生物被膜在白念珠菌病的研究進(jìn)展

唐詩琴，李小靜

長期以來，以白念珠菌（Candida albicans）為主的真菌感染威脅著人類的健康，特別是免疫缺陷的群體。隨著越來越多抗真菌藥物及免疫抑制劑的使用，白念珠菌的耐藥也成為了一個嚴(yán)重的問題，而導(dǎo)致這種情況最重要的一個因素就是生物被膜（Biofilm）的形成。生物被膜存在于包括植物和哺乳動物組織在內(nèi)的天然基質(zhì)上，并易在人造聚合物上形成，如在導(dǎo)管、假體和植入的心臟瓣膜中被發(fā)現(xiàn)［1］。正因為白念珠菌生物被膜的存在，所以白念珠菌相關(guān)感染疾病對臨床抗真菌藥物有很大的耐藥性，增加了白念珠菌感染的復(fù)發(fā)率，使臨床治療也變得困難。因此，需要尋找新的治療靶點去降低白念珠菌病的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率。

1 生物被膜的形成

生物被膜是一群附著在生物或非生物基質(zhì)上的微生物，嵌入細(xì)胞外聚合物基質(zhì)中，是許多微生物的主要生長狀態(tài)。白念珠菌生物被膜的形成主要由酵母細(xì)胞、假菌絲和菌絲通過表面接觸粘附而形成的一種復(fù)雜網(wǎng)狀混合物的三維結(jié)構(gòu)［2］。白念珠菌生物被膜的發(fā)育是漸進(jìn)的，生物被膜的形成常分為4 個階段（圖1）：白念珠菌酵母細(xì)胞在底物上的吸附，形成基底層（基底層起錨定作用）、微菌落的形成和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的產(chǎn)生，成熟階段，細(xì)胞從成熟生物被膜中的分散［3］。生物被膜內(nèi)的假菌絲與菌絲細(xì)胞形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，不斷向周圍延伸擴(kuò)散。

1.1 生物被膜與粘附 粘附是生物被膜初步形成的第一步，而生物被膜完整性是整個生物被膜形成重要的第一步。在粘附過程中，單個酵母細(xì)胞一般會粘附在物體表面，啟動生物被膜形成的階段。此時的酵母細(xì)胞還可以重新回到浮游狀態(tài)，所以在這個階段，生物被膜的形成是相對可逆的。在粘附過程中有兩個重要物質(zhì)：轉(zhuǎn)錄因子與黏附素。白念珠菌中研究最多的黏附素家族是Als（Agglutinin-like sequence，凝集素樣序列）蛋白家族，Als 蛋白家族是白念珠菌生物被膜形成和發(fā)展的基礎(chǔ)，Als1、Als3 和Als5 在白念珠菌與宿主細(xì)胞相互粘附過程中發(fā)揮著重要作用；Als1除了在粘附中的作用外，還對真菌細(xì)胞大小有一定影響［4］。Hwp1、Rbt1、Eap1 和Ywp1 都是糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl phosphatidyll inositol，GPI）錨定細(xì)胞壁蛋白，其中Hwp1 是重要的粘附因子，它是菌絲特異性細(xì)胞壁蛋白，能調(diào)控生物被膜中的菌絲形成，并且促進(jìn)白念珠菌與宿主細(xì)胞的粘附［5］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Als3 或Hwp1 基因缺失的時候，生物被膜形成的能力受到抑制，可導(dǎo)致毒力減弱［6，7］。通過與浮游細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行比較后，確定了3 個新的生物被膜形成的調(diào)節(jié)因子：Flo8、Gal4 和Rfx2［8］。在生物被膜形成全程中都需要Flo8 因子的參與，而在中期發(fā)育中需要Gal4 和Rfx2 因子的參與才能形成較完善的生物被膜，靶向白念珠菌中的Flo8 因子會引起針對多種微生物感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。在將來，生物被膜調(diào)節(jié)因子與黏附素家族的進(jìn)一步研究有希望成為治療白念珠菌感染的一種方法。

