中藥補骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉通過RANKL/OPG通路緩解激素性股骨頭壞死

詹新宇 李博樂 張永華 江長青

摘要：目的 探索自擬補骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉（alendronate sodium，ALN）緩解激素性股骨頭壞死的具體機制。

方法 在前期臨床研究基礎(chǔ)上，利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立激素性股骨頭壞死家兔模型，經(jīng)中西藥聯(lián)合干預(yù)后，研究激素性股骨頭壞死模型兔的骨組織結(jié)構(gòu)、病理、細(xì)胞凋亡以及股骨頭壞死分子標(biāo)志物的變化。

結(jié)果 自擬補骨方聯(lián)合西藥ALN改善股骨頭壞死狀態(tài)，并降低凋亡細(xì)胞的百分比。同時，自擬補骨方西藥聯(lián)合給藥下調(diào)破骨細(xì)胞分化因子（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的表達(dá)，上調(diào)模型兔中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）及骨保護(hù)素（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）表達(dá)，降低RANKL/OPG比值。

結(jié)論 自擬補骨方聯(lián)合西藥ALN通過下調(diào)RANKL/OPG途徑在預(yù)防LPS誘導(dǎo)的股骨頭壞死方面顯示出協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：股骨頭壞死；中藥補骨方；阿侖膦酸鈉；類固醇激素；RANKL/OPG通路

中圖分類號：R681.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1007-2349（2023）07-0001-03

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科常見疾病類型之一，最主要癥狀為局部股骨頭發(fā)炎、髖關(guān)節(jié)疼痛且活動受限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。ONFH根據(jù)病因不同可以分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性。創(chuàng)傷性O(shè)NFH主要是由嚴(yán)重外部創(chuàng)傷引起的，其病因和發(fā)病機制是明確的；然而，非創(chuàng)傷性O(shè)NFH主要是由激素、酒精及代謝性疾病引起，造成股骨頭內(nèi)部血液供應(yīng)異常，最終導(dǎo)致股骨頭中的活骨壞死［1-2］。類固醇激素引起的股骨頭壞死是非創(chuàng)傷性O(shè)NFH的最常見形式，占所有ONFH病例的30～50％。ONFH多發(fā)于20～50歲的中青年，且其發(fā)病率趨于年輕化［3］。ONFH嚴(yán)重影響了人們的健康，針對ONFH的治療尤為迫切。目前，多種西藥已被應(yīng)用于ONFH的臨床治療，例如抗凝血藥和血管擴(kuò)張劑、降脂藥、雙膦酸鹽類等；臨床研究證實雙膦酸鹽類藥物能預(yù)防股骨頭的破壞和變形，其中阿侖膦酸鈉有防止廣泛塌陷的骨頭繼續(xù)塌陷的潛能［4］。然而目前臨床上對于西藥治療ONFH的用藥時機、劑量等問題仍缺乏相關(guān)的系統(tǒng)研究，且存在著靶向性低，易產(chǎn)生副作用等缺點。傳統(tǒng)中藥在中國已經(jīng)使用了數(shù)千年，具有許多優(yōu)點，如多靶點、全身調(diào)節(jié)、副作用小和價格低廉。近年來大量研究證明中藥能減輕骨壞死程度、有效延緩ONFH的進(jìn)程［5］。之前的研究證明補骨方在ONFH中顯示出良好的臨床療效［6］，但其在ONFH中的功能和機制卻鮮為人知。在這項研究中，筆者建立了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的ONFH兔模型，并研究了補骨方聯(lián)合阿侖膦酸鈉在LPS誘導(dǎo)的ONFH中的作用和機制。

