溫度對紅色紅曲菌M7液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)monascin和ankaflavin的影響

徐勇,邱子婭,陳莎,2,張佳蘭,高夢祥,2,李利,2

(1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025;2.長江大學(xué) 食品研究院,湖北 荊州 434025;3.長江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

紅曲色素是紅曲菌(Monascusspp.)發(fā)酵產(chǎn)生的天然食用色素,從顏色上分為紅色素(λmax=490～530 nm)、橙色素(λmax=460～480 nm)和黃色素(λmax=330～450 nm)3大類[1-2].目前,國內(nèi)外大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的僅有紅曲紅色素,可直接或改性后作為食品著色劑,用于臘肉制品、熟肉制品、調(diào)制乳、果醬、糖果、糕點等食品中,而紅曲橙色素和黃色素這2類天然色素,產(chǎn)量偏低,尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[3-4].

目前已報道的紅曲黃色素至少包括49種不同結(jié)構(gòu)的化合物,根據(jù)溶解性分為醇溶性和水溶性2類,其中紅曲素(monascin, MS)和紅曲黃素(ankaflavin, AF)是最為常見的2種醇溶性紅曲黃色素組分[1,5-6].MS和AF色澤鮮亮醒目,具有較好的pH穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性[7],是一種優(yōu)良的微生物來源的天然黃色素.近年來,MS和AF的生物活性成為紅曲色素的研究熱點,被報道的生物活性包括抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤、降血壓、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)免疫功能、預(yù)防阿爾茨海默癥等[5-6,8-10].由此可見,MS和AF不僅在食品著色方面極具開發(fā)價值,而且在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域也具有很好的應(yīng)用前景.

選育紅曲黃色素高產(chǎn)菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件是提高紅曲黃色素產(chǎn)量的有效手段[6,11-16].但紅曲黃色素種類較多,成分復(fù)雜,而且缺少商品化的標(biāo)準(zhǔn)品[3],所以相關(guān)研究很少對發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲黃色素組分分別進(jìn)行定性和定量分析,大多根據(jù)410 nm(黃色素的特征吸收峰)的吸光值來測定黃色素的色價.因而,對于發(fā)酵過程中不同紅曲黃色素組分的影響因素和變化規(guī)律,目前還缺乏系統(tǒng)性認(rèn)識.

溫度是影響微生物生長和代謝的重要環(huán)境因素.紅曲菌是一種典型的中溫型絲狀真菌,其培養(yǎng)與發(fā)酵多采用25～30 ℃[17].然而,隨著發(fā)酵菌株和發(fā)酵條件的不同,所產(chǎn)生的紅曲色素組分存在差異,最佳發(fā)酵溫度會發(fā)生變化.在水溶性紅曲黃色素方面,Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn),溫度對紅色紅曲菌(M.ruber)CGMCC 10910液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的4種水溶性紅曲黃色素組分有不同的影響,其中只有1種水溶性黃色素組分的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃,而其他3種的最佳發(fā)酵溫度均較高,為35 ℃.在醇溶性紅曲黃色素方面,Yongsmith等[11]發(fā)現(xiàn),40 ℃條件下紫色紅曲菌(M.purpureus)LPB 97固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的醇溶性紅曲黃色素的色價顯著高于30 ℃,而況嘉鈾等[12]發(fā)現(xiàn),紅曲菌GN液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的醇溶性紅曲黃色素的色價隨著溫度的升高先升高后降低,最佳溫度與Yongsmith等[11]的報道差異較大,為22.5 ℃.可見,降低或提高發(fā)酵溫度,能促進(jìn)某些紅曲黃色素組分的生物合成.目前,溫度對MS和AF液態(tài)發(fā)酵的影響鮮見報道.本研究以紅色紅曲菌M7為實驗菌株,利用紫外-可見吸收光譜法、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等方法,研究溫度對MS和AF液態(tài)發(fā)酵的影響,并從紅曲色素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的變化探討其機(jī)制,為提高M(jìn)S和AF液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

紅色紅曲菌(M.ruber)M7：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗保藏中心(Culture Collection of State Key Laboratory of Agricultural Microbiology)保藏,編號為CCAM070120.

