山核桃寡核苷酸探針開發(fā)及其應用*

苑 軻 黃堅欽 王克濤 夏國華 張啟香 徐川梅

（浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300）

山核桃屬（Carya）是胡桃科（Juglandaceae）的一個重要的屬，是珍貴的經(jīng)濟林樹種，具有極高經(jīng)濟價值，特別是其中的山核桃（Carya cathayensis）和薄殼山核桃（C. illinoinensis），在浙江省干果產(chǎn)業(yè)中占重要的地位。山核桃屬包括約18 個種，分為北美山核桃種和東亞山核桃種兩大組，其中北美山核桃種約11 個種，包括薄殼山核桃、卵形山核桃（C. ovata）及佛羅里達山核桃（C. floridana）等，主要分布在北美；中國山核桃種約6 個種，包括山核桃、云南山核桃（C. tonkinensis）、湖南山核桃(C. hunanensis)、 大別山山核桃(C.dabieshanensis)、貴州山核桃（C. kweichowensis）及喙核桃（C. sinensis）等，分別分布于浙江、云南、湖南、安徽及貴州等省的偏遠山區(qū)（Zhanget al.，2013；劉茂春等，1984）。目前，山核桃屬植物相關的細胞遺傳學研究多為在染色體計數(shù)及傳統(tǒng)的核型分析等初級細胞遺傳學水平，大部分山核桃種的細胞遺傳學研究尚未開展（Chenet al.，1993；呂芳德等，2002；徐川梅，2017）。山核桃屬植物染色體數(shù)目較多，且染色體形態(tài)較小，一些染色體極易斷裂，染色體斷片與一些小染色體在形態(tài)上非常相似，極難區(qū)分，嚴重干擾山核桃屬植物染色體計數(shù)（徐川梅，2017）。山核桃屬植物染色體物理標記非常缺乏，已成為制約山核桃屬植物細胞遺傳學研究的技術瓶頸。

寡核苷酸熒光原位雜交技術（oligonucleotide fluorescence in situ hybridization, Oligo-FISH）是一項新的熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization,FISH），該技術以長約幾十堿基的單鏈寡核苷酸為探針，可實現(xiàn)對基因組、染色體和特定染色體區(qū)段進行精確鑒定和分析，具有簡單、經(jīng)濟和高效的特點（Hanet al.，2015；Duet al.，2017；Brazet al.，2018）。根據(jù)序列來源特點，寡核苷酸探針可分為單拷貝序列寡核苷酸探針和重復序列寡核苷酸探針兩種類型，其中單拷貝序列寡核苷酸探針主要依據(jù)一些染色體序列信息進行設計和開發(fā)，目前水稻(Oryza sativa)、玉米（Zea mays）、甘蔗（Saccharumofficinarum）及楊樹（Populusspp.）等物種已實現(xiàn)單條染色體單拷貝寡核苷酸探針庫的開發(fā)及染色體涂染（Liuet al.，2019；Albertet al.，2019；Yuet al.，2021；Xinet al.，2020）；第二類為重復序列寡核苷酸探針，這類探針主要基于對植物全基因組測序數(shù)據(jù)的生物信息學分析，根據(jù)高度重復的串聯(lián)重復序列核心元件進行設計和開發(fā)，目前小麥（Triticum aestivum）及花生（Arachis hypogaea）等物種已有很多報道（Duet al.，2016；2018），并在染色體研究和染色體工程育種領域得到大量利用。山核桃已完成全基因組測序工作，測序結(jié)果表明，其基因組大小為706.43 Mb，基因組中重復序列元件約占53.67%，說明山核桃具備開發(fā)重復序列寡核苷酸探針的潛力(Huanget al.，2019)。本研究利用生物信息學方法分析山核桃基因組中的重復序列，為山核桃開發(fā)出重復序列類型的寡核苷酸探針，并利用所開發(fā)的寡核苷酸探針對薄殼山核桃、大別山山核桃、云南山核桃、湖南山核桃、貴州山核桃及喙核桃等山核桃種染色體進行分析，以期該研究結(jié)果為其他山核桃品種相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山核桃、湖南山核桃、大別山山核桃、云南山核桃、貴州山核桃、薄殼山核桃及喙核桃7 個不同的山核桃種，其中山核桃主要分布在浙江省天目山山脈，大別山山核桃主要分布在安徽省大別山一帶，湖南山核桃主要分布在湖南省，云南山核桃主要分布在云南省哀牢山區(qū)，貴州山核桃和喙核桃主要分布在貴州省內(nèi)，薄殼山核桃由美國引種，種植在浙江農(nóng)林大學校園內(nèi)。9—11 月山核桃成熟季節(jié)，從不同山核桃種產(chǎn)地收集山核桃、湖南山核桃、大別山山核桃、云南山核桃、貴州山核桃、薄殼山核桃及喙核桃的種子，采樣信息見表1。

