• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    中藥補骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉通過RANKL/OPG通路緩解激素性股骨頭壞死

    2023-08-09 14:33:42詹新宇李博樂張永華江長青
    云南中醫(yī)中藥雜志 2023年7期
    關(guān)鍵詞:股骨頭壞死

    詹新宇 李博樂 張永華 江長青

    摘要:目的 探索自擬補骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉(alendronate sodium,ALN)緩解激素性股骨頭壞死的具體機制。

    方法 在前期臨床研究基礎(chǔ)上,利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立激素性股骨頭壞死家兔模型,經(jīng)中西藥聯(lián)合干預(yù)后,研究激素性股骨頭壞死模型兔的骨組織結(jié)構(gòu)、病理、細(xì)胞凋亡以及股骨頭壞死分子標(biāo)志物的變化。

    結(jié)果 自擬補骨方聯(lián)合西藥ALN改善股骨頭壞死狀態(tài),并降低凋亡細(xì)胞的百分比。同時,自擬補骨方西藥聯(lián)合給藥下調(diào)破骨細(xì)胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)的表達(dá),上調(diào)模型兔中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及骨保護(hù)素(osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG)表達(dá),降低RANKL/OPG比值。

    結(jié)論 自擬補骨方聯(lián)合西藥ALN通過下調(diào)RANKL/OPG途徑在預(yù)防LPS誘導(dǎo)的股骨頭壞死方面顯示出協(xié)同作用。

    關(guān)鍵詞:股骨頭壞死;中藥補骨方;阿侖膦酸鈉;類固醇激素;RANKL/OPG通路

    中圖分類號:R681.8

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

    文章編號:1007-2349(2023)07-0001-03

    股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是骨科常見疾病類型之一,最主要癥狀為局部股骨頭發(fā)炎、髖關(guān)節(jié)疼痛且活動受限,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。ONFH根據(jù)病因不同可以分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性。創(chuàng)傷性O(shè)NFH主要是由嚴(yán)重外部創(chuàng)傷引起的,其病因和發(fā)病機制是明確的;然而,非創(chuàng)傷性O(shè)NFH主要是由激素、酒精及代謝性疾病引起,造成股骨頭內(nèi)部血液供應(yīng)異常,最終導(dǎo)致股骨頭中的活骨壞死[1-2]。類固醇激素引起的股骨頭壞死是非創(chuàng)傷性O(shè)NFH的最常見形式,占所有ONFH病例的30~50%。ONFH多發(fā)于20~50歲的中青年,且其發(fā)病率趨于年輕化[3]。ONFH嚴(yán)重影響了人們的健康,針對ONFH的治療尤為迫切。目前,多種西藥已被應(yīng)用于ONFH的臨床治療,例如抗凝血藥和血管擴(kuò)張劑、降脂藥、雙膦酸鹽類等;臨床研究證實雙膦酸鹽類藥物能預(yù)防股骨頭的破壞和變形,其中阿侖膦酸鈉有防止廣泛塌陷的骨頭繼續(xù)塌陷的潛能[4]。然而目前臨床上對于西藥治療ONFH的用藥時機、劑量等問題仍缺乏相關(guān)的系統(tǒng)研究,且存在著靶向性低,易產(chǎn)生副作用等缺點。傳統(tǒng)中藥在中國已經(jīng)使用了數(shù)千年,具有許多優(yōu)點,如多靶點、全身調(diào)節(jié)、副作用小和價格低廉。近年來大量研究證明中藥能減輕骨壞死程度、有效延緩ONFH的進(jìn)程[5]。之前的研究證明補骨方在ONFH中顯示出良好的臨床療效[6],但其在ONFH中的功能和機制卻鮮為人知。在這項研究中,筆者建立了脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的ONFH兔模型,并研究了補骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉在LPS誘導(dǎo)的ONFH中的作用和機制。