葡萄糖、NaNO3、K2HPO4、KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、(NH4)2SO4、CaCl2、蔗糖、甲酸、無水乙醇：分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酵母膏、蛋白胨、瓊脂：生化試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;乙腈：色譜純,美國天地有限公司;總RNA提取試劑盒(Trizol法)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript II Q RT SuperMix)、實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)： 南京諾唯贊生物科技股份有限公司;紅曲素(MS)、紅曲黃素(AF)、紅曲紅素(monascorubrin, MR)：上海源葉生物科技有限公司;紅斑素(rubropunctatin, RP)：美國MCE生物科技公司.

孢子培養(yǎng)基[19]：NaNO33 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、酵母膏5 g、蔗糖 30 g、瓊脂 15 g,加蒸餾水至1 L.用于紅色紅曲菌M7孢子的培養(yǎng).

種子培養(yǎng)基[18]：葡萄糖20 g、酵母膏3 g、蛋白胨10 g、KH2PO44 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g,加蒸餾水至1 L.用于紅曲色素液態(tài)發(fā)酵種子的培養(yǎng).

發(fā)酵培養(yǎng)基[18]：葡萄糖50 g、(NH4)2SO45 g、KH2PO45 g、CaCl20.1 g、FeSO4·7H2O 0.01 g,加蒸餾水至1 L.用于紅曲色素的液態(tài)發(fā)酵.

培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃,20 min.

1.2 主要儀器與設(shè)備

PB-10 pH計(德國賽多利斯有限公司);SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);HFsafe-1200生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司);IS-RDS3恒溫?fù)u床(美國精騏有限公司);Beckman Allegra X-30R離心機(jī)(德國貝克曼公司);HVE-50高壓滅菌鍋(日本株式會社平山制作所);鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);TU1900紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);LC1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);TripleTOF 5600液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國 AB Sciex公司);S1000梯度PCR儀、CFX96 Touch熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲菌的液態(tài)發(fā)酵

紅色紅曲菌M7的活化和孢子制備參照Li等[19]的方法,將新鮮制備的105/mL的孢子懸液,以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入種子培養(yǎng)基中,30 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d,再以4%(體積分?jǐn)?shù))的量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,于不同溫度(25、30、35、40 ℃)下,180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d.

1.3.2 紅曲色素的提取

由于在液態(tài)發(fā)酵過程中,醇溶性紅曲色素除了存在于菌絲體細(xì)胞內(nèi),還能分泌至發(fā)酵液中結(jié)晶形成色素小顆粒[20].因此,為了提取胞內(nèi)、胞外總醇溶性紅曲色素,選用快速濾紙對發(fā)酵液進(jìn)行真空抽濾,收集菌絲體和胞外色素晶體的混合物[20],用3倍發(fā)酵液體積的蒸餾水洗滌后,將菌絲體、胞外色素晶體和附著大量色素晶體的濾紙一起放入與發(fā)酵液等體積的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液(pH=2.0)中,30 ℃,200 r/min振蕩條件下避光浸提1 h,再次真空抽濾,得到的濾液即為紅曲色素提取液,收集的菌絲于80 ℃烘箱干燥至質(zhì)量恒定后用于測定生物量.

1.3.3 紅曲色素的紫外-可見吸收光譜分析

紅曲色素提取液用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液(pH=2.0)稀釋一定倍數(shù),以1 nm的間隔在350～550 nm進(jìn)行光譜掃描.紅色素、橙色素和黃色素的色價分別用510、470、410 nm處的吸光度A計算[21],三者之和為總色價,代表紅曲色素總產(chǎn)量[22].色價/(U·mL-1)=A×稀釋倍數(shù).

