基于生物信息學方法分析FAM20A在甲狀腺癌中的診斷價值

吳南楠 尹瑞梨 孫榮欣 趙冬

甲狀腺癌是內分泌系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一,且發(fā)病率正迅速增加[1]。來自美國的一項研究顯示晚期甲狀腺癌的診斷有所增加,與總死亡率的緩慢增長相一致[2],故甲狀腺癌的早期診治對預后影響至關重要。積極探索甲狀腺癌新的生物標志物是推動早期診斷和開發(fā)新的治療策略的方法之一。目前關于甲狀腺癌的具體發(fā)病機制尚未完全清楚,序列相似性20家族成員A(Family with sequence similarity 20 member A,FAM20A),作為一種分泌蛋白,已經被報道參與肝癌、甲狀旁腺癌的發(fā)生發(fā)展[3-5],但其在甲狀腺癌中的表達及與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展目前仍不明確。本研究利用TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫,聯(lián)合臨床樣本,探索FAM20A在甲狀腺癌中的表達及臨床診斷意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(http://tcgadata.nci.nih.gov/),獲取甲狀腺癌相關數(shù)據(jù),包括甲狀腺癌組織樣本512例,正常甲狀腺組織樣本59例,整理TCGA-THCA(甲狀腺癌)項目STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù)并提取TPM格式的數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。通過甲狀腺癌組織樣本(n=59)配對正常組織樣本(n=59)分析FAM20A mRNA表達。另外,對512例甲狀腺癌組織樣本通過R 3.6.3軟件整理基因表達數(shù)據(jù),以FAM20A mRNA表達量中位值為界,分為高表達組和低表達組。數(shù)據(jù)過濾策略:去除無臨床信息;數(shù)據(jù)處理方法:log2(value+1)。提取對應編號配對的癌旁和癌樣本進行配對t檢驗。搜索GEO數(shù)據(jù)庫,GSE205733檢測平臺為Illumina HiSeq 4000,包括正常甲狀腺組織4例,甲狀腺癌4例。應用R(3.6.3版本)軟件包處理下載的文件,對數(shù)據(jù)進行校準、標準化和log2變換。收集2022年3月—2023年2月期間于首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院甲狀腺外科行甲狀腺結節(jié)手術治療且知情同意該項目的29例患者病理組織樣本,其中包括17例甲狀腺癌(實驗組),12例良性甲狀腺結節(jié)(對照組)。本研究得到了首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院倫理委員會的批準,批號:2023-LHKY-045-02。

1.2 GSEA富集分析

GSEA用來評估一個預先定義的基因集的基因在與表型相關度排序的基因表中的分布趨勢,從而判斷其對表型的貢獻。根據(jù)GSE205733數(shù)據(jù)集篩選出的正常甲狀腺組和甲狀腺癌組,根據(jù)基因風險進行評分,并與KEGG的基因集進行比對,對影響甲狀腺癌的可能的作用機制進行探索。

1.3 免疫組織化學染色

應用免疫組化試劑盒(KIT-9710,邁新試劑),首先將石蠟切片置于60℃烤箱中烤片3 h,二甲苯脫蠟入水后,加入檸檬酸抗原修復液中進行熱修復,使用內源性過氧化物酶阻斷劑室溫靜置孵育10 min,PBS洗3次,每次3 min;滴加非特異性染色阻劑或阻斷劑封閉液室溫孵育20 min,FAM20A多克隆抗體(25258-1-AP,Affinity)按照1∶200稀釋,直接滴加到組織上,4℃冰箱孵育過夜;次日,PBS洗3次,每次3 min,滴加生物素標記的二抗,室溫孵育10 min;PBS洗3次,每次3 min;滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶,PBS洗3次,每次3 min。室溫下用顯色劑DAB(PR30010,Proteintech)顯色2 min后用自來水沖洗1 min;蘇木素復染,梯度乙醇脫水入二甲苯,封片。使用奧林巴斯顯微鏡拍攝圖像。采用Image J軟件評估染色區(qū)域的面積百分比。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用R 3.6.3軟件、Image J軟件和GraphPad Prism 9.5軟件繪圖,計數(shù)資料以頻數(shù)(百分數(shù))表示,組間比較采用χ2檢驗;兩獨立樣本計量資料,符合正態(tài)分布采用獨立樣本t檢驗,不符合正態(tài)分布采用Wilcoxon秩和檢驗。甲狀腺癌組和正常甲狀腺組的比較采用配對t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FAM20A在甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中的表達

TCGA數(shù)據(jù)庫獲得FAM20A在512例甲狀腺癌組織和59例正常甲狀腺組織中的表達數(shù)據(jù),結果顯示,與正常甲狀腺組織相比,FAM20A表達在甲狀腺癌中顯著升高(P<0.001)(圖1A);配對分析結果顯示FAM20A在甲狀腺癌中顯著升高(P<0.001)(圖1B)。

圖1 甲狀腺癌組織和正常組織中的FAM20A的表達水平及配對分析Figure 1 The expression of FAM20A in TC and normal tissuesNote:***P<0.001,when compared with the normal group.

利用GSE205733數(shù)據(jù)集,根據(jù)表達譜芯片信息提供的FAM20A mRNA表達進行分析,結果顯示甲狀腺癌組織中FAM20A表達明顯高于正常甲狀腺組織(P<0.001)(圖2)。

圖2 FAM20A在正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織中的表達差異Figure 2 The expression differences of FAM20A in TC and normal tissues Note:**P<0.01,when compared with the normal group.