1.2 生物被膜與菌絲 白念珠菌和其它真菌不同之處在于它可以在各種條件下形成酵母細(xì)胞和菌絲，菌絲是生物被膜形成的重要成分［9］。在生物被膜形成過程中，一些核心調(diào)節(jié)因子比如Efg1、Ndt80、Rob1和Tec1 均參與了浮游細(xì)胞的生長［10］，但是懸浮培養(yǎng)中的菌絲，容易形成有缺陷的菌株，不利于生物被膜形成，這些調(diào)節(jié)因子有促進(jìn)菌絲形成的作用，若將它們在浮游條件下培養(yǎng)，其中一個基因缺失，都會抑制或降低白念珠菌的菌絲形成，進(jìn)一步影響生物被膜［11］。在菌絲調(diào)控中有2 個重要的信號途徑，包括MAPK（Mitogen-activated protein kinase，絲裂原激活蛋白激酶）信號途徑、cAMP-PKA 信號途徑。Cek1是一種胞外信號調(diào)節(jié)激酶，是MAPK家族的重要成員，它能參與調(diào)控細(xì)胞表面接觸反應(yīng)，在菌絲侵入性生長以及生物被膜形成中發(fā)揮一定的作用；cAMP-PKA 通路在真核細(xì)胞中比較保守，并能調(diào)節(jié)白念珠菌毒力，所以它們可能是抗真菌藥物開發(fā)的有希望靶點［12-14］。生物被膜中的菌絲對整個生物被膜結(jié)構(gòu)起著重要的穩(wěn)定性作用，是酵母細(xì)胞和其它菌絲支撐起來的框架。β-葡聚糖（β-glucan）的合成會影響白念珠菌生物被膜形成能力，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)生物被膜成熟以后，它頂層的菌絲細(xì)胞更具有掩蓋β-葡聚糖的能力，侵入性生長過程中穿透上皮細(xì)胞層，并通過物理刺穿吞噬細(xì)胞，避免免疫系統(tǒng)識別，引起免疫逃逸［10］。雖然菌絲細(xì)胞本身就有β-葡聚糖，但如果是未成熟的或是量不夠的菌絲細(xì)胞，就不能達(dá)到遮蓋引起逃逸的作用。因此，形成菌絲、菌絲與酵母粘附的能力對生物被膜的發(fā)育和維持至關(guān)重要，可以利用以上特性進(jìn)一步破壞生物被膜形成的條件。

1.3 生物被膜與細(xì)胞外基質(zhì) 細(xì)胞外基質(zhì)的研究一直以來是了解白念珠菌耐藥的一個重要方向，但它基質(zhì)成分比較復(fù)雜。細(xì)胞外基質(zhì)由生物被膜內(nèi)細(xì)胞分泌的胞外聚合物組成，是糖蛋白（55%）、碳水化合物（25%）、脂質(zhì)（15%）和核酸（5%）構(gòu)成的復(fù)雜混合物質(zhì)，其中碳水化合物主要是α-甘露聚糖（α-Mannan）和β-1，6-葡聚糖多糖（β-1，6-glucan polysaccharide），其次是β-1，3-葡聚糖（β-1，3-glucan）［15］。生物被膜一般比浮游細(xì)胞要厚，并且抗耐藥性強(qiáng)。將生物被膜基質(zhì)視為白念珠菌生物被膜的一種胞外酶活性成分，一種既能分解分子來作為保護(hù)性反應(yīng)又能獲得營養(yǎng)來源的成分。細(xì)胞外基質(zhì)在生物被膜中處于保護(hù)白念珠菌生物被膜完整性不受損的角色，這是外來干預(yù)措施攻破生物被膜的關(guān)鍵一步。β-1，3-葡聚糖是白念珠菌細(xì)胞外基質(zhì)中的一種重要多糖，它利用自身的特殊性能在唑類藥物恢復(fù)力中起主要作用［16］，而β-1，3-葡聚糖酶具有抗生物被膜活性，它可以降解白念珠菌生物被膜的中β-1，3-葡聚糖，因此β-1，3-葡聚糖酶可能是一種有用的抗生物被膜劑［17，18］。

1.4 生物被膜群體效應(yīng) 群體效應(yīng)（Quorumsensing，QS）是一種微生物通訊機(jī)制，其信號分子的積累使細(xì)胞能夠感知細(xì)胞密度，是生物被膜形成的基礎(chǔ)。白念珠菌中發(fā)現(xiàn)的真菌群體效應(yīng)信號分子包括法尼醇（Farnesol））和酪醇（Tyrosol）［19，20］。法尼醇是白念珠菌中甾醇生物合成的前體，是目前研究最多的群體效應(yīng)信號分子，它能抑制白念珠菌從酵母向菌絲形式轉(zhuǎn)化，還能影響生物被膜細(xì)胞粘附、成熟發(fā)育以及內(nèi)部的結(jié)構(gòu)［21］。之前研究通過XTT 細(xì)胞活性測定法檢測法尼醇對生物被膜的作用，發(fā)現(xiàn)在37.5—600μm 濃度范圍內(nèi)，法尼醇對白念珠菌生物被膜具有濃度、時間及種類依賴性的抑制作用［22-24］。作用僅次于法尼醇的群體效應(yīng)信號分子是酪醇，它不僅促進(jìn)菌管的形成，還促成白念珠菌從酵母形式向菌絲形式的轉(zhuǎn)化［25］，酪醇在生物被膜形成早期和中期階段的作用最顯著。如果利用酪醇和法尼醇的各自特性結(jié)合，可能針對抗白念珠菌的治療有一定幫助。因法尼醇是甾醇生物合成的前體，所以白念珠菌生物被膜中的法尼醇暴露后，會導(dǎo)致麥角甾醇（Ergosterol）生物合成基因的下調(diào)，因此法尼醇可通過影響麥角甾醇生物合成中的部分基因表達(dá)來抑制生物被膜介導(dǎo)的耐藥性［26］。在未來的研究中，可以嘗試用法尼醇作為減少白念珠菌生物被膜的替代劑。

