提取技術(shù)，QuEChERS 方法是目前前處理最常用的手段，其中經(jīng)常使用到的凈化材料有十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）和石墨化炭黑（GCB），其中PSA 可以凈化乙腈提取液中的糖類、酸性物質(zhì)等極性干擾物，但其在凈化基質(zhì)的同時可能對一些化學性質(zhì)的農(nóng)藥具有吸附作用[8]，造成回收率降低。文獻中鮮有PSA 對農(nóng)藥吸附的報道。因此，系統(tǒng)考察PSA吸附的影響是非常必要的。

基于以上所述，該文采用UHPLC-ESI-MS/MS 和GC-EI-MS/MS 聯(lián)合建立甜菜中523 種農(nóng)藥及代謝物的多殘留檢測方法，同時優(yōu)化前處理過程中PSA的使用量，考察兩種檢測儀的性能、回收率和定量限（LOQ）及線性和基質(zhì)效應(yīng)等，以期為甜菜中農(nóng)藥多殘留檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

液質(zhì)分析采用UHPLC 系統(tǒng)串聯(lián)三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜（QTRAP 5500+，SCIEX）。氣質(zhì)分析采用氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（GC-EI-MS/MS）（7000 D，Agilent，美國）。

甲醇、乙腈和乙酸乙酯（HPLC 級），購自飛世爾科學公司（Fair Lawn，美國）；甲酸（純度≥99%）和甲酸銨（純度≥99%）來自阿拉丁生化技術(shù)有限公司（上海）；水，通過Milli-Q系統(tǒng)（Millipore，美國）純化。

農(nóng)藥標準品，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所提供。用丙酮配制10 mg·L-1混合標準溶液，-20 ℃儲存，備用。

QuEChERS 提取鹽包（Bond Elut QuEChERS P-N 5982-5650：4 g 無水硫酸鎂，1 g 檸檬酸鈉二水合物，0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物，1 g氯化鈉）和分散固相萃取吸附劑PSA，購自安捷倫科技公司（美國）。

1.2 樣品前處理

選擇空白甜菜樣品進行預(yù)分析，以確保不存在目標分析農(nóng)藥，進行后續(xù)方法學考察。

實際樣品采用本實驗室之前研究中開發(fā)的QuEChERS 方法制備[9]。稱取10 g 試樣（精確至0.01 g）放入50 mL的聚丙烯離心管中。然后加入10 mL的乙腈、陶瓷質(zhì)子和上述QuEChERS提取鹽包。密封試管，手動用力振蕩1 min，之后4 200 r·min-1離心5 min。離心后，取6 mL 上清液到15 mL 聚丙烯離心管中，其中含有900 mg 無水MgSO4、150 mg PSA。渦旋混勻1 min，離心機4 200 r·min-1離心5 min。取上清液1 mL 過PTFE 微孔濾膜（0.22 μm）過濾后進行UH?PLC-MS/MS 分析。取2 mL 上清液于10 mL 的玻璃管中，40 ℃水浴中氮氣吹至近干，加入20 μL 的內(nèi)標1 mg·L-1環(huán)氧七氯B 溶液，再加入1 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，過PTFE微孔濾膜（0.22 μm）后進行GC-MS/MS分析。

1.3 色譜質(zhì)譜檢測條件

1.3.1 UHPLC-ESI-MS/MS

LC 檢測條件：使用C18 色譜柱（HSS T3 柱，2.1×100 mm，1.7 μm，Waters，美國）進行色譜分離；柱溫設(shè)置為40 ℃，流動相A 為水、流動相B 為甲醇，均含2 mmol·L-1甲酸銨和0.01%甲酸，流速為0.3 mL·min-1，洗脫梯度見表1，進樣量為2 μL。

表1 流動相及其梯度條件（VA+VB）Table 1 Mobile phase and gradient conditions（VA+VB）

質(zhì)譜檢測條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正離子和負離子同時掃描，檢測方法為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。電噴霧電壓（ISVF）5 500 V，離子源溫度350 ℃，霧化氣壓力（GS1）3.48×105Pa，加熱器氣壓力（GS2）3.48×105Pa，氣簾氣壓力2.07×105Pa。