表1 供試材料Tab. 1 Materials used for this study

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培育及處理 將7 個不同山核桃種的種子，整齊的擺放到濕潤的細沙中，24 ℃條件下催芽生根，待種子根長到3～5 cm 時，剪取不同山核桃種的嫩根，利用0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉和0.1%的秋水仙素的混合液進行預處理，根尖利用固定液（甲醇:乙酸=3:1,v/v）進行固定，放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 染色體標本制備及制片預處理 染色體標本制備參照陳瑞陽等（2003）的方法略進行改進。利用ddH2O 和0.075 mol·L-1的KCl 對根尖進行前低滲處理，之后轉(zhuǎn)入2.5%纖維素和果膠酶的混合液中37 ℃酶解2～2.5 h。酶解結(jié)束后，加入固定液制成懸浮細胞，進行染色體滴片。利用相差顯微（Olympus BX51）對染色體制片進行觀察和篩選，然后利用10 mg·mL-1的RNase A、4%（質(zhì)量百分比）的胃蛋白酶和多聚甲醛等對制片進行預處理，之后進行熒光原雜交實驗。

1.2.3 山核桃重復序列寡核苷酸探針設計和制備1）簡單重復序列寡核苷酸探針設計，對于1～3 堿基重復的SSR 簡并起來約16 種，分別為A、G、AT、GC、AG、AC、AAC、AAG、AGG、ACT、CAT、CAC、ACG、CAG、AAT 和GCC，對于這16 種SSR 按照30 nt 長度直接合成，并在5'進行熒光修飾。2）其他類型重復序列寡核苷酸探針設計，利用Tandem Repeat Finder 軟件預測分析預測山核桃基因組中的串聯(lián)重復序列（tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences）。具體參數(shù)為：匹配權(quán)重Match = 2；錯配懲罰分值Mismatch = 7；插入缺失懲罰分值Delta = 7；匹配概率PM = 80；插入概率PI = 10；最小比對得分Minscore = 50；重復片段最大長度MaxPeriod = 2 000。預測結(jié)果通過Perl 腳本進行匯總分析，分別統(tǒng)計不同長度不同重復類型的重復序列在山核桃全基因組中的出現(xiàn)頻率。過濾Period size ＞ 4，篩選超過3 個堿基的復雜重復序列。為了更容易檢測到熒光信號，根據(jù)此前經(jīng)驗，進一步篩選Copy number ＞ 100，且Period size * Copy number ＞ 3 000 的重復序列，用于設計高重復度的復雜重復序列探針。另外，分別利用小麥的5S rDNA 序列和45S rDNA 與山核桃基因組序列進行比對，根據(jù)比對結(jié)果，設計出山核桃的sht-5S 和sht-45S寡核苷酸探針序列，所有探針序列均在5'進行FAM或TAMRA 熒光修飾。