    1 資料與方法

    1.1 動物模型構(gòu)建 新西蘭大白兔共20只,年齡8周,體重約2.5 kg,雄性,按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng),自由飲食、飲水。實驗白兔購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。待實驗白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,精確稱重,隨機選取5只作為空白對照組,其余15只作為模型組。模型組動物經(jīng)耳緣靜脈注射10 μg/kg脂多糖,24 h后于右側(cè)臀部肌肉注射醋酸潑尼松龍20 mg/kg,連續(xù)注射3 d,每次間隔24 h??瞻讓φ战M注射同等劑量的生理鹽水,不注射脂多糖和醋酸潑尼松龍。為預(yù)防感染,動物每周2次肌肉注射青霉素鈉,每次每只5萬單位。造模6周后,通過對比空白對照組動物和模型組動物的進(jìn)食量、毛色狀況、體重、注射部位病變程度、精神狀態(tài)評價造模是否成功。然后隨機選取1只對照組和3只模型組動物采集股骨固定并進(jìn)行HE染色。此次研究中所有動物實驗均已經(jīng)過當(dāng)?shù)貍惱頃徟ㄟ^。

    1.2 給藥方式 將造模成功的剩余12只動物隨機分為三組,每組4只,即模型組、西藥組、補骨方+西藥組。西藥組為阿侖膦酸鈉(alendronate sodium,ALN,北京萬生藥業(yè)),按照150 μg/kg·d-1進(jìn)行灌胃;補骨方+西藥聯(lián)合給藥組為阿侖膦酸鈉加上自擬補骨方。中藥補骨方由12種中草藥組成,包括血竭、龍膽、川芎、黨參、紫草、白術(shù)、牛膝、紅花、金銀花、麥冬、沒藥和甘草。將總重100 g草藥浸入1,000 mL水中,煮沸濃縮至250~300 mL。中藥劑量按兔子體重計算,使用前先將藥物稀釋于生理鹽水,按照25 g/ kg·d-1進(jìn)行灌胃,對照組用等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃,共治療四周。

    1.3 臨床觀察 觀察對比各組動物的進(jìn)食量、毛色狀況、體重、注射部位病變程度、精神狀態(tài)、死亡率。

    1.4 HE染色 白兔股骨組織置于多聚甲醛中固定后,用乙醇逐級脫水,經(jīng)浸蠟、包埋后,制成4 μm組織切片,蘇木素染色7 min、伊紅染色1 min后在顯微鏡(Olympus,日本)下觀察。

    1.5 TUNEL染色 使用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)檢測細(xì)胞凋亡率。組織切片用100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液室溫孵育20 min;再用100 μL1×Equilibration Buffer室溫孵育10 min;隨后加入TdT,37℃避光孵育60 min;最后滴加DAPI避光孵育5 min,然后在熒光顯微鏡(Olympus,日本)下觀察采集圖像。

    1.6 RT-qPCR檢測 取100 mg組織,加入1 mL Trizol提取總RNA;通過Oligo引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄生成cDNA;以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行基因表達(dá)量分析。靶基因的相對表達(dá)量通過 2-ΔΔCt法分析;GAPDH作為內(nèi)參;PCR反應(yīng)條件為:50℃ 2 min,95℃ 10 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,40循環(huán);PCR反應(yīng)引物序列如表1。

    1.7 Western blotting 檢測 用EDTA脫鈣液對股骨標(biāo)本進(jìn)行脫鈣;隨后利用RIPA裂解液冰上提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度后電泳跑膠(分離膠濃度為8%,蛋白上樣量為40 μg),轉(zhuǎn)膜;加入RANKL(1∶500;Bs-20624R,Bioss)和OPG(1∶500;Bs-2064R,Bioss)一抗,4℃過夜孵育;然后再加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)二抗(1∶2,000;BA1054,博士德生物科技有限公司,武漢),37 ℃孵育1 h;最后顯影、拍攝,利用Image J軟件(Rockville,USA)處理圖像,測定灰度值。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有結(jié)果以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn),多組間比較采用單因素方差分析,2組之間比較采用t檢驗。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖軟件為GraphPad prism 7(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)。P<0.05和P<0.01為顯著性差異和極顯著性差異的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 臨床觀察結(jié)果 實驗過程中,對照組動物進(jìn)食正常、毛色正常、體重增加,無異常。模型組動物進(jìn)食減少、毛色干枯雜亂、體重下降、注射部位出現(xiàn)浮腫、行動不便。建模一周后,模型組動物右爪逐漸出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象,空白對照組動物右爪無變化。模型組動物與對照組相比,進(jìn)食量明顯下降,精神狀態(tài)較萎靡,體重下降,毛發(fā)不光亮。與模型組相比,補骨方聯(lián)合ALN給藥后進(jìn)食量有所增加,精神狀態(tài)漸漸轉(zhuǎn)好。體重較模型組有所回升,毛色逐漸恢復(fù)光亮。實驗過程中所有動物均未死亡。