1.3.2 GC-EI-MS/MS

氣相色譜條件：色譜柱為VF 1701ms 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。以氦氣為載氣，色譜柱的流速為1 mL·min-1。柱溫箱升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持1 min，在以40 ℃·min-1升溫到120 ℃，然后以5 ℃·min-1升溫到240 ℃，再以12 ℃·min-1升溫至300 ℃，保持10 min；在不分流模式下，進樣口溫度為280 ℃，進樣體積為1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊源（EI）；電力電壓為70 eV；監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；碰撞氣為氮氣1.5 mL·min-1；載氣為氦氣1 mL·min-1，離子源和傳輸線溫度設(shè)置為280 ℃。

1.4 方法學考察

根據(jù)歐盟指導(dǎo)標準[10]，在優(yōu)化條件下，根據(jù)正確度、精密度、定量限（LOQ）、線性和基質(zhì)效應(yīng)5 個方法學指標進行驗證。為確定該方法的準確度和精密度，在5 個濃度水平上進行回收率的研究。使用溶劑和甜菜空白基質(zhì)提取溶液分別配制523 種農(nóng)藥及代謝物的溶劑和基質(zhì)標準溶液（濃度分別為2、5、10、20、50、100、200 μg·kg-1）進行線性研究，并計算基質(zhì)效應(yīng)。方法的LOQ 定義為滿足回收率和RSD 要求的最低添加濃度。

1.5 實際甜菜樣品農(nóng)藥殘留檢測

購買市售甜菜樣品232 份，勻漿處理后，-20 ℃保存，備用待測。按照1.2 節(jié)前處理方法進行樣品前處理，采用1.3 節(jié)儀器條件進行523 種農(nóng)藥殘留的測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 PSA含量優(yōu)化

設(shè)置5 個不同水平的PSA 用量，分別為0、5、10、25、50 mg·mL-1，對提取出的空白甜菜基質(zhì)進行凈化處理。其凈化效果采用GC-MS/MS 的全掃描模式進行比較。由圖1 可見，隨著PSA 用量增加，基質(zhì)凈化效果逐漸提高。之后，將5 個不同水平的PSA 用量用于前處理加標提取，GC-EI-MS/MS和LC-ESI-MS/MS檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在供劑的523 種農(nóng)藥中，隨著PSA 使用量的增加，有40 種農(nóng)藥的回收率降低（表2）。其中，多半受影響的是磺酰脲類農(nóng)藥[11]，而且PSA 對異狄氏劑醛吸附非常嚴重，即使用量為5 mg·mL-1，高濃度添加下回收率仍僅有50%左右，無法滿足檢測需求。因此，對于異狄氏劑醛，不宜使用PSA進行凈化，受影響的39 種農(nóng)藥在PSA 用量為5 mg·mL-1時可以滿足回收率在60%~120%之間的要求，其余農(nóng)藥的PSA使用量仍為25 mg·mL-1。

圖1 GC-MS/MS全掃描下不同用量PSA對空白基質(zhì)的凈化效果Figure 1 Purification of different dosage of PSA on blank matrix by GC-MS/MS full scan model

表2 不同PSA含量下受PSA影響的農(nóng)藥及其回收率Table 2 Pesticides affected by PSA and their recoveries under different PSA dosage

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

液相和氣相色譜條件參數(shù)基于GB 23200.121—2021 和GB 23200.113—2018 兩項國家標準的要求，農(nóng)藥的MRM 條件除標準中已有的453 種外，對其余70 種進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。對于UHPLC-MS/MS，對每種農(nóng)藥進行質(zhì)譜端的針泵優(yōu)化，以優(yōu)化MRM 條件和相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)，主要包括去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）以及不同的加合方式，即[M+H]+或[M+NH4]+。其中24 種適用于UHPLC-ESI-MS/MS 檢測。對于這24 種農(nóng)藥，首先使用溶劑標準溶液優(yōu)化多個MRM 條件。然后在空白甜菜提取溶液配制的標準溶液中對這些MRM 進行對比，選取兩個響應(yīng)最佳的離子對作為定量和定性離子。對于GC-EI-MS/MS，有45 種農(nóng)藥適用于其檢測。首先全掃描確定前體離子碎片和保留時間。然后，用產(chǎn)物離子模式對每種農(nóng)藥進行分析，最終在多個MRM 條件中確定兩個最佳的MRM 條件和相應(yīng)的碰撞能量（CE）。表3 和表4 僅列出新增70種農(nóng)藥的詳細色譜和質(zhì)譜參數(shù)，其余453種農(nóng)藥及代謝物的詳細條件可參考上述兩項標準。