1.2.4 山核桃屬寡核苷酸熒光原位雜交分析 山核桃寡核苷酸熒光原位雜交參照杜培（2017）的方法略進行改進，每張制片配制15 μL 雜交液(1.5 μL 20×SSC、0.5 μL ssDNA、7.5 μL dFA、2.0 μL 50% DS、1.5 μL 探針，加ddH2O 補充總體積至15 μL)，雜交液和制片經(jīng)變性處理后，37 ℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，分別利用2×SSC 及1×PBS 進行洗片，利用熒光顯微鏡100 倍油鏡對制片進行觀察和拍照，每個山核桃種至少統(tǒng)計30 個細胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃重復序列寡核苷酸探針篩選結(jié)果

利用山核桃中期染色體對近60 條不同類型的重復序列寡核苷酸探針進行熒光原位雜交分析，結(jié)果表明，sht-2、sht-3、sht-4、sht-5、sht-5S 和sht-45S 等6 個寡核苷酸探針可在山核桃染色體上產(chǎn)生相應的熒光信號，具體探針序列信息及修飾方式如表2 所示。 寡核苷酸探針sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上分布情況相似，有2 對信號位點存在，其中1 對位點信號較強，另外1 對位點信號非常微弱，幾乎檢測不到，且這2 對信號均位于山核桃染色體的近著絲粒部位（圖1a1—a4），2 個較強的信號位點極易斷裂，特別是其中的1 個位點，已從信號中間或近中間部位完全斷裂成2 段，如圖1 虛線所示。sht-5S 是基于5Sr DNA 序列設計出的寡核苷酸探針，主要包括sht-5S-1，sht-5S-2 和sht-5S-3 等3 條不同的序列，這3 條序列等比例混合后，可在山核桃染色體上產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號（圖2a1），且sht-5S 產(chǎn)生的熒光信號與質(zhì)粒5S rDNA 的熒光信號完全重疊（圖2a1--a3），這說明，寡核苷酸探針sht-5S 在功能上可代替質(zhì)粒5S rDNA 探針進行使用。非常有趣的是，sht-5S 僅在單條山核桃染色體上產(chǎn)生相應的熒光信號，主要位于染色體的近著絲粒部位，另1 條同源染色體的對應位置并未檢測到相應的熒光信號（圖2a1, a2）。sht-45S 是基于45S rDNA 序列設計的寡核苷酸探針，主要包括sht-45S-1、sht-45S-2、 sht-45S-3、sht-45S-4、sht-45S-5、sht-45S-6、sht-45S-7 及sht-45S-8 等8 條不同的序列，結(jié)果表明，8條序列中，僅sht-45S-5 可在山核桃染色體上產(chǎn)生微弱的熒光信號,所產(chǎn)生的熒光信號如圖3a1 和a2 虛線圈所示，但這8 條序列等比例混合使用時，所產(chǎn)的熒光信號明顯增強(圖3a3)，進一步觀察，可以發(fā)現(xiàn)，sht-45S 在山核桃染色體上有2 個信號位點存在，主要位于1 對同源染色體的近著絲粒部位，且其中1 個信號位點極易在中間或近中間部位斷裂成2 段，如黃色箭頭所示（圖3a3），導致山核桃大量細胞中出現(xiàn)3 個明亮的信號位點。雙色熒光原位雜交結(jié)果證實，寡核苷酸探針sht-45S 產(chǎn)生的熒光信號與質(zhì)粒45S rDNA 熒光信號完全重疊（圖4a1—a3），且信號強度與45S rDNA 相似，這說明寡核苷酸探針sht-45S 寡核苷酸探針在功能上可以代替質(zhì)粒45S rDNA 探針進行使用。

圖1 4 個不同寡核苷酸探針在山核桃染色體上的分布Fig. 1 The distribuiton of four oligo probes on the chromsome of C. cathayensis

圖2 寡核苷酸探針sht-5S (綠色)和5S rDNA 探針(紅色)在山核桃染色體上的共定位Fig. 2 Colocalization of oligo probe sht-5S (green) and plasmid probe 5S rDNA (red) on the chromsome of C. cathayensis