    2.2 組織病理學(xué)檢查結(jié)果 取白兔股骨組織進(jìn)行HE染色。如圖1所示,對照組軟骨細(xì)胞排列均勻,細(xì)胞核呈圓形,形態(tài)正常,骨髓腔細(xì)胞正常,骨小梁完整,破骨細(xì)胞較少。模型組動物軟骨細(xì)胞損傷排列雜亂,細(xì)胞核固縮,骨小梁斷裂消失,骨髓腔細(xì)胞胞質(zhì)顏色溶解著色變淺,細(xì)胞核固縮,破骨細(xì)胞增多。與模型組比較,ALN給藥后動物軟骨細(xì)胞輕微雜亂,骨小梁溶解較為明顯,骨髓腔細(xì)胞較少,著色較淺,細(xì)胞形態(tài)較差;補骨方與ALN組軟骨細(xì)胞排列較均勻,破骨細(xì)胞減少,骨髓腔細(xì)胞著色較正常,骨小梁略有溶解。這些結(jié)果說明模型組白兔出現(xiàn)了明顯的股骨損傷;ALN延緩了股骨壞死進(jìn)程,而補骨方與ALN聯(lián)合給藥展現(xiàn)出更好的療效。

    2.3 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨組織ALP含量的影響 ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志物,其含量變化如圖2所示。與對照組相比,模型組中ALP含量明顯下降(P<0.01);與模型組相比,ALN處理后,ALP含量有所上升(P<0.01);與西藥組相比,補骨方聯(lián)合ALN處理組ALP含量上升趨勢更明顯(P<0.01)。在ONFH模型兔中,骨代謝活性明顯下降;ALN單獨處理改善了骨代謝活性;而補骨方ALN聯(lián)合給藥對改善骨代謝活性的效果更加顯著。

    2.4 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色法檢查細(xì)胞凋亡率,結(jié)果如圖3所示。與對照組相比,ONFH模型兔中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯上升(P<0.01);ALN有效降低了細(xì)胞凋亡率(P<0.01);與西藥組相比,補骨方ALN聯(lián)合給藥展現(xiàn)出更好的療效(P<0.01)。在ONFH兔中股骨細(xì)胞凋亡增多,補骨方聯(lián)合ALN有效抑制了細(xì)胞凋亡。

    2.5 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨組織中RANKL、OPG基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響 如圖4所示,與空白對照組相比,模型組白兔股骨組織中RANKL基因和蛋白表達(dá)量均明顯上調(diào),OPG基因和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01;圖4A、B、D),RANKL/OPG比值增加(P<0.01;圖4C);ALN處理后,與模型組相比,RANKL基因表達(dá)含量下降,而OPG基因表達(dá)含量上升,RANKL/OPG比值降低(P<0.01;圖4A-C),并且RANKL蛋白表達(dá)量下降,OPG蛋白表達(dá)量上升(P<0.01;圖4D);與西藥單獨處理相比,補骨方聯(lián)合ALN聯(lián)合處理效果更加明顯(P<0.01)。RANKL及OPG的含量變化說明補骨方聯(lián)合ALN通過下調(diào)RANKL/OPG抑制ONFH進(jìn)程。