1.3.4 紅曲色素的HPLC分析

紅曲色素提取液用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液(pH=2.0)稀釋一定倍數(shù),進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析.色譜柱：Inertsil ODS-3(250 mm × 4.6 mm,5 μm);柱溫：30 ℃;二極管陣列檢測器(DAD)檢測波長：210～600 nm,其中黃色素、橙色素和紅色素組分的監(jiān)測波長分別為390、470、520 nm.流動相A相為乙腈,B相為酸水(pH 3,甲酸調(diào)節(jié)),C相為去離子水,流速為 0.8 mL/min.梯度洗脫條件見表1.根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線對各紅曲色素組分的含量進(jìn)行定量.

表1 HPLC梯度洗脫條件

1.3.5 紅曲色素的LC-MS分析

樣品處理同1.3.4.色譜柱：Kinetex 2.6 μm F5(100 mm × 2.1 mm);柱溫：30 ℃;流動相：A相為酸水(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸),B相為乙腈;梯度洗脫條件：0～1 min,95%(體積分?jǐn)?shù),下同)A;1～8 min,95% A～15% A;8～9 min,15% A;9～9.1 min,15% A～95% A;9.1～11 min,95% A;流速：0.2 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL;DAD檢測波長：210～600 nm;離子源：電噴霧電離(ESI),正離子模式;掃描范圍：質(zhì)荷比(m/z) 100～1 000;電噴霧電壓：5 500 V;離子源溫度：550 ℃;霧化氣壓力379 kPa;輔助氣壓力379 kPa;氣簾氣壓力172 kPa.

1.3.6 qPCR分析

在紅色紅曲菌M7液態(tài)發(fā)酵過程中,分別于第3、5、7天收集菌絲體,液氮速凍后-80 ℃保存.采用Triozol法提取菌絲體總RNA,利用試劑盒HiScript II Q RT SuperMix合成cDNA,利用試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行qPCR,檢測各基因的表達(dá)量.qPCR反應(yīng)體系：2×qPCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL;反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸 10 s,共40個循環(huán).采用actin作為內(nèi)參基因,紅曲色素合成相關(guān)基因的qPCR引物見表2.每個實驗樣本進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù).采用2-△△Ct法計算各基因在不同樣本中的表達(dá)量.

表2 紅曲色素合成相關(guān)基因的qPCR引物

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,Origin 7.5軟件進(jìn)行繪圖.實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲色素的紫外-可見吸收光譜特征分析

在紅曲色素的發(fā)酵產(chǎn)物中,通常同時存在紅色素(λmax=490～530 nm)、橙色素(λmax=460～480 nm)和黃色素(λmax=330～450 nm).作為食用色素使用時,紅曲色素一般不需要分離純化,直接以混合物形式使用[23].因此,在紅曲色素的常規(guī)發(fā)酵生產(chǎn)及研究中,紫外-可見吸收光譜法是最常用的色素分析方法,可用于表征紅曲色素的色調(diào)和色價.紅色紅曲菌M7在不同發(fā)酵溫度下所產(chǎn)生紅曲色素的紫外-可見吸收光譜分析結(jié)果見圖1.

a.紫外-可見吸收光譜;b.色價和生物量圖1 紅色紅曲菌M7在不同發(fā)酵溫度下所產(chǎn)紅曲色素的紫外-可見吸收光譜分析Fig.1 UV-Vis spectroscopic analysis of Monascus pigments produced at different fermentation temperatures by M. ruber M7

由圖1a可知,在不同溫度條件下,紅色紅曲菌M7所產(chǎn)生的紅曲色素在350～550 nm均只有1個吸收峰,其中,在25 ℃和30 ℃時,最大吸收波長為470 nm,色調(diào)偏橙,說明在該條件下合成的橙色素較多;在35 ℃和40 ℃時,最大吸收波長分別為415 nm和388 nm,色調(diào)偏黃,說明提高發(fā)酵溫度后,黃色素的比例增大.

由圖1b可知,隨著溫度的升高,510 nm(紅色)、470 nm(橙色)和410 nm(黃色)處的色價均先升高后降低,在30 ℃時達(dá)到最大值,分別為27、46、26 U/mL;同時,生物量也在30 ℃時達(dá)到了最大值.因此,從菌絲生長和色素色價來看,紅色紅曲菌M7的最適液態(tài)發(fā)酵溫度為30 ℃,與報道的最佳紅曲色素發(fā)酵溫度一致[24-26].