表3 UHPLC-MS/MS分析中農(nóng)藥的保留時間和MRM參數(shù)Table 3 Retention time and MRM parameters of pesticides in UHPLC-MS/MS analysis

2.3 儀器方法驗證與比較

2.3.1 儀器性能

經(jīng)過統(tǒng)計篩查，523 種農(nóng)藥，有399 種適合于UH?PLC-MS/MS 檢測，266 種適合于GC-MS/MS 檢測。其中有142種同時適用于兩種儀器檢測。

2.3.2 回收率和定量限LOQ

回收率在2、5、10、100 μg·kg-1和200 μg·kg-15個不同濃度水平考察，每個添加水平下設(shè)置重復(fù)組（n=5）來確定方法的準確度和精密度，添加回收樣品的真實濃度與空白基質(zhì)提取液配制已知農(nóng)藥濃度的標準溶液進行比較，計算回收率。每種農(nóng)藥的定量限LOQ根據(jù)添加回收試驗的回收率和相對標準偏差RSD 確定，根據(jù)SANTE 11312/2021 的要求，定量限為回收率和RSD均可接受的最低添加濃度。

UHPLC-MS/MS 和GC-MS/MS 的回收率和RSD在5 個不同添加濃度水平下，GC-MS/MS 檢測農(nóng)藥的回收率大部分在80%~100%之間，RSD絕大多數(shù)≤10%。除5 μg·kg-1濃度水平條件下UHPLC-MS/MS 檢測農(nóng)藥的回收率大部分在60%~80%之間，其他濃度水平下，農(nóng)藥的回收率也大部分在80%~100%之間。同樣，絕大多數(shù)RSD≤10%。兩種檢測儀器檢測的全部農(nóng)藥 回 收 率 為65.1%~116.4%，RSD≤24.1%，根據(jù)SANTE 文件要求絕大多數(shù)農(nóng)藥得到了令人滿意的回收率和RSD。UHPLC-MS/MS和GC-MS/MS的添加回收試驗結(jié)果顯示523 種農(nóng)藥及代謝物在甜菜中的定量限LOQ 絕大多數(shù)為2 μg·kg-1，8 種農(nóng)藥的定量限LOQ 為5 μg·kg-1。該方法523 種農(nóng)藥的定量限LOQ均低于GB 2763—2021 標準中規(guī)定的在甜菜中的最大殘留限量MRL 值。各項指標等均達到農(nóng)藥殘留測定分析的相關(guān)標準要求，表明試驗所建立的方法可滿足在甜菜中的同時殘留測定分析需求。

此外，142 種適用于兩種儀器檢測的農(nóng)藥的回收率和RSD 相比較的結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥的回收率大部分仍然在80%~100%之間。對于RSD，UHPLC-MS/MS的重現(xiàn)性要比GC-MS/MS略好?？傮w來說，相對于UHPLC-MS/MS，GC-MS/MS 對此142 種農(nóng)藥的檢測無明顯差異。

圖2 142種農(nóng)藥在甜菜中的回收率和RSD分布Figure 2 Recovery and RSD distribution of 142 pesticides in beet

2.3.3 線性和基質(zhì)效應(yīng)

以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)峰面積或與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，進行回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論采用GC-MS/MS還是UHPLC-MS/MS，所有農(nóng)藥在所設(shè)計的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均高于0.99，并且，UHPLC-MS/MS 和GC-MS/MS 結(jié)果顯示的部分相關(guān)系數(shù)高于0.999，線性關(guān)系也無明顯差異。