圖3 寡核苷酸探針sht-45S-5 在山核桃染色體上的分布Fig. 3 Distribuiton of oligo probe sht-45S-5 on the chromsome of C. cathayensis

圖4 寡核苷酸探針sht-45S (紅色)與質(zhì)粒45S rDNA（綠色）在山核桃染色體上的共定位Fig. 4 Colocalization of oligo probe sht-45S (red) and plasmid probe 5S rDNA (green) on the chromsome of C. cathayensis

表2 6 個不同寡核苷酸探針序列及修飾類型Tab. 2 The sequence and fluorescence modification information of six oligonucleotide probes

2.2 寡核苷酸探針sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上位置關系分析

由于寡核苷酸探針sht-2、 sht-3、sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上的分布模式相似，為了進一步對這4個不同寡核苷酸探針的位置關系進行明確，我們對這4 個探針進行了雙色熒光原位雜交分析。結(jié)果表明，山核桃染色體上sht-2 的2 對信號位點與sht-4 所產(chǎn)生的2 對信號位點在分布位置上完全重疊（圖5a1—a3），這說明，寡核苷酸探針sht-2 與sht-4 具有相同的功能。sht-3 與sht-4 在山核桃染色體上的雙色熒光原位雜交結(jié)果表明，sht-3 在山核桃染色體上產(chǎn)生的信號位點與sht-4 所產(chǎn)生的信號位點在位置上也完全重疊（圖5b1—b3），這說明寡核苷酸探針sht-3 與sht-4 具有相同的功能。sht-3 與sht-5 雙色熒光原位雜交結(jié)果表明，sht-3 在山核桃染色體上的分布位置與sht-5 也完全重疊（圖5c1—c3）。以上結(jié)果說明，sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 雖然序列不同，但這4 個探針具有相同的功能，可作為1 個探針進行使用。

圖5 寡核苷酸探針sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上共定位Fig. 5 Colocalization of oligo probe sht-2, sht-3, sht-4 and sht-5 on the chromsome of C. cathayensis

2.3 寡核苷酸探針sht-5、sht-45S 及sht-5S 在山核桃染色體上位置關系分析

因寡核苷酸探針sht-2，sht-3，sht-4 及sht-5 在山核桃染色體上分布位置完全重疊，我們選擇sht-5 作為這4 個探針的代表，利用雙色熒光原位雜交技術分析了sht-5、sht-45S、及sht-5S 在山核桃染色體上的位置關系。sht-5S 和sht-45S 雙色熒光原位雜交結(jié)果表明，sht-5S 和sht-45S 分別分布于山核桃的不同染色體上，在分布位置上沒有任何重疊（圖6a1-a3）。sht-45S 和sht-5 雙色熒光原位雜交結(jié)果表明，sht-45S 的信號與sht-5 中1 對較強的信號位點完全重疊，也即sht-5 包含了全部sht-45S 的信號，因sht-45S 其中1 個信號位點從近中間部位斷開，我們實際觀察到3 個較強的信號點（圖6b1-b3）。sht-5S 與sht-5 雙色熒光原位雜交結(jié)果表明，sht-5S 及sht-5 的信號是分布在山核桃的不同染色體上，彼此之間沒有任何重疊（圖6c1-c3）。

圖6 寡核苷酸探針sht-45S、sht-5S 及sht-5 在山核桃染色體上共定位Fig. 6 Colocalization of oligo probe sht-45S, sht-5S and sht-5 on the on the chromsome of C. cathayensis