2.2 紅曲色素的HPLC指紋圖譜特征分析

利用HPLC分析了紅色紅曲菌M7在不同發(fā)酵溫度下所產(chǎn)生的紅曲色素的組成成分,其HPLC指紋圖譜見圖2,各色素組分的紫外-可見吸收光譜和質(zhì)譜分別見圖3和圖4.

圓餅圖為不同色素組分的峰面積百分比圖2 紅色紅曲菌M7在不同發(fā)酵溫度下所產(chǎn)紅曲色素的HPLC圖譜Fig.2 HPLC profiles of Monascus pigments produced at different fermentation temperatures by M. ruber M7

圖3 不同色素組分的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV-Vis spectra of different pigment components

圖4 不同色素組分的質(zhì)譜Fig.4 Mass spectra of different pigment components

在25～40 ℃,紅色紅曲菌M7共產(chǎn)生8種色素組分,分別為Y1～Y4、O1～O4(圖2),其中,Y1～Y4最大吸收波長為370～390 nm(圖3),符合典型的紅曲黃色素的吸收光譜特征,準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰分別為m/z357.17、359.19、385.20和 387.22(圖4),結(jié)合文獻(xiàn)報道[1-2],推斷Y1～Y4分別為紅曲黃色素中的monasfluore A(MFA, C21H24O5)、MS(C21H26O5)、monasfluore B(MFB, C23H28O5)和AF(C23H30O5);O1～O4的最大吸收波長約為470 nm(圖3),符合典型的紅曲橙色素的吸收光譜特征,準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰分別為m/z355.15、387.18、383.18和 415.21(圖4),結(jié)合文獻(xiàn)報道[1-2],推斷O1～O4分別為紅曲橙色素中的紅斑素(RP, C21H22O5)、monasphilol-methoxy A(MMA, C22H26O6)、紅曲紅素(MR, C23H26O5)和monasphilol-methoxy B(MMB, C24H30O6).

如圖2所示,當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃和30 ℃時,共檢測到2種黃色素和4種橙色素組分,分別為MS(Y2)、AF(Y4)、RP(O1)、MMA(O2)、MR(O3)和MMB(O4),其中RP(O1)和MR(O3)的峰面積百分比較大,共約為71%(25 ℃)和79%(30 ℃),其次為MS(Y2)和AF(Y4),共約占23%(25 ℃)和14%(30 ℃);當(dāng)發(fā)酵溫度升到35 ℃時,檢測到全部的8種色素組分,峰面積百分比較大的組分除了RP(O1)和MR(O3),共約占49%,還包括MS(Y2)和AF(Y4),共約占38%;當(dāng)發(fā)酵溫度升到40 ℃時,檢測到4種黃色素和2種橙色素組分,分別為MFA(Y1)、MS(Y2)、MFB(Y3)、AF(Y4)、RP(O1)和MR(O3),峰面積百分比較大的為MS(Y2)和AF(Y4),共約占55%,其次為MFA(Y1)和MFB(Y3),共約占33%.由此可見,提高發(fā)酵溫度至35 ℃以上,有利于提高紅曲色素產(chǎn)物中黃色素組分MS(Y2)、AF(Y4)、MFA(Y1)、MFB (Y3)的比例.該結(jié)果與圖1所示的不同發(fā)酵溫度下紅曲色素發(fā)酵產(chǎn)物的紫外-可見吸收光譜特征相符合.