通過比較溶劑和甜菜基質(zhì)中農(nóng)藥標準曲線的斜率計算基質(zhì)效應(yīng)。當基質(zhì)效應(yīng)存在時，痕量化合物的定量分析可能會受到影響[12]。一般在GC-EIMS/MS 和LC-ESI-MS/MS 中分別報道基質(zhì)增強或抑制。51.80%、23.60%和24.60%的目標物在UHPLCMS/MS 分析中分別呈強基質(zhì)效應(yīng)（ME≤-50% 或ME≥50%）、中 等 基 質(zhì) 效 應(yīng)（-50%≤ME≤-20% 或20%≤ME≤50%）和弱基質(zhì)效應(yīng)（-20%≤ME≤20%）。22.20%、21.10%和56.70%的目標物在GC-MS/MS 分析中分別呈強基質(zhì)效應(yīng)（ME≤-50%或ME≥50%）、中等基質(zhì)效應(yīng)（-50%≤ME≤-20%或20%≤ME≤50%）和弱基質(zhì)效應(yīng)（-20%≤ME≤20%）。針對142 種適用于兩種儀器檢測的農(nóng)藥在UHPLC-MS/MS 分析中多呈強基質(zhì)效應(yīng)，而在GC-MS/MS 分析中多呈弱基質(zhì)效應(yīng)。由于在GC-MS/MS 和UHPLC-MS/MS 檢測結(jié)果中顯示出部分農(nóng)藥存在較強的基質(zhì)效應(yīng)，為最大程度消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，更大程度保證檢測的準確性，在實際樣品檢測中采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析。

2.4 實際樣品測定及分析

用這兩種色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法對232 份甜菜樣品進行了分析，以評價這兩種方法在甜菜農(nóng)藥殘留檢測方面的可靠性。在10 個不同樣本中共檢出5 種農(nóng)藥殘留，具體數(shù)據(jù)見表5。毒死蜱、馬拉硫磷、溴氰菊酯、氰戊菊酯在我國均有登記使用，且為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用品種，但除線磷并未在我國登記。在定量方面，3種同時適用于兩種儀器檢測農(nóng)藥（毒死蜱、溴氰菊酯、氰戊菊酯），其定量結(jié)果在兩種儀器上結(jié)果一致，表明兩種檢測技術(shù)可靠。

表5 實際樣品的農(nóng)藥檢測Table 5 Pesticide detection of real samples

甜菜樣品檢測結(jié)果顯示毒死蜱、馬拉硫磷、溴氰菊酯、氰戊菊酯低于GB 2763—2021 標準的MRL值，除線磷未在我國登記因此在GB 2763—2021 標準中未規(guī)定MRL 值。其中，毒死蜱檢出率為2.16%、除線磷檢出率為2.16%、馬拉硫磷檢出率為0.43%、溴氰菊酯檢出率為0.43%、氰戊菊酯檢出率為0.43%，232 份樣品中的農(nóng)藥殘留量未經(jīng)檢測超過我國制定的MRL 值。但根據(jù)歐盟限量標準有少量樣品中的毒死蜱（5 份）、溴氰菊酯（1 份）和氰戊菊酯（1 份）殘留量超標。

3 結(jié)論

（1）建立同時檢測甜菜中523 種農(nóng)藥及代謝物的QuEChERS 提取結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的多殘留分析方法。523 種農(nóng)藥及代謝物中有399種適合于UHPLC-MS/MS檢測、266種適合于GC-MS/MS 檢測、142 種同時適用于兩種儀器檢測。

（2）該方法線性關(guān)系良好，添加回收率及其相對標準偏差均在規(guī)定范圍內(nèi)，絕大多數(shù)農(nóng)藥的LOQ 為2 μg·kg-1、8 種農(nóng)藥的LOQ 為5 μg·kg-1，低于各農(nóng)藥在我國規(guī)定的MRL 值，方法性能滿足農(nóng)藥殘留在農(nóng)作物中的檢測分析要求，說明該方法適用于甜菜中的農(nóng)藥多殘留準確定性和定量分析及市場監(jiān)督抽查等，具有很好的實際應(yīng)用價值。

（3）實際樣品檢出未登記農(nóng)藥除線磷，其他農(nóng)藥殘留量均低于我國限量標準規(guī)定的MRL 值，但部分農(nóng)藥殘留量超過歐盟限量值。