    3 討論

    類固醇通過一系列的信號通路介導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞分化,從而打破了骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡,并導(dǎo)致ONFH[7]。類固醇-ONFH在臨床工作中經(jīng)常出現(xiàn),可導(dǎo)致高度致殘。因此,開發(fā)新的藥物或療法來治療和預(yù)防類固醇-ONFH迫在眉睫。目前針對ONFH的治療主要包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療(物理治療、藥物治療等)[4]。中藥或天然提取物是藥物治療ONFH中一種有效手段,與其他類型的藥物相比,具有高效和低毒等特點[8]。在之前的臨床研究中,我們發(fā)現(xiàn)補骨方聯(lián)合ALN對激素性O(shè)NFH有一定作用[6]。本研究探究了補骨方對及激素性O(shè)NFH的抑制作用和機理。研究表明,在LPS誘導(dǎo)的兔ONFH模型中,股骨頭中成骨細(xì)胞的數(shù)量減少、骨組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量增多,聯(lián)合使用ALN以及補骨方藥物可以使壞骨恢復(fù)并降低細(xì)胞凋亡率。LPS誘導(dǎo)RANKL的表達(dá)并抑制OPG的表達(dá)。聯(lián)合使用ALN加補骨方可以下調(diào)RANKL/OPG通路。

    中醫(yī)學(xué)中,股骨頭壞死屬于“骨痹”和“骨蝕”范疇,其基本病機為血瘀阻絡(luò)、精不生髓[9]。中藥補骨方由十二種中草藥組成,包括血竭、龍膽、川芎、黨參、紫草、白術(shù)、牛膝、紅花、金銀花、麥冬、沒藥和甘草。此藥方中血竭、龍膽、川芎能夠活血行氣、祛風(fēng)止痛且抗菌消炎,改善血液循環(huán),保證骨組織的營養(yǎng)供應(yīng);黨參、白術(shù)燥濕健脾、益氣養(yǎng)血、補裨益不足;牛膝中的三萜類化合物能減輕激素引起的成骨細(xì)胞抑制和骨細(xì)胞凋亡引起的成骨障礙;紅花、沒藥具有活血止痛的作用;紫草、金銀花、麥冬能夠清熱解毒;甘草調(diào)和藥物且緩急止痛[10]。ALN是一種用于治療ONFH的西藥,它能夠增加骨密度、抑制骨溶解,有效抑制股骨頭壞死。本次研究證實補骨方聯(lián)合ALN處理減少了LPS誘導(dǎo)的ONFH中的破骨細(xì)胞數(shù)量,改善了股骨細(xì)胞形態(tài),有效降低了股骨頭壞死。ALP是一種普遍存在于成骨細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)酶,骨代謝旺盛時,ALP活性增強[11]。本次研究結(jié)果顯示,使用自擬補骨方和ALN聯(lián)合處理后,壞死骨組織中細(xì)胞凋亡率降低且ALP含量明顯上升;這說明補骨方ALN聯(lián)合處理改善了ONFH模型兔股骨壞死狀態(tài),減緩了ONFH進(jìn)程。RANKL/OPG是評價骨健康與調(diào)節(jié)骨吸收平衡的重要指標(biāo),其增加則促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡,使骨形成延遲。OPG能抑制破骨細(xì)胞分化和活性,維持骨代謝平衡[12]。牛膝提取物對類固醇誘導(dǎo)的OPG下調(diào)和RANKL上調(diào)具有拮抗作用,并且對預(yù)防類固醇誘導(dǎo)的ONFH有好處[13]。本研究結(jié)果顯示,補骨方聯(lián)合ALN通過上調(diào)OPG表達(dá)和下調(diào)RANKL表達(dá)以降低RANKL/OPG比值,進(jìn)一步增強了ALN對LPS誘導(dǎo)的ONFH的療效。

    這項研究表明,補骨方ALN聯(lián)合處理可以通過下調(diào)RANKL/OPG通路來加速壞死骨的修復(fù)并改善LPS誘導(dǎo)的ONFH的發(fā)展進(jìn)程,對LPS誘發(fā)的ONFH具有一定緩解作用。

    參考文獻(xiàn):

    [1]許燦宏,陳躍平,章曉云.成骨信號通路在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中的作用[J].中國組織工程研究,2020,24(14):2235-2242.