2.3 紅曲色素組分的產(chǎn)量分析

至今已報道的紅曲色素組分有100多種[1],但目前的研究主要集中于6種主要的色素組分,包括2種黃色素組分MS(Y2)和AF(Y4)、2種橙色素組分RP(O1)和MR(O3)、2種紅色素組分紅斑胺(rubropunctamine,RPA)和紅曲紅胺(monascorubramine,MRA).利用HPLC對所檢測到的8種色素組分分別進(jìn)行了定量分析,其中MFA(Y1)、MFB(Y3)、MMA(O2)和MMB(O4)4種色素為非主要色素組分,目前研究較少,還未見商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品,參照Huang等[18]利用HPLC峰面積對其進(jìn)行了相對定量,每產(chǎn)生1 000 mAu·s峰面積的色素量記為1 AU,結(jié)果見圖5.

a.橙色素;b黃色素圖5 紅色紅曲菌M7在不同發(fā)酵溫度下的紅曲色素組分產(chǎn)量Fig.5 Yields of different Monascus pigment components produced by M.ruber M7 at different fermentation temperatures

由圖5可知,隨著溫度的升高,各色素組分的產(chǎn)量均先升高后降低.在25 ℃和40 ℃時,各色素組分的產(chǎn)量均顯著低于30 ℃和35 ℃(P<0.05);在30 ℃時,4種橙色素的產(chǎn)量均達(dá)到最大值,其中2種主要橙色素組分RP(O1)和MR(O3)的產(chǎn)量分別為107 mg/L和124 mg/L,而2種主要黃色素組分MS(Y2)和AF(Y4)的產(chǎn)量較低,分別為48 mg/L和26 mg/L;在35 ℃時,4種黃色素的產(chǎn)量均達(dá)到最大值,其中2種主要黃色素組分MS(Y2)和AF(Y4)的產(chǎn)量分別為100 mg/L和47 mg/L,而2種主要橙色素組分RP(O1)和MR(O3)的產(chǎn)量相對30 ℃顯著下降(P<0.05),分別為57 mg/L和50 mg/L.由此可見,將培養(yǎng)溫度從30 ℃提高到35 ℃,雖然色素總量顯著下降(P<0.05),4種主要色素組分RP(O1)、MR(O3)、MS(Y2)和AF(Y4)的總產(chǎn)量由305 mg/L降到了254 mg/L,但能顯著促進(jìn)黃色素的產(chǎn)生,可使MS(Y2)和AF(Y4)的總產(chǎn)量提高98%.

2.4 紅曲色素生物合成相關(guān)基因表達(dá)量的分析

目前,紅曲色素生物合成途徑已經(jīng)得到初步闡釋[1-2],其中6種主要色素成分的合成過程如下：聚酮合酶MrPigA以乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A和S-腺苷甲硫氨酸為底物,合成得到聚酮化合物,再經(jīng)過還原、氧化步驟,生成紅曲色素的嗜氮酮母環(huán)結(jié)構(gòu);脂肪酸合成酶MrPigJ和MrPigK以乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物,合成得到的β-酮酸被?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到嗜氮酮母環(huán)的羥基上,再經(jīng)過一系列反應(yīng)生成一對色素中間體1和2;FAD氧化還原酶MrPigF和烯酰還原酶MrPigH催化色素中間體1和2分別發(fā)生氧化、還原反應(yīng),使紅曲色素的合成途徑分成2條支路,一條支路流向橙色素組分RP(O1)和MR(O3),另一條支路流向黃色素組分MS(Y2)和AF(Y4);橙色素組分RP(O1)和MR(O3)在中性條件下,與菌體內(nèi)源NH3發(fā)生自發(fā)的嗜氮加成反應(yīng)(azaphilic addition reaction),轉(zhuǎn)化生成紅色素組分RPA和MRA(圖6).在本研究條件下,未檢測到明顯的RPA和MRA(圖2),且發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的pH始終維持在3.0以下,可能是生理酸性氮源(NH4)2SO4導(dǎo)致了培養(yǎng)基酸化[27],抑制了嗜氮加成反應(yīng).

