小麥粉中嘔吐毒素檢測能力驗證及關鍵點分析

◎ 李麗麗，周 雪，李 勁，付錦華

（營口市食品藥品檢驗檢測中心，遼寧 營口 115003）

嘔吐毒素，天然產(chǎn)生且化學性質穩(wěn)定，是谷物赤霉病的重要指示性毒素。嘔吐毒素廣泛污染小麥、玉米等糧食作物和飼料，是污染最為普遍和嚴重的真菌毒素之一[1]。嘔吐毒素能損害機體免疫系統(tǒng)，導致人和動物出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等中毒癥狀[2]。我國目前明確規(guī)定谷物及其制品中嘔吐毒素限量為1 000 μg / kg[3]，而嘔吐毒素也是遼寧省儲備糧日常監(jiān)控和出入庫必檢項目之一。作為儲備糧承檢單位，提高實驗室真菌毒素的檢測能力、加強檢測過程質量控制對保障糧食安全具有重要意義。

為進一步提高檢驗檢測能力，營口市食品藥品檢驗檢測中心于2022年參加了由中國檢驗檢疫研究院組織的小麥粉中嘔吐毒素能力驗證考核，本文以此次能力驗證為契機，對小麥粉中嘔吐毒素含量進行測定并對實驗過程關鍵點予以總結。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與耗材

Agilent-1260 高效液相色譜儀：配紫外可見光檢測器，美國安捷倫公司；QUINTIX124-1CN 電子天平：德國賽多利斯公司；ST16 高速冷凍離心機：德國賽默飛公司；Multi Reax 全能型振蕩器：德國海道夫公司；MING-CHE 24UV 超純水機：德國默克密理博公司；NS-10 氮吹儀：上海屹堯儀器公司；可調移液器：普蘭德公司；0.45 μm微孔濾膜：美國歐姆尼公司；玻璃纖維濾紙：英國沃特曼公司；免疫親和柱：Romer 公司。

1.2 標準品與試劑

實驗嘔吐毒素標準品（CAS：51481-10-8）：100.0 μg/mL，Romer。

聚乙二醇：天津光復研究所；甲醇：色譜純，德國默克公司；磷酸緩沖鹽溶液：由氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、超純水按一定比例配置，用鹽酸將pH值調至7.0，涉及藥品試劑均來自天津科密歐公司。

1.3 能力驗證及質控樣品

能力驗證考核樣品：由鋁塑袋真空包裝含未知濃度嘔吐毒素的小麥粉樣品2 份，計劃編號ACASPT1463，樣品編碼分別為22-A255 和22-B334，每份樣品質量約60 g，由中國檢驗檢疫研究院提供。

能力驗證質控樣品：由鋁塑袋真空包裝含嘔吐毒素濃度為677 μg/kg 的小麥粉樣品一份，編號QC-WM-703，樣品質量約50 g，購于中國檢驗檢疫研究院。

1.4 實驗方法

1.4.1 依據(jù)標準

本試驗依據(jù)《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》（GB 5009.111—2016）[4]第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法并結合作業(yè)指導書要求進行檢測。

1.4.2 樣品提取

待測樣品充分混勻后稱取5 g 于50 mL 離心管中，依次加入1 g 聚乙二醇和25 mL 水，混勻，振蕩提取20 min。6 000 r/min 離心10 min，玻璃纖維濾紙過濾后收集濾液于50 mL 離心管中，10 000 r/min 離心5 min，待凈化。

1.4.3 樣品凈化

免疫親和柱恢復至室溫。待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，準確移取上述濾液2.0 mL 至免疫親和柱中。控制樣液以每秒1 滴的速度通過免疫親和柱，直至空氣進入親和柱中。用5 mL PBS 緩沖鹽溶液和5 mL 水先后淋洗免疫親和柱，抽干小柱。

1.4.4 樣品洗脫

準確加入2 mL 甲醇洗脫免疫親和柱，控制每秒1 滴的下滴速度，收集全部洗脫液于試管中。50 ℃下氮氣吹至近干，加入1.0 mL 初始流動相，渦旋30 s 溶解殘留物，0.45 μm 濾膜過濾，收集濾液，液相色譜儀紫外檢測器測定。

1.4.5 儀器參數(shù)

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm 粒度5 μm），美國安捷倫公司；柱溫：35 ℃；進樣量：50 μL；流速：0.8 mL/min；檢測波長：218 nm；流動相：甲醇+水（20+80）。

2 結果與分析

2.1 預實驗及標準曲線

結合預實驗測得值和質控樣含量，分別配制濃度為50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL 的標準系列工作液，共6 點，液相色譜儀依次進樣50 μL，外標法定量。以嘔吐毒素質量濃度為X軸、嘔吐毒素液相色譜儀測得峰面積為Y軸繪制標準曲線，同時得線性回歸方程及相關系數(shù)，見圖1。結果顯示，在50～500 ng/mL 范圍內(nèi)標準曲線線性關系良好。

