奇異南星揮發(fā)油通過miR-762/NF2軸對甲狀腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

張慧 閆旺 孫明華

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,占每年診斷出的癌癥的3.4%[1],大多數(shù)患者可通過甲狀腺癌根治術(shù)和頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)治愈,但是,在手術(shù)后仍有15%～30%患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2],患有頑固性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌患者預(yù)后較差[3],因此探索甲狀腺癌發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制對于患者綜合治療具有重要意義。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類進(jìn)化保守、長約22個核苷酸的非編碼小RNA,可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化及腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)行為[4]。研究發(fā)現(xiàn),miR-762在乳腺癌細(xì)胞系及臨床乳腺癌組織中高表達(dá),可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲,表明其可能參與癌癥發(fā)展[5]。2型神經(jīng)纖維瘤(Neurofibromatosis type 2,NF2)基因是一種新型抑癌基因,可編碼Merlin蛋白,據(jù)報(bào)道NF2/Merlin可抑制乳頭狀甲狀腺癌轉(zhuǎn)移[6],miRNAs可通過靶向調(diào)控NF2基因表達(dá)參與多種生物學(xué)進(jìn)程,但miR-762是否可靶向調(diào)控NF2基因表達(dá)參與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,尚需研究證實(shí)。奇異南星揮發(fā)油(Arisaema decipiens volatile oil,ADVO)為天南星科天南星屬植物萃取物,對肺癌、肝癌和乳腺癌等細(xì)胞株具有生長抑制作用[7]。本研究擬通過體外培養(yǎng)人甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1,探究ADVO對TPC-1細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及可能的作用機(jī)制,以期為ADVO臨床應(yīng)用于甲狀腺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 TPC-1(人甲狀腺癌細(xì)胞)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 奇異南星全株(經(jīng)鑒定為天南星屬植物奇異南星)購自廣西容縣;AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技公司;Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司;Invitrogen Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;miR-762 mimics、miR-762 mimics NC購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司;NF2/Merlin、兔抗yes相關(guān)蛋白1(Yes associated protein 1,YAP1)、裂解半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved cysteine protease-3,C-caspase-3)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)抗體及山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司;兔抗YAP1(phospho Ser127)多克隆抗體購自武漢艾美捷生物科技有限公司;RT-qPCR試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ADVO制備 參考文獻(xiàn)[7],采用同時蒸餾萃取技術(shù),以二氯甲烷為溶劑從奇異南星根莖中提取出ADVO 0.326 g。利用RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)分別制成15、30、60、120 μg/mL條件培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 利用RPMI 1640完全培養(yǎng)液復(fù)蘇TPC-1細(xì)胞,于37℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞增殖至85%左右時進(jìn)行傳代,傳2～3代后備用。

1.2.3 CCK-8法檢測不同濃度ADVO對細(xì)胞存活率的影響 取對數(shù)期TPC-1細(xì)胞,以1×105個/mL密度接種100 μL細(xì)胞懸液于96孔板,利用RPMI 1640完全培養(yǎng)液(ADVO 0 μg/mL)、15、30、60、120 μg/mL ADVO條件培養(yǎng)液培養(yǎng),各濃度均設(shè)置5個復(fù)孔,48 h后直接于各孔加入10 μL CCK-8試劑,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2 h,測定450 nm處各孔吸光度(OD)值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%(此處對照組為0 μg/mL ADVO培養(yǎng)的細(xì)胞)。