1 資料與方法

1.1 動物模型構(gòu)建 新西蘭大白兔共20只，年齡8周，體重約2.5 kg，雄性，按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。實驗白兔購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。待實驗白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，精確稱重，隨機選取5只作為空白對照組，其余15只作為模型組。模型組動物經(jīng)耳緣靜脈注射10 μg/kg脂多糖，24 h后于右側(cè)臀部肌肉注射醋酸潑尼松龍20 mg/kg，連續(xù)注射3 d，每次間隔24 h?？瞻讓φ战M注射同等劑量的生理鹽水，不注射脂多糖和醋酸潑尼松龍。為預(yù)防感染，動物每周2次肌肉注射青霉素鈉，每次每只5萬單位。造模6周后，通過對比空白對照組動物和模型組動物的進(jìn)食量、毛色狀況、體重、注射部位病變程度、精神狀態(tài)評價造模是否成功。然后隨機選取1只對照組和3只模型組動物采集股骨固定并進(jìn)行HE染色。此次研究中所有動物實驗均已經(jīng)過當(dāng)?shù)貍惱頃徟ㄟ^。

1.2 給藥方式 將造模成功的剩余12只動物隨機分為三組，每組4只，即模型組、西藥組、補骨方+西藥組。西藥組為阿侖膦酸鈉（alendronate sodium，ALN，北京萬生藥業(yè)），按照150 μg/kg·d-1進(jìn)行灌胃；補骨方+西藥聯(lián)合給藥組為阿侖膦酸鈉加上自擬補骨方。中藥補骨方由12種中草藥組成，包括血竭、龍膽、川芎、黨參、紫草、白術(shù)、牛膝、紅花、金銀花、麥冬、沒藥和甘草。將總重100 g草藥浸入1，000 mL水中，煮沸濃縮至250～300 mL。中藥劑量按兔子體重計算，使用前先將藥物稀釋于生理鹽水，按照25 g/ kg·d-1進(jìn)行灌胃，對照組用等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，共治療四周。

1.3 臨床觀察 觀察對比各組動物的進(jìn)食量、毛色狀況、體重、注射部位病變程度、精神狀態(tài)、死亡率。

1.4 HE染色 白兔股骨組織置于多聚甲醛中固定后，用乙醇逐級脫水，經(jīng)浸蠟、包埋后，制成4 μm組織切片，蘇木素染色7 min、伊紅染色1 min后在顯微鏡（Olympus，日本）下觀察。

1.5 TUNEL染色 使用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）檢測細(xì)胞凋亡率。組織切片用100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液室溫孵育20 min；再用100 μL1×Equilibration Buffer室溫孵育10 min；隨后加入TdT，37℃避光孵育60 min；最后滴加DAPI避光孵育5 min，然后在熒光顯微鏡（Olympus，日本）下觀察采集圖像。

1.6 RT-qPCR檢測 取100 mg組織，加入1 mL Trizol提取總RNA；通過Oligo引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄生成cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行基因表達(dá)量分析。靶基因的相對表達(dá)量通過 2-ΔΔCt法分析；GAPDH作為內(nèi)參；PCR反應(yīng)條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40循環(huán)；PCR反應(yīng)引物序列如表1。

1.7 Western blotting 檢測 用EDTA脫鈣液對股骨標(biāo)本進(jìn)行脫鈣；隨后利用RIPA裂解液冰上提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后電泳跑膠（分離膠濃度為8%，蛋白上樣量為40 μg），轉(zhuǎn)膜；加入RANKL（1∶500；Bs-20624R，Bioss）和OPG（1∶500；Bs-2064R，Bioss）一抗，4℃過夜孵育；然后再加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)二抗（1∶2，000；BA1054，博士德生物科技有限公司，武漢），37 ℃孵育1 h；最后顯影、拍攝，利用Image J軟件（Rockville，USA）處理圖像，測定灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有結(jié)果以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，多組間比較采用單因素方差分析，2組之間比較采用t檢驗。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖軟件為GraphPad prism 7（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）。P<0.05和P<0.01為顯著性差異和極顯著性差異的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果 實驗過程中，對照組動物進(jìn)食正常、毛色正常、體重增加，無異常。模型組動物進(jìn)食減少、毛色干枯雜亂、體重下降、注射部位出現(xiàn)浮腫、行動不便。建模一周后，模型組動物右爪逐漸出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，空白對照組動物右爪無變化。模型組動物與對照組相比，進(jìn)食量明顯下降，精神狀態(tài)較萎靡，體重下降，毛發(fā)不光亮。與模型組相比，補骨方聯(lián)合ALN給藥后進(jìn)食量有所增加，精神狀態(tài)漸漸轉(zhuǎn)好。體重較模型組有所回升，毛色逐漸恢復(fù)光亮。實驗過程中所有動物均未死亡。