該合成途徑根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]簡化而來.單實線箭頭表示單酶催化的反應(yīng);雙實線箭頭表示多酶催化的多步反應(yīng).向下和向上箭頭表示發(fā)酵溫度從30 ℃ 提高到35 ℃后,發(fā)酵中后期(5～7 d)相關(guān)基因表達(dá)水平的變化,其中綠色向下箭頭表示表達(dá)水平發(fā)生下調(diào),紅色向上的箭頭表示表達(dá)水平未發(fā)生下調(diào)(上調(diào)或不變).圖6 不同紅曲色素組分的生物合成途徑及關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化Fig.6 Biosynthetic pathway of different pigment components and the changes in expression levels of the key genes

由上述紅曲色素生物合成過程(圖6)可知,MrPigA、MrPigJ和MrPigK在紅曲色素合成的起始步驟中發(fā)揮作用,其基因表達(dá)量的變化與紅曲色素總量的變化密切相關(guān);MrPigF和MrPigH在橙色素和黃色素的合成分支節(jié)點上發(fā)揮作用,一方面,其基因表達(dá)量的高低分別與橙色素和黃色素產(chǎn)量的高低密切相關(guān),另一方面,二者的相對表達(dá)量(即表達(dá)量比值MrPigH/MrPigF)的變化會影響色素的分支代謝流向,從而改變橙色素和黃色素的生成比例.因此,分析了溫度對紅色紅曲菌M7中MrPigA、MrPigJ、MrPigK、MrPigF和MrPigH基因表達(dá)量的影響,結(jié)果見圖7.

不同小寫字母代表差異顯著,P<0.05圖7 不同溫度下紅曲色素合成基因簇中關(guān)鍵合成酶基因的表達(dá)量Fig.7 Expression levels of key genes in the biosynthetic gene cluster of Monascus pigments

由圖7A-C可知,溫度從30 ℃升高到35 ℃,MrPigA、MrPigJ、MrPigK的表達(dá)水平在發(fā)酵過程的第3、5、7天均發(fā)生顯著下降,說明高溫不利于這些關(guān)鍵合成酶基因的轉(zhuǎn)錄,使色素的合成在起始步驟中即受到抑制,該結(jié)果與紅曲色素總色價(圖1)和4種主要色素總產(chǎn)量(圖5)下降的結(jié)果表現(xiàn)一致.

由圖7D可知,溫度從30 ℃升高到35 ℃,MrPigF表達(dá)水平的變化趨勢同MrPigA、MrPigJ和MrPigK相似,在第3、5、7天均發(fā)生顯著下降,該結(jié)果與橙色素組分RP(O1)和MR(O3)產(chǎn)量的減少相一致(圖5).相比之下,MrPigH的表達(dá)水平僅在早期(第3天)顯著下降,而在中期(第5天)顯著升高,在后期(第7天)無顯著差異(圖7E),導(dǎo)致表達(dá)量比值MrPigH/MrPigF在中期(第5天)和后期(第7天)顯著升高(圖7F),表明溫度對橙色素和黃色素合成分支節(jié)點關(guān)鍵酶基因MrPigH和MrPigF在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用存在明顯差異,該調(diào)節(jié)差異可能是導(dǎo)致代謝流向黃色素改變,使MS(Y2)和AF(Y4)產(chǎn)量顯著提高的主要原因(圖6).

3 討論

從結(jié)構(gòu)上看,目前報道的大部分紅曲色素均由1個嗜氮酮母環(huán)和1條脂肪族側(cè)鏈組成,其中,脂肪族側(cè)鏈?zhǔn)怯蒑rPigJ和MrPigK組成的異源二聚體脂肪酸合成酶負(fù)責(zé)合成[1-2].由于異源二聚體脂肪酸合成酶MrPigJ-MrPigK在碳鏈長度的控制上不嚴(yán)格,能同時產(chǎn)生2種不同長度的產(chǎn)物,即β-酮基辛酸和β-酮基癸酸,因此,紅曲色素一般成對出現(xiàn),二者僅在脂肪族側(cè)鏈上相差2個碳原子.本研究,檢測到的8種色素組分,實質(zhì)上為4對色素產(chǎn)物,分別是MFA(Y1)和MFB(Y3)、MS(Y2)和AF(Y4)、RP(O1)和MR(O3)、MMA(O2)和MMB(O4).