1.2.4 過表達(dá)miR-762對細(xì)胞存活率的影響 經(jīng)ADVO濃度梯度篩選,60 μg/mL ADVO作用下可降低約50%的細(xì)胞存活率;接種1×105個細(xì)胞于6孔板內(nèi),利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將miR-762 mimics NC、miR-762 mimics分別轉(zhuǎn)染至匯合約50%的TPC-1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染過夜并收集細(xì)胞。將TPC-1細(xì)胞分為空白組(含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng))、ADVO組(60 μg/mL)、miR-762 mimics組(轉(zhuǎn)染miR-762 mimics)、miR-762 mimics NC組(轉(zhuǎn)染miR-762 mimics NC)、ADVO+miR-762 mimics組(60 μg/mL ADVO+轉(zhuǎn)染miR-762 mimics)和ADVO+miR-762 mimics NC組(60 μg/mL ADVO+轉(zhuǎn)染miR-762 mimics NC),對應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,CCK-8法檢測各組細(xì)胞存活率。以下實(shí)驗(yàn)均按此分組進(jìn)行。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移及侵襲的影響情況 轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞并重懸于不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,以每孔5×104個細(xì)胞密度接種于上室,下室加入200 μL完全培養(yǎng)基,48 h后棄去培養(yǎng)液,棉簽拭去小室表面細(xì)胞,膜下表面侵入細(xì)胞利用1%多聚甲醛固定,室溫下結(jié)晶紫染色,待Transwell 6孔板干燥后,400倍鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲檢測方法同細(xì)胞遷移,除了Transwell上室提前涂布有Matrigel基質(zhì)膠。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,PBS洗滌沉淀2次,將細(xì)胞以1×106個/mL重懸并加入Annexin V-FITC和PI雙重染色,室溫避光孵育15 min,然后將100 μL細(xì)胞懸液與400 μL結(jié)合緩沖液混合,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,重復(fù)3次。

1.2.7 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 利用Targetscan網(wǎng)站預(yù)測NF2基因與miR-762的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region,3′UTR)之間的潛在結(jié)合位點(diǎn)。使用Lipofectamine2000將TPC-1細(xì)胞與miR-762 mimics、mimics NC分別與NF2基因野生型(Wild type,WT)或突變型(Mutant,MUT)熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染,48 h后,裂解細(xì)胞,12 000 r/min,4℃離心10 min,收集上清,以海腎熒光素酶為內(nèi)部對照,檢測熒光素酶活性。報(bào)告基因相對活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.8 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測miR-762及NF2 mRNA相對表達(dá)水平 利用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit分離和純化總RNA。制備RT-qPCR反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 30 s 40個循環(huán)、72℃ 60 s。以GAPDH和U6分別作為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列如下并送至華大基因合成(表1)。

表1 PCR引物

1.2.9 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測蛋白表達(dá)情況 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后胰酶消化、收集并洗滌細(xì)胞,用預(yù)冷RIPA裂解液裂解,4℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清。測定蛋白濃度后加熱變性,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后濕轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜,洗膜3次,每次10 min,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,Merlin、YAP1、p-YAP1、C-caspase-3、E-cadherin、Vimentin一抗(均1∶1 000稀釋)于4℃孵育過夜,洗膜,IgG二抗(1∶8 000稀釋)室溫孵育2 h,洗膜,ECL發(fā)光液顯色,并用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照記錄。Image J軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ADVO作用下TPC-1細(xì)胞存活率

TPC-1細(xì)胞存活率隨ADVO作用濃度增大而降低(P<0.001),60 μg/mL ADVO作用濃度下的細(xì)胞存活率接近50%(圖1)。

圖1 不同濃度ADVO下的TPC-1細(xì)胞存活率比較Figure 1 The viability of TPC-1 cells treated with different concentrations of ADVONote:***P<0.001,when compared with the negative control group(0 μg/mL).

2.2 各組TPC-1細(xì)胞增殖情況

與空白組比較,miR-762 mimics組細(xì)胞存活率升高(P<0.001),ADVO組細(xì)胞存活率下降(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細(xì)胞存活率升高(P<0.001)(圖2)。

圖2 各組TPC-1細(xì)胞存活率比較Figure 2 The viability of TPC-1 cells treated with ADVO,miR-762 mimics or their combinationNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

2.3 各組TPC-1細(xì)胞凋亡情況

與空白組比較,miR-762 mimics組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.001),ADVO組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.001)(圖3,圖4)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組TPC-1細(xì)胞凋亡情況Figure 3 The apoptotic rates of were detected in TPC-1 cells by flow cytometry

圖4 各組TPC-1細(xì)胞凋亡率比較Figure 4 The comparison of apoptotic rates in TPC-1 cells treated with ADVO,miR-762 mimics,NC or their combinationNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