2.4 寡核苷酸探針sht-5、sht-45S 及sht-5S 在6 個山核桃近緣種染色體上分布

寡核苷酸探針sht-5、sht-45S 及sht-5S 主要是根據(jù)山核桃基因組測序數(shù)據(jù)進行設計和開發(fā)，為了進一步驗證這3 個探針的應用范圍，我們分析了sht-5、sht-45S 及sht-5S 在湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃、貴州山核桃、薄殼山核桃及喙核桃中期染色體上的分布，這6 個山核桃種染色體數(shù)目與山核桃相同，染色體數(shù)目均為2n=32。結(jié)果表明，sht-5 在湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃這4 個山核桃種染色體上均可產(chǎn)生相應的熒光信號，且信號分布模式與山核桃相似，均只有2 對強弱不同的信號位點存在，且其中一些染色體的信號位點也存在不同程度的斷裂，例如湖南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃其中1 條染色體在信號位點處斷裂成2 段，云南山核桃有2 條染色體發(fā)生了斷裂（圖7a1-a4），但sht-5 在薄殼山核桃和喙核桃2 個山核桃種染色體上沒有任何信號分布（圖7a5，a6）。

圖7 寡核苷酸探針sht-5 在6 個不同山核桃種染色體上的分布Fig. 7 The distribuiton of oligo probe sht-5 on the chromsome of six different Carya species

另外，寡核苷酸探針sht-45S 和sht-5S 在6 個山核桃近緣野生種上的分布情況與sht-5 不同，所分析的6個山核桃種中，除喙核桃外，寡核苷酸探針sht-45S 和sht-5S 在湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃、貴州山核桃及薄殼山核桃這5 個山核桃種染色體上均可產(chǎn)生相應的熒光信號（圖7，8）。其中，寡核苷酸探針sht-45S 在湖南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃3 個山核桃種染色體上的分布模式相似，均只有1對信號位點存在，且這對信號位點極易斷裂，例如大別山山核桃，其1 個sht-45S 信號位點已完全斷開，斷開的2 條染色體臂，其中1 條染色體臂保留了大部分sht-45S 熒光信號，另1 條斷開的染色體臂僅保留少量的sht-45S 熒光信號，如白色虛線所示（圖8a, c, d）。sht-45S 在云南山核桃染色體上有2 種不同的分布模式，第一種分布模式與山核桃情況相似，sht-45S 在云南山核桃染色體上有2 個信號位點存在，位于1 對同源染色體的近著絲粒處，且其中1 條染色體的sht-45S信號位點存在一定程度斷裂，如白色虛線所示（圖8b1），這種分布類型的細胞約占91.7%。第二種分布模式中，sht-45S 在云南山核桃染色體上有3 個信號位點存在，其中較強的1 對信號位點位于1 對同源染色體的近著絲粒處，第3 個位點非常微弱，有時甚至檢測不到，單獨位于1 條染色體的近著絲粒區(qū)域，如白色箭頭所示（圖8b2），另外，2 個較強的信號位點中，其中1 個位點極易斷裂，如圖中白色虛線所示（圖8b2），這種分布類型的細胞所占比例約為8.3%。sht-45S 在薄殼山核桃染色體上主要有2 對信號位點存在，位于2 對同源染色體的近著絲粒區(qū)域，且其中1 對sht-45S 信號位點也存在一定程度的斷裂（圖8f）。

圖8 寡核苷酸探針sht-45S 在5 個不同山核桃種染色體上的分布Fig. 8 The distribuiton of oligo probe sht-45S on the chromsome of five different Carya species

sht-5S 在湖南山核桃染色體上有2 種不同的分布模式，第一種分布模式與山核桃相似，僅在其單條染色體上產(chǎn)生相應的熒光信號，主要位于染色體的近著絲粒部位，另1 條同源染色體的對應位置并未檢測到相應的熒光信號（圖9a1），這種分布類型的細胞約占55.23%；第二種分布類型中，具有1 強1 弱2 個sht-5S信號位點，位于1 對同源染色體的近著絲粒區(qū)域，如圖9 a2 箭頭所示，這種分布類型的細胞約占44.77%。sht-5S 在云南山核桃及大別山山核桃分布情況相似，均只有1 對信號位點存在，分布于1 對同源染色體的近著絲粒區(qū)域（圖9b，c），sht-5S 在貴州山核桃和薄殼山核桃染色體上的分布模式相似，具有1 強1 弱2 個sht-5S 信號位點，如箭頭所示，位于1 對同源染色體的近著絲粒區(qū)域（圖9d，e）。