2.2 FAM20A的差異表達與患者臨床特征之間的關系

根據(jù)FAM20A表達量中位值,將甲狀腺癌患者分為高表達組和低表達組,比較兩組患者的臨床特征。結果顯示,兩組病理T分期、N分期和病理類型差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。這些結果提示,FAM20A與臨床病例T分期、N分期和病理類型相關。

表1 甲狀腺癌患者FAM20A高表達組和低表達組臨床特征比較[n(%)]

2.3 FAM20A對甲狀腺癌的診斷價值

利用TCGA數(shù)據(jù)集,ROC曲線分析結果顯示,FAM20A表達對甲狀腺癌具有較高的診斷價值(AUC=0.828,P<0.05)(圖3)。

圖3 FAM20A在甲狀腺癌的ROC曲線分析Figure 3 The ROC curve of FAM20A in TC

2.4 GSE205733富集分析及FAM20A的相互作用蛋白

根據(jù)GSE205733數(shù)據(jù)集中篩選出的包括FAM20A的所有差異基因進行GSEA分析,結果顯示以下信號通路參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展,其中包括細胞周期有絲分裂、嗜中性粒細胞脫顆粒、通過白介素傳遞信號白介素4和白介素13信號、細胞通訊、P53下游通路、細胞連接組織、非整合素膜Ecm相互作用、Tap63通路、甲狀腺素生物合成等(圖4A)。STRING數(shù)據(jù)庫的結果分析顯示,10個與FAM20A相互作用的蛋白分別有PEAK1、FAM198A、FJX1、FAM198B、FAM20C、FAM83H、SGK223、AMBN、ENAM、WDR72(圖4B)。

圖4 GSEA分析以及FAM20A的相互作用蛋白Figure 4 GSEA analysis and interacting proteins of FAM20A

2.5 甲狀腺癌與良性甲狀腺結節(jié)組織FAM20A免疫組化染色結果

17例甲狀腺癌和12例良性甲狀腺結節(jié)對照組織進行免疫組化染色,結果顯示與良性甲狀腺結節(jié)組相比,FAM20A在甲狀腺癌中的表達顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖5)。

圖5 FAM20A在甲狀腺癌和良性甲狀腺結節(jié)中的免疫組化染色及陽性面積統(tǒng)計分析Figure 5 Immunohistochemical staining and statistical analysis of FAM20A positive area in TC and benign thyroid nodules Note:**P<0.01,when compared with benign thyroid nodules.

3 討論

根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計,全球每年發(fā)生58.6萬例甲狀腺癌,且發(fā)病率呈上升趨勢[6-7]。甲狀腺癌目前通過超聲及針吸活檢診斷,然而,甲狀腺活檢在細胞學上不確定的比例高達25%[8]。故對甲狀腺活檢結果不確定的患者積極進行分子標記物評估可協(xié)助明確甲狀腺癌的風險和管理策略[9]。探索甲狀腺癌關鍵分子標志物有助于早期診斷、預后評估和復發(fā)監(jiān)測,降低侵入性手術帶來的危害。FAM20A蛋白最初是從造血細胞中鑒定出來的,目前被報道參與肝癌、甲狀旁腺癌的發(fā)生發(fā)展[3-5]。但關于FAM20A是否參與甲狀腺癌的發(fā)生目前仍不明確。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)FAM20A在甲狀腺癌中顯著升高,且ROC曲線分析結果提示FAM20A對甲狀腺癌具有較高的診斷價值。為了進一步探索甲狀腺癌組織中FAM20A表達的差異,對GEO數(shù)據(jù)庫GSE205733數(shù)據(jù)集信息分析結果提示甲狀腺癌組織中FAM20A表達高于正常甲狀腺組織樣本。最后,通過甲狀腺癌及良性甲狀腺結節(jié)組織臨床樣本進行免疫組化染色,也證實FAM20A在甲狀腺癌中的高表達。本研究結果提示FAM20A可作為診斷甲狀腺癌的潛在分子標記物。

FAM20A屬于FAM20家族之一,FAM20A最早是在牙釉質發(fā)育不全的疾病中被鑒定出來的,是一種假激酶[3],通過非催化機制的信號傳遞發(fā)揮功能[10]。假激酶的突變和表達失調與很多疾病發(fā)生發(fā)展相關,如癌癥、神經系統(tǒng)疾病、代謝性疾病和自身免疫性疾病等[10-11]。另外,FAM20A是一種分泌蛋白[12],能夠釋放到血液循環(huán)中在生理、病理系統(tǒng)中起著重要作用。我們對包含F(xiàn)AM20A等的差異基因進行GSEA富集分析,結果顯示主要富集在細胞周期有絲分裂、嗜中性粒細胞脫顆粒、通過白介素傳遞信號白介素4和白介素13信號、細胞通訊、P53下游通路、細胞連接組織、非整合素膜Ecm相互作用、Tap63通路、甲狀腺素生物合成等通路上。目前研究提示多種惡性腫瘤發(fā)生過程與p53信號通路的失調基因相關[13-15],p53信號通路是一個復雜的細胞應激反應網絡,具有多種不同的輸入和下游輸出,與其作為腫瘤抑制通路的作用相關,p53發(fā)揮作用的生物學過程是參與細胞周期阻滯、衰老、DNA修復和細胞凋亡[16]。這提示今后研究中進一步深入探索FAM20A是否通過p53信號通路調控甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,FAM20A有望成為甲狀腺癌的一種新的診斷性生物標志物,且FAM20A可能成為潛在的治療靶點。鑒于FAM20A是一種分泌蛋白[12],在今后的研究中,將進一步探索FAM20A在血液循環(huán)中的表達水平,評估其對診斷、治療的價值,為甲狀腺癌診療提供新的分子機制。