2.4 各組TPC-1細(xì)胞侵襲及遷移情況

與空白組比較,miR-762 mimics組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)增加(P<0.001),ADVO組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)減少(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)增加(P<0.001)(圖5,圖6)。

圖5 各組TPC-1細(xì)胞侵襲及遷移情況(400×)Figure 5 The invasion and migration of TPC-1 cells treated with ADVO,miR-762 mimics or their combination(400×)

圖6 各組TPC-1細(xì)胞侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)比較Figure 6 The cellular number of migration and invasion in TPC-1 cells treated with ADVO,miR-762 mimics or their combinationNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

2.5 miR-762與NF2基因的靶向關(guān)系

經(jīng)生物信息學(xué)分析,NF2基因被預(yù)測為miR-762的潛在靶基因(圖7)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,與mimics NC組比較,miR-762 mimics共轉(zhuǎn)染NF2-WT組的熒光相對活性顯著降低(P<0.001),而共轉(zhuǎn)染NF2-MUT組的熒光相對活性無顯著性變化(P>0.05)(圖8)。

圖7 TargetScan靶基因預(yù)測結(jié)果Figure 7 The prediction results of target gene by TargetScan

圖8 各組細(xì)胞熒光素酶活性相對變化Figure 8 Relative changes of luciferase activity in each groupNote:***P<0.001,when compared with the mimics NC group.

2.6 各組TPC-1細(xì)胞miR-762與NF2 mRNA相對表達(dá)情況

與空白組比較,miR-762 mimics組細(xì)胞miR-762相對表達(dá)水平升高、NF2 mRNA相對表達(dá)水平降低(P<0.001),ADVO組miR-762相對表達(dá)水平降低、NF2 mRNA相對表達(dá)水平升高(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細(xì)胞miR-762相對表達(dá)水平升高、NF2 mRNA相對表達(dá)水平降低(P<0.001)(圖9)。

圖9 各組TPC-1細(xì)胞中miR-762及NF2 mRNA相對表達(dá)水平比較Figure 9 The relative expression of miR-762 and NF2 mRNA in TPC-1 cells in each groupNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

2.7 各組TPC-1細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)情況

與空白組相比,miR-762 mimics組細(xì)胞Merlin、p-YAP1、C-caspase-3和E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平降低,YAP1、Vimentin蛋白相對表達(dá)水平升高(P<0.001),ADVO組細(xì)胞Merlin、p-YAP1、C-caspase-3和E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平升高,YAP1、Vimentin蛋白相對表達(dá)水平降低(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細(xì)胞Merlin、p-YAP1、C-caspase-3和E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平降低,YAP1、Vimentin蛋白相對表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖10,圖11)。

圖10 各組TPC-1細(xì)胞中相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平Figure 10 The expression of merlin,YAP1,p-YAP1,C-caspase-3,E-cadherin and vimentin proteins in TPC-1 cells in each groupNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

圖11 各組TPC-1細(xì)胞中蛋白表達(dá)量Figure 11 The expression of merlin,YAP1,p-YAP1,C-caspase-3,E-cadherin and vimentin proteins in TPC-1 cells in each groupNote:A.The blank group;B.The miR-762 mimics NC group;C.The ADVO group;D.The ADVO+miR-762 mimics NC group;E.The ADVO+miR-762 mimics group;F.The miR-762 mimics group.

3 討論

甲狀腺癌具有廣泛異質(zhì)性,大多數(shù)起源于甲狀腺濾泡細(xì)胞,可細(xì)分為高分化乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)和濾泡狀甲狀腺癌,PTC是最常見的甲狀腺癌(約90%),其侵襲性亞型與多灶性、局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[8]。許多miRNAs在癌癥(包括甲狀腺癌)中異常表達(dá),積極探索調(diào)節(jié)甲狀腺癌進(jìn)展的miRNA,探討其分子機(jī)制并進(jìn)行干預(yù),對于甲狀腺癌早期診斷、治療及預(yù)后具有積極意義。