圖9 寡核苷酸探針sht-5S 在5 個不同山核桃種染色體上的分布結(jié)果Fig. 9 The distribuiton of oligo probe sht-5S on the chromsome of five different Carya species

3 討論

在植物分子細胞遺傳學研究中，熒光原位雜交技術是一項非常重要的實驗技術，該技術在植物外源染色體鑒定、多倍體演化分析、染色體物理作圖及核型分析等方面發(fā)揮了重要的作用(Jiang，2019；Donget al.，2000；Caiet al.，2014；Heet al.，2015)。利用該技術對植物染色體進行相關研究時，一般需要有充足合適的熒光探針，也即染色體物理標記，染色體物理標記的數(shù)量和種類在一定程度上對熒光原位雜交技術應用的廣度和深度有著重要影響，例如水稻、黃瓜、玉米、小麥等一些農(nóng)藝植物，其染色體物理標記數(shù)量和種類較多，因此其相關的分子細胞遺傳學研究發(fā)展也非常迅速，且相關的細胞遺傳學研究水平也遠遠高于染色體物理標記非常匱乏的一些物種。傳統(tǒng)的染色體物理標記主要是通過篩選相應的BAC 或TAC 文庫而獲得，開發(fā)過程不僅繁瑣，而且還需要有高精度的遺傳圖譜作參考，例如水稻、馬鈴薯等一些染色體特異物理標記均是利用遺傳圖譜上的遺傳標記去篩選相應的BAC 文庫而獲得(Donget al.，2000；Chenget al.，2002)。對林木植物而言，多數(shù)林木植物童期長達10年或十年以上，很難大規(guī)模構(gòu)建遺傳作圖群體，目前大多數(shù)林木植物沒有相應的遺傳圖譜，在染色體物理標記開發(fā)方面存在較大難度，因此目前包括山核桃屬植物在內(nèi)的多數(shù)林木植物幾乎沒有可用的染色體物理標記，這也成為制約林木植物細胞遺傳學發(fā)展的技術瓶頸。本研究首次從山核桃基因組中成功開發(fā)出了sht-2、sht-3、sht-4、sht-5、sht-5S 和sht-45S 等6 個不同的寡核苷酸類型的染色體物理標記，雖然開發(fā)的染色體物理標記數(shù)量較少，但該研究結(jié)果使山核桃屬植物結(jié)束了無染色體物理標記可用的歷史，同時也為山核桃屬植物建立了一種新的染色體物理標記開發(fā)方法。

質(zhì)粒探針在進行FISH 實驗時，一般需要經(jīng)過質(zhì)粒提取、探針標記等繁瑣步驟，且雜交時間較長，至少需要6 小時以上。與質(zhì)粒探針相比，寡核苷酸探針具有很多獨特的優(yōu)勢，寡核苷酸探針不僅省去了質(zhì)粒提取和探針標記等繁瑣步驟，而且雜交時間大幅度縮短，大部分寡核苷酸探針雜交2 小時即可檢測到清晰的熒光信號，有些寡核苷酸探針，例如小麥的寡核苷酸探針（GAA）10、花生的寡核苷酸探針DP-2 和 DP-4 等，雜交30 分鐘即可檢測到清晰的熒光信號 (Duet al.，2019；杜培，2017) ，這極大地提高了熒光原位雜交的效率。更重要的是寡核苷酸探針主要是根據(jù)測序數(shù)據(jù)進行開發(fā)和設計，不需要相應的遺傳圖譜作參照，也不需要篩選相應的BAC 文庫，這為林木植物相關的細胞遺傳學研究提供了一個新的研究方向。本研究中的sht-45S 和sht-5S 是基于山核桃基因組中的45S rDNA 和5S rDNA 序列所開發(fā)的2 個寡核苷酸類型的探針，不僅可代替質(zhì)粒探針45S rDNA 和5S rDNA對山核桃屬植物染色體進行研究和分析，而且使山核桃屬植物相關的熒光原位雜交技術流程變得更加簡化和高效。