2.2 組織病理學(xué)檢查結(jié)果 取白兔股骨組織進(jìn)行HE染色。如圖1所示，對照組軟骨細(xì)胞排列均勻，細(xì)胞核呈圓形，形態(tài)正常，骨髓腔細(xì)胞正常，骨小梁完整，破骨細(xì)胞較少。模型組動物軟骨細(xì)胞損傷排列雜亂，細(xì)胞核固縮，骨小梁斷裂消失，骨髓腔細(xì)胞胞質(zhì)顏色溶解著色變淺，細(xì)胞核固縮，破骨細(xì)胞增多。與模型組比較，ALN給藥后動物軟骨細(xì)胞輕微雜亂，骨小梁溶解較為明顯，骨髓腔細(xì)胞較少，著色較淺，細(xì)胞形態(tài)較差；補骨方與ALN組軟骨細(xì)胞排列較均勻，破骨細(xì)胞減少，骨髓腔細(xì)胞著色較正常，骨小梁略有溶解。這些結(jié)果說明模型組白兔出現(xiàn)了明顯的股骨損傷；ALN延緩了股骨壞死進(jìn)程，而補骨方與ALN聯(lián)合給藥展現(xiàn)出更好的療效。

2.3 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨組織ALP含量的影響 ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志物，其含量變化如圖2所示。與對照組相比，模型組中ALP含量明顯下降（P<0.01）；與模型組相比，ALN處理后，ALP含量有所上升（P<0.01）；與西藥組相比，補骨方聯(lián)合ALN處理組ALP含量上升趨勢更明顯（P<0.01）。在ONFH模型兔中，骨代謝活性明顯下降；ALN單獨處理改善了骨代謝活性；而補骨方ALN聯(lián)合給藥對改善骨代謝活性的效果更加顯著。

2.4 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色法檢查細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，ONFH模型兔中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯上升（P<0.01）；ALN有效降低了細(xì)胞凋亡率（P<0.01）；與西藥組相比，補骨方ALN聯(lián)合給藥展現(xiàn)出更好的療效（P<0.01）。在ONFH兔中股骨細(xì)胞凋亡增多，補骨方聯(lián)合ALN有效抑制了細(xì)胞凋亡。

2.5 補骨方聯(lián)合ALN對白兔股骨組織中RANKL、OPG基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響 如圖4所示，與空白對照組相比，模型組白兔股骨組織中RANKL基因和蛋白表達(dá)量均明顯上調(diào)，OPG基因和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01；圖4A、B、D），RANKL/OPG比值增加（P<0.01；圖4C）；ALN處理后，與模型組相比，RANKL基因表達(dá)含量下降，而OPG基因表達(dá)含量上升，RANKL/OPG比值降低（P<0.01；圖4A-C），并且RANKL蛋白表達(dá)量下降，OPG蛋白表達(dá)量上升（P<0.01；圖4D）；與西藥單獨處理相比，補骨方聯(lián)合ALN聯(lián)合處理效果更加明顯（P<0.01）。RANKL及OPG的含量變化說明補骨方聯(lián)合ALN通過下調(diào)RANKL/OPG抑制ONFH進(jìn)程。