細(xì)胞增殖、侵襲和遷移被認(rèn)為是癌細(xì)胞惡性行為的最重要生物學(xué)特征。在惡性行為背景下,研究發(fā)現(xiàn)miR-762表達(dá)在肌肉浸潤性膀胱癌和卵巢癌中顯著上調(diào),并可顯著提高癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力[9-10]。ADVO中含有大量脂肪酸,這些成分可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移并降低患癌風(fēng)險(xiǎn)[7,11]。本研究結(jié)果顯示,miR-762及AVDO對TPC-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為起不同作用,miR-762過表達(dá)時,可顯著促進(jìn)TPC-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并抑制其凋亡,AVDO單獨(dú)作用時,與其效果相反,且ADVO作用于過表達(dá)miR-762組細(xì)胞時,可顯著減弱miR-762的促癌作用,提示AVDO可能通過降低miR-762表達(dá)發(fā)揮抑制甲狀腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用。與經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子相比,miRNA通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用,本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-762靶基因并進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)miR-762可直接與NF2基因的3′-UTR作用并抑制NF2表達(dá),提示NF2為miR-762的潛在靶基因。NF2是一種編碼Merlin蛋白的基因,能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程,并作為一種腫瘤抑制基因,與多種人類癌癥有關(guān)[12]。多項(xiàng)研究表明,NF2基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用,Garcia等[13]證明,NF2/Merlin失活可導(dǎo)致低分化甲狀腺癌病理進(jìn)展;You等[14]研究結(jié)果顯示,NF2過表達(dá)時,可顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,在右側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC中,NF2 mRNA表達(dá)較低。本研究發(fā)現(xiàn),未處理的癌細(xì)胞中,miR-762表達(dá)水平較高,NF2 mRNA相對表達(dá)水平較低,過表達(dá)miR-762后,NF2 mRNA相對表達(dá)水平顯著降低,但ADVO可通過降低miR-762表達(dá)逆轉(zhuǎn)此情況,提示ADVO可能通過降低癌細(xì)胞內(nèi)miR-762表達(dá),上調(diào)其靶基因NF2水平進(jìn)而發(fā)揮抗PTC-1細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用。

Merlin主要通過激活Hippo通路來調(diào)節(jié)生長控制[15]。Hippo通路的核心是蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng),YAP為該級聯(lián)中的效應(yīng)蛋白,且僅在通路不活躍時定位于細(xì)胞核,進(jìn)而控制細(xì)胞分化、組織生長、促增殖和抗凋亡基因表達(dá);Hippo通路被激活時,YAP被磷酸化為p-YAP,p-YAP不能進(jìn)入細(xì)胞核并滯留于胞質(zhì)內(nèi)被降解、失活,Merlin為YAP滅活劑[16]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)是一種上皮細(xì)胞向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞過程,此過程中,上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型,包括高遷移和侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力,同時Vimentin表達(dá)上調(diào),E-cadherin表達(dá)下調(diào)[17]。Lai等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-762表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)結(jié)腸癌增殖、侵襲及EMT;Zheng等[19]研究證明,Hippo信號通路可調(diào)節(jié)EMT以促進(jìn)甲狀腺癌發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移,這與p-YAP增加和YAP表達(dá)降低有關(guān)[20]。Caspase-3為細(xì)胞凋亡途徑的下游主要效應(yīng)蛋白酶,其裂解提示細(xì)胞凋亡程序的激活,本研究結(jié)果顯示,miR-762過表達(dá)后,Merlin、p-YAP1、C-caspase-3及E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著降低,YAP1及Vimentin蛋白表達(dá)顯著上調(diào),經(jīng)ADVO作用后,可逆轉(zhuǎn)此情況,且ADVO作用于過表達(dá)miR-762組細(xì)胞時,可減弱miR-762效果,提示ADVO可能通過抑制miR-762表達(dá),上調(diào)抑癌蛋白Merlin水平從而激活Hippo-YAP信號通路,降低YAP核內(nèi)表達(dá),進(jìn)而抑制下游抗凋亡、促增殖及EMT等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄以發(fā)揮抑制PTC-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲并促進(jìn)其凋亡作用。

綜上所述,ADVO可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)miR-762/NF2軸激活抑癌相關(guān)信號有關(guān)。但本研究僅在細(xì)胞水平上進(jìn)行了探究,關(guān)于ADVO在動物水平上對腫瘤形成、發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制仍待進(jìn)一步論證。