山核桃屬植物在地理分布上呈典型的間斷分布，間斷分布于北美和東亞地區(qū)，一些分子系統(tǒng)學研究結(jié)果表明，包括薄殼山核桃在內(nèi)的12 個美國山核桃種聚為一大類，山核桃、云南山核桃、湖南山核桃、貴州山核桃、大別山核桃及喙核桃等一些中國山核桃種聚為另一大類，與山核桃屬植物間斷分布的地理格局完全吻合（Zhanget al.，2013；Huanget al.，2019）。本研究從山核桃基因組中所開發(fā)的寡核苷酸探針sht-5，在5個中國山核桃種山核桃、云南山核桃、湖南山核桃、貴州山核桃及大別山核桃染色體上均有信號分布，但在美國山核桃種薄殼山核桃染色體上卻沒有相應的信號分布，這在一定程度上與山核桃屬植物間斷分布格局及相應的分子系統(tǒng)學研究結(jié)果存在一定的一致性。另外，sht-5 包含了sht-45S 的全部信號位點，有趣的是，在薄殼山核桃染色體上檢測到了sht-45S 的信號位點，卻未檢測到sht-5 的熒光信號，我們推測，因45S rDNA 在植物進化過程中高度保守，在很多物種染色體上均可產(chǎn)生熒光信號(Roaet al.，2012)，本研究所開發(fā)的寡核苷酸探針sht-45S 是基于山核桃基因組中的45S rDNA 序列而獲得，具有較強的保守性，因此在薄殼山核桃染色體上產(chǎn)生了相應的熒光信號，而sht-5 在山核桃屬植物中存在一定的分化，保守性沒有sht-45S 強，因此在親緣關系較近的云南山核桃、大別山山核桃、湖南山核桃及貴州山核桃染色體上有分布，而在親緣關系較遠的薄殼山核桃染色體上沒有分布。另外，本研究所開發(fā)的寡核苷酸探針sht-5、sht-5S 和sht-45S 在喙核桃染色體上均未產(chǎn)生任何熒光信號，喙核桃在系統(tǒng)分類上，最初是歸屬到喙核桃屬(Annamocarya)，后來一些研究者根據(jù)一些分子生物學研究結(jié)果，將其歸到山核桃屬（Manoset al.，2001；Zhanget al.，2013），根據(jù)我們的細胞學研究結(jié)果，我們推測喙核桃與山核桃存在較遠的親緣關系，在系統(tǒng)分類上可能歸到喙核桃屬更為合適。

研究表明，植物染色體結(jié)構(gòu)變異在自然界中經(jīng)常發(fā)生，染色體結(jié)構(gòu)變異主要包括斷裂、融合、倒位、易位、重復和缺失等，例如苔屬植物（Carex）、菊屬植物（Reichardia）及蘭屬植物（Heterotaxis）等存在廣泛的染色體斷裂與融合現(xiàn)象(Chunget al.，2011；Moraeset al.，2016；Yakovlevet al.，2017）。本研究表明，山核桃、云南山核桃、大別山核桃、貴州山核桃、湖南山核桃及薄殼山核桃等山核桃種，其一些sht-5 或sht-45S 信號位點處存在明顯的斷裂現(xiàn)象，特別是其中的山核桃，其染色體上具有2 個（sht-45S）45S rDNA 信號位點，分布于1 對同源染色體近著絲點上，但是其中1 條染色體易從45S rDNA 位點的中間或近中間位置斷開，斷開后的45S rDNA 片段變成2 個熒光信號較強的位點，因此，在大量的細胞及染色體分裂相中觀察到3 個清晰明亮的45S rDNA 信號位點（約95%以上），這對我們的實驗結(jié)果判讀造成了極干擾，我們課題組曾經(jīng)將山核桃的45S rDNA 信號位點誤判成3 個(徐川梅，2017)。一些研究證實，45S rDNA 是一個脆性位點，該區(qū)域的DNA 重復序列極易斷裂，是一個重組熱點區(qū)域(Rochaet al.，2015)，山核桃、云南山核桃、湖南山核桃、貴州山核桃及大別山山核桃等山核桃種的45S rDNA 位點存在著不同程度的斷裂，說明這些山核桃種的45S rDNA 區(qū)域也是一個脆性區(qū)域。