圖1 嘔吐毒素標準曲線及線性方程圖

2.2 質控及能力驗證樣品測定

按上述試驗條件，平行測定質控樣中嘔吐毒素含量6 次，計算結果回收率及變異系數(shù)，以此驗證方法的準確度和穩(wěn)定性。結果顯示，質控樣品測定結果、回收率及變異系數(shù)均在標準要求范圍內(nèi)[5]，實驗方法及儀器性能均可靠。

根據(jù)給定考核樣品質量及作業(yè)指導書要求，按上述試驗條件，兩份能力驗證樣品分別平行測定5 次，計算嘔吐毒素質量濃度，取平均值作為最終呈報結果，檢測數(shù)據(jù)見表1。

表1 嘔吐毒素質控及能力驗證樣品檢測數(shù)據(jù)表

2.3 能力驗證考核結果

本次能力驗證結果考核采用Z比分數(shù)法[6]。組織單位通過統(tǒng)計參與實驗室反饋數(shù)據(jù)計算出考核樣品指定值及各實驗室反饋數(shù)據(jù)的Z值。評判標準為：Z絕對值越接近于 0, 則表示該結果符合性越好。當∣Z∣≤2.0 為滿意結果，當2.0 ＜∣Z∣＜3.0 為可疑結果，∣Z∣≥3.0 為不滿意（離群）結果。本實驗室2 個樣品檢測數(shù)據(jù)結果反饋均為滿意結果，數(shù)據(jù)見表2。

表2 嘔吐毒素能力驗證檢測結果及評價表

2.4 關鍵點分析

2.4.1 作業(yè)指導書

實驗人員收到能力驗證考核樣后，應第一時間對待測樣品進行查驗，仔細閱讀附帶作業(yè)指導書，按照指導書要求進行操作。收到后如無法立刻開展實驗，應按照指導書要求進行存放，避免待測目標物降解、失效，影響檢測結果。檢測前要對樣品進行充分混勻，避免由樣品不均造成結果重現(xiàn)性差。

2.4.2 標準曲線優(yōu)化

通過預實驗，粗略計算能力驗證考核樣品濃度。考慮加標及質控樣濃度的前提下，盡量圍繞樣品的測定值設置標準曲線點，且盡量使其濃度值在標準曲線的中段，同時標準曲線的線性范圍不可太寬，避免過低和過高濃度點檢測數(shù)據(jù)偏離對標準曲線線性的影響。

2.4.3 實驗操作

（1）人員。本試驗操作過程較復雜，對試驗人員熟練程度和經(jīng)驗要求較高。筆者在日常實驗時曾發(fā)現(xiàn)，含嘔吐毒素樣品洗脫后若未及時氮吹，上機后樣品測定結果及回收率均明顯偏低。因此，試驗過程應一氣呵成，各操作步驟間避免長時間暫停。

（2）免疫親和柱。待測液通過免疫親和柱凈化前，應使柱內(nèi)原有液體通過全部柱體后流出且使柱體內(nèi)無氣泡，必要時可輕彈柱體加速氣泡冒出，保證后續(xù)待測目標物通過凈化柱時被充分保留，減少損耗；使用免疫親和柱時，注意控制樣品流速，流速過快，免疫親和柱易吸附不完全，造成回收率不穩(wěn)定，流速過慢，免疫親和柱可能會吸附過多雜質，影響實驗結果。

（3）氮吹。試驗中應嚴格監(jiān)控氮吹溫度和速度，樣品被吹至近干后立即拿出并復溶上機檢測，過高、過快、過度氮吹，都會加大待測目標物損耗，影響結果準確度；為防止交叉污染，應提前清洗氮吹針外壁，使用后，需對氮吹針再次進行清洗。

（4）針孔濾膜。當前市場中微孔濾膜品牌眾多，不同品牌微孔濾膜材質、過濾原理、使用對象大不相同。GB 5009.111—2016 標準中采用0.45 水相微孔濾膜，最終定容溶劑為20%甲醇水溶液，但部分品牌生產(chǎn)的水相微孔濾膜只適用于過濾純水溶劑，過濾含有機相溶劑時會造成濾膜溶膜而無法達到過濾要求。故實驗人員在使用前應注意其濾膜材質與樣品最終定容溶劑是否相適用，確認濾膜無吸附和溶解現(xiàn)象后，方可使用。

3 結語

本次實驗采用高效液相色譜法對2 份小麥粉能力驗證考核樣品進行測定，通過熟悉標準、準備實驗耗材、預實驗、標準曲線優(yōu)化、質控樣比對測定、能力驗證樣品測定等步驟，得到測定結果數(shù)據(jù)，最終順利通過能力驗證考核。

通過參與本次能力驗證考核，能較好地處理實驗過程中遇到的問題并進行歸納總結，提升檢測操作能力與水平，強化檢測結果的質量控制，使實驗室在嘔吐毒素檢測能力方面邁上新臺階。