    [2]譚文志,王國強,王建忠.中藥治療早中期股骨頭壞死的應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2022,28(1):157-162.

    [3]齊琳,任忠陸.中藥治療股骨頭壞死的作用機制研究進(jìn)展[J].中國藥物經(jīng)濟(jì)學(xué),2022,17(1):121-124.

    [4]張昌攀,謝慶華,張豐毅.非手術(shù)治療非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的臨床研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎,2020,9(10):76-80.

    [5]黃榮蘭,胡文彬,詹慶昊.中醫(yī)藥通過調(diào)控骨代謝相關(guān)信號通路治療股骨頭壞死的研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2021,27(8):241-250.

    [6]詹新宇.自擬補骨方聯(lián)合阿倫磷酸鈉治療非創(chuàng)傷性股骨頭壞死臨床療效觀察[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2019,31(8):1568-1571.

    [7]孫飛,彭昊.激素性股骨頭壞死病理機制中細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].骨科,2022,13(1):86-91.

    [8]康錦文,杜志峰,于國勝.中醫(yī)療法治療非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死臨床進(jìn)展[J].中醫(yī)研究,2022,35(2):66-70.

    [9]鄭敦輝,李國湘,符方濤.四妙消腫方聯(lián)合西藥治療早期股骨頭壞死的療效及對髖關(guān)節(jié)功能的影響[J].四川中醫(yī),2022,40(4):158-161.

    [10]崔小東.中藥補骨方對骨質(zhì)疏松性股骨粗隆間骨折外固定術(shù)后骨質(zhì)代謝的影響[J].北方藥學(xué),2020,17(5):131-132.

    [11]張倩,楊旭,王媛,等.金匱腎氣丸對去勢大鼠骨微結(jié)構(gòu)及ALP、OPG、IL-6的影響[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2020,26(10):1475-1480.

    [12]李文茜,郭永昌,田亮玉,等.OPG、RANK、RANKL及血液學(xué)指標(biāo)水平變化與股骨頭壞死的相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2022,38(10):1654-1162.

    [13]商震,程建姝.固定配方加引經(jīng)藥牛膝對防治兔股骨頭壞死的作用機制研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2015,21(7):803-805.

    (收稿日期:2022-08-18)

    猜你喜歡
    股骨頭壞死
    股骨頭壞死非手術(shù)治療的研究進(jìn)展
    青壯年股骨頸骨折術(shù)后股骨頭壞死的多元相關(guān)性分析
    全髖關(guān)節(jié)置換治療髖臼發(fā)育不良并股骨頭壞死36例臨床分析
    超導(dǎo)磁共振與多層螺旋CT對診斷股骨頭壞死效果比較分析
    細(xì)針鉆孔減壓術(shù)聯(lián)合活血養(yǎng)骨湯治療早期股骨頭壞死療效觀察
    骨髓干細(xì)胞移植治療股骨頭壞死療效分析
    成人早期股骨頭壞死應(yīng)用CT和MRI檢查診斷臨床價值分析
    MRI對股骨頸骨折術(shù)后并發(fā)股骨頭壞死早期診斷的臨床研究
    鹿壽春堂鹿骨鈣的研制及其治療股骨頭壞死的機制研究
    關(guān)于股骨頭壞死、骨髓炎、腦垂體瘤、尿崩癥的患者臨床觀察與宣教
    吐鲁番市| 象州县| 九江市| 临猗县| 江口县| 新乡市| 惠水县| 台南市| 木兰县| 凌云县| 苗栗县| 新邵县| 安多县| 枣阳市| 东海县| 大名县| 盱眙县| 临洮县| 咸宁市| 年辖:市辖区| 夏津县| 祁阳县| 涿州市| 和顺县| 临清市| 望都县| 济阳县| 自贡市| 白河县| 山东省| 班玛县| 双柏县| 灵宝市| 微山县| 兴城市| 华池县| 宁化县| 霸州市| 布尔津县| 英德市| 铁岭县|