理論上同源染色體在序列組成上是相同的，對應的sht-5S（5S rDNA）分布模式也應完全相同，但山核桃和湖南山核桃5S rDNA 表現(xiàn)出了明顯的異質(zhì)性，只有1 條染色體上具有熒光信號，另1 條同源染色體上沒有檢測到任何熒光信號。一些研究證實，其他一些植物中也存在5SrDNA 異質(zhì)分布現(xiàn)象，例如Philodendron bipennifolium具有3 個5S rDNA 位點，2 個以成對形式位于1 對同源染色體的長臂近端處，另外1 個位點單獨位于1 條染色體的短臂處，Philodendron glaziovii2個5S rDNA 位點在形態(tài)大小及信號強度上存在極大差異（Vasconceloset al.，2018）。另外，我們課題組利用45S rDNA 和5S rDNA 對竹類植物染色體結(jié)構(gòu)進行分析時，發(fā)現(xiàn)5S rDNA 在部分竹種染色體上也存在一定的異質(zhì)性分布，例如金鑲玉竹（Phyllostachys aureosulcataf.spectabilis）及紫竹（Phyllostachys nigra）等竹種，具有3 個5S rDNA 位點，明顯不對稱（數(shù)據(jù)即將發(fā)表）。一些研究者認為染色體間不等交換、易位、DNA 序列刪除和丟失或者rDNA 區(qū)域染色體結(jié)構(gòu)的快速重排等均可導致rDNA 異質(zhì)性現(xiàn)象產(chǎn)生（Mondinet al.，2011）。因此，根據(jù)5S rDNA 在山核桃和湖南山核桃染色體上的分布結(jié)果，我們推測山核桃和湖南山核桃在染色體結(jié)構(gòu)上可能也發(fā)生過諸如插入、缺失、易位及不等交換等類型的染色體重組現(xiàn)象，進而導致5S rDNA 在山核桃染色體上呈現(xiàn)出了一定的異質(zhì)性分布。另外，還有一些研究表明，山核桃和湖南山核桃存在一定的無融合生殖現(xiàn)象，因此，存在異質(zhì)分布的5S rDNA 可以通過母本穩(wěn)定的遺傳下去。

4 結(jié)論

本研究基于山核桃全基因組測序數(shù)據(jù)，首次為山核桃開發(fā)出為sht-2、sht-3、sht-4、sht-5、sht-45S 及sht-5S 等6 個不同的寡核苷酸探針，這6 個探針在山核桃、湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃等5 個山核桃種染色體上均可產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號，可作為研究這5 個不同山核桃種染色體結(jié)構(gòu)的物理標記。sht-2、sht-3、sht-4 及sht-5 雖然序列不同，但具有相同功能，可作為一個染色體物理標記進行使用。sht-45S 及sht-5S 是基于山核桃的45S rDNA 和5S rDNA 進行設計和開發(fā)，且sht-45S 和sht-5S 與質(zhì)粒探針45S rDNA 和5S rDNA 在山核桃染色體上的分布位置完全重疊，且信號強度也與質(zhì)粒探針相似，可用來代替45S rDNA 和5S rDNA 進行使用。另外，根據(jù)sht-5、sht-45S 及sht-5S 在山核桃、湖南山核桃、云南山核桃、大別山山核桃及貴州山核桃等5 個山核桃種染色體上分布特點，我們推測這5 個山核桃種的部分染色體在結(jié)構(gòu)上可能發(fā)生過一定斷裂或重接等遺傳變異。