2 生物被膜耐藥機(jī)制

白念珠菌耐藥因素很多，生物被膜耐藥是主要原因之一。白念珠菌生物被膜比浮游細(xì)胞更具抗性，對抗真菌藥物不敏感，從而產(chǎn)生臨床耐藥性。生物被膜耐藥性形成機(jī)制復(fù)雜，其中主要機(jī)制包括：藥物外排泵的表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)保護(hù)作用及生物被膜中存在“持久性”細(xì)胞［10］。外排泵是存在細(xì)胞質(zhì)膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，一般在生物被膜中就有表達(dá)，主要對唑類藥物分子進(jìn)行排泄，當(dāng)使用氟康唑后，外排泵表達(dá)更明顯，不斷將藥物分子從細(xì)胞內(nèi)部輸送到細(xì)胞外，這樣就降低了作用部位的藥物濃度。持留細(xì)胞（Persister cells）是代謝活性降低的非分裂細(xì)胞，它們不僅對抗菌藥物具有高度耐藥性，也可能在藥物治療后播種新的生物被膜感染。生物被膜在成熟階段會釋放出大量的細(xì)胞外基質(zhì)，它就像一層保護(hù)膜，可以作為物理屏障阻擋抗真菌藥物的滲入，并保護(hù)和維持生物被膜的完整性。

3 抗白念珠菌生物被膜藥物研究進(jìn)展

目前有4類藥物被廣泛用于抗真菌：唑類衍生物、多烯、棘白菌素和核苷類似物。氟康唑具有抗真菌譜廣、毒性低、生物利用度高等特點，被廣泛用于白念珠菌感染的臨床治療。麥角甾醇作為白念珠菌生物被膜的組成成分，是發(fā)揮毒力的重要結(jié)構(gòu)，使用氟康唑能抑制麥角甾醇合成。因為氟康唑是抑菌劑，且對于細(xì)胞膜的滲透性比較差，不僅影響藥物濃度，還易引起耐藥，所以現(xiàn)在非抗真菌藥物與抗真菌藥物的協(xié)同治療逐漸引起大家的關(guān)注，這里主要描述氟康唑耐藥時的協(xié)同治療。

布洛芬是常見的非甾體抗炎藥（NSAID），多用于緩解急性疼痛和發(fā)熱［27］。非甾體抗炎藥可以通過花生四烯酸途徑，減少前列腺素E2 的產(chǎn)生，限制致病真菌的毒力，并減少生物被膜形成［28］。研究發(fā)現(xiàn)，布洛芬能在體內(nèi)增強(qiáng)氟康唑的抗真菌活性并降低白念珠菌的毒力，破壞真菌生物被膜［29］。不僅如此，布洛芬還是生物被膜外排泵阻滯劑，能夠防止唑類藥物從細(xì)胞內(nèi)排出。布洛芬與唑類藥物的協(xié)同作用使抗真菌敏感性增加的原因可能是細(xì)胞內(nèi)真菌藥物濃度增加，逆轉(zhuǎn)了生物被膜的耐藥［30］。氯尼達(dá)明（Lonidamine，LND）是一種非常規(guī)的抗腫瘤藥物，可通過抑制糖酵解途徑干擾癌細(xì)胞的能量代謝。Chen等人［31］通過使用氯尼達(dá)明與氟康唑聯(lián)合作用對耐藥性浮游白念珠菌和預(yù)形成的生物被膜進(jìn)行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)氯尼達(dá)明和氟康唑協(xié)同作用下對早期（4h 與8h內(nèi)）新形成的生物被膜有較強(qiáng)的抑制作用；當(dāng)12h 后，對生物被膜幾乎無協(xié)同作用。這就提示氯尼達(dá)明和氟康唑的協(xié)同作用可以對生物被膜的產(chǎn)生有一定的抑制作用，但這僅適用于早期未成熟的生物被膜，對晚期已成熟生物被膜作用有限或幾乎無作用。

4 結(jié)論與展望

白念珠菌的致病性主要取決于生物被膜，形成生物被膜的能力是一個極其復(fù)雜的過程，因此使白念珠菌相關(guān)感染的治療變得復(fù)雜。生物被膜形成、抗真菌藥物特性和多種微生物內(nèi)的相互作用一直是白念珠菌生物被膜持續(xù)研究的熱點，目前仍有許多機(jī)制等待著我們繼續(xù)探索。今后我們應(yīng)在注重真菌共生與感染之間平衡的同時，利用現(xiàn)有的知識去發(fā)現(xiàn)更多對抗白念珠菌感染的方法及研究生物被膜形成機(jī)制。