3 討論

類固醇通過一系列的信號通路介導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞分化，從而打破了骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡，并導(dǎo)致ONFH［7］。類固醇-ONFH在臨床工作中經(jīng)常出現(xiàn)，可導(dǎo)致高度致殘。因此，開發(fā)新的藥物或療法來治療和預(yù)防類固醇-ONFH迫在眉睫。目前針對ONFH的治療主要包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療（物理治療、藥物治療等）［4］。中藥或天然提取物是藥物治療ONFH中一種有效手段，與其他類型的藥物相比，具有高效和低毒等特點［8］。在之前的臨床研究中，我們發(fā)現(xiàn)補骨方聯(lián)合ALN對激素性O(shè)NFH有一定作用［6］。本研究探究了補骨方對及激素性O(shè)NFH的抑制作用和機理。研究表明，在LPS誘導(dǎo)的兔ONFH模型中，股骨頭中成骨細(xì)胞的數(shù)量減少、骨組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，聯(lián)合使用ALN以及補骨方藥物可以使壞骨恢復(fù)并降低細(xì)胞凋亡率。LPS誘導(dǎo)RANKL的表達(dá)并抑制OPG的表達(dá)。聯(lián)合使用ALN加補骨方可以下調(diào)RANKL/OPG通路。

中醫(yī)學(xué)中，股骨頭壞死屬于“骨痹”和“骨蝕”范疇，其基本病機為血瘀阻絡(luò)、精不生髓［9］。中藥補骨方由十二種中草藥組成，包括血竭、龍膽、川芎、黨參、紫草、白術(shù)、牛膝、紅花、金銀花、麥冬、沒藥和甘草。此藥方中血竭、龍膽、川芎能夠活血行氣、祛風(fēng)止痛且抗菌消炎，改善血液循環(huán)，保證骨組織的營養(yǎng)供應(yīng)；黨參、白術(shù)燥濕健脾、益氣養(yǎng)血、補裨益不足；牛膝中的三萜類化合物能減輕激素引起的成骨細(xì)胞抑制和骨細(xì)胞凋亡引起的成骨障礙；紅花、沒藥具有活血止痛的作用；紫草、金銀花、麥冬能夠清熱解毒；甘草調(diào)和藥物且緩急止痛［10］。ALN是一種用于治療ONFH的西藥，它能夠增加骨密度、抑制骨溶解，有效抑制股骨頭壞死。本次研究證實補骨方聯(lián)合ALN處理減少了LPS誘導(dǎo)的ONFH中的破骨細(xì)胞數(shù)量，改善了股骨細(xì)胞形態(tài)，有效降低了股骨頭壞死。ALP是一種普遍存在于成骨細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)酶，骨代謝旺盛時，ALP活性增強［11］。本次研究結(jié)果顯示，使用自擬補骨方和ALN聯(lián)合處理后，壞死骨組織中細(xì)胞凋亡率降低且ALP含量明顯上升；這說明補骨方ALN聯(lián)合處理改善了ONFH模型兔股骨壞死狀態(tài)，減緩了ONFH進(jìn)程。RANKL/OPG是評價骨健康與調(diào)節(jié)骨吸收平衡的重要指標(biāo)，其增加則促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，使骨形成延遲。OPG能抑制破骨細(xì)胞分化和活性，維持骨代謝平衡［12］。牛膝提取物對類固醇誘導(dǎo)的OPG下調(diào)和RANKL上調(diào)具有拮抗作用，并且對預(yù)防類固醇誘導(dǎo)的ONFH有好處［13］。本研究結(jié)果顯示，補骨方聯(lián)合ALN通過上調(diào)OPG表達(dá)和下調(diào)RANKL表達(dá)以降低RANKL/OPG比值，進(jìn)一步增強了ALN對LPS誘導(dǎo)的ONFH的療效。

這項研究表明，補骨方ALN聯(lián)合處理可以通過下調(diào)RANKL/OPG通路來加速壞死骨的修復(fù)并改善LPS誘導(dǎo)的ONFH的發(fā)展進(jìn)程，對LPS誘發(fā)的ONFH具有一定緩解作用。

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（收稿日期：2022-08-18）