紫外-可見吸收光譜法是目前最常用的紅曲色素分析方法,可用于表征紅曲色素的色調(diào)和色價.該方法簡單,方便,不需要標(biāo)準(zhǔn)品,成本低.然而,3類紅曲色素的吸收帶較寬,存在相互干擾的情況.例如：橙色素組分RP(O1)和MR(O3)(圖3)及紅色素組分RPA和MRA[2]均在400 nm附近有較大吸收,可干擾黃色素的測定.近年來,越來越多的研究開始關(guān)注紅曲色素的組成成分,采用的檢測方法包括TLC和HPLC等[18-19,27-32].與此同時,中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.150—2016《食品中紅曲色素的測定》規(guī)定了MS(Y2)、MR(O3)和MRA 共3種色素組分的HPLC測定;中國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3843—2014《出口食品中紅曲色素的測定》規(guī)定了4種紅曲色素組分的HPLC測定,除了GB 5009.150—2016中的3種,還包括AF(Y4).然而,紅曲色素的種類有100多種[1],目前可獲得的商品化紅曲色素標(biāo)準(zhǔn)品只有6種主要色素組分,即黃色素組分MS(Y2)和AF(Y4)、橙色素組分RP(O1)和MR(O3)、紅色素組分RPA和MRA,而且價格昂貴,因此,一些研究僅利用HPLC峰面積大小或TLC色斑深淺對色素組分進(jìn)行相對定量[18-19,30,32].由此可見,研究不同色素組分的發(fā)酵條件,提高其產(chǎn)量,不僅有利于高附加值紅曲色素組分的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),也有利于解決紅曲色素標(biāo)準(zhǔn)品相對匱乏的現(xiàn)狀.

MS(Y2)和AF(Y4)因其良好的穩(wěn)定性和生物活性[5-10],受到廣泛關(guān)注.在臺灣暢銷的保健食品“娘家大紅曲膠囊”,其功能性成分為MS(Y2)和AF(Y4),用于血脂和血糖的調(diào)節(jié).在常規(guī)紅曲色素發(fā)酵條件下,MS(Y2)和AF(Y4)不是優(yōu)勢組分,產(chǎn)量較低,是制約其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸之一.因此,研究影響紅曲菌產(chǎn)生MS(Y2)和AF(Y4)的因素,對提高M(jìn)S(Y2)和AF(Y4)的發(fā)酵水平有重要意義.Patrovsky等[27]研究了氮源和培養(yǎng)基初始pH值對紫色紅曲菌(M.purpureus)DBM 4360產(chǎn)生黃色素和橙色素的影響,發(fā)現(xiàn)適宜氮源為蛋白胨,適宜pH值為2.5,該條件下單位質(zhì)量菌絲體的MS(Y2)和AF(Y4)總產(chǎn)量為72.8 mg/g.本研究通過提高發(fā)酵溫度至35 ℃,使紅色紅曲菌M7單位質(zhì)量菌絲體的MS(Y2)和AF(Y4)總產(chǎn)量提高到66.4 mg/g,接近Patrovsky等[27]報道的適宜條件下的MS(Y2)和AF(Y4)產(chǎn)量.下一步研究中,有待結(jié)合溫度,對發(fā)酵培養(yǎng)基組成和其他發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期進(jìn)一步提高M(jìn)S(Y2)和AF(Y4)的產(chǎn)量.

溫度是影響微生物生長和代謝的重要因素.本研究發(fā)現(xiàn),紅色紅曲菌M7在30℃和35 ℃條件下形成的生物量無顯著性差異(圖1),說明溫度并非主要通過影響生長來影響紅曲色素的合成.qPCR分析發(fā)現(xiàn),紅曲色素合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的變化與橙色素、黃色素產(chǎn)量的變化有一定的相關(guān)性(圖5～7),說明溫度對紅曲色素液態(tài)發(fā)酵的影響與其對色素合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān),其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.此外,色素合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯和酶活也可能會受到溫度的影響,需要進(jìn)一步探討.

目前,紅曲色素生物合成途徑已經(jīng)得到初步闡釋[1-2],其中6種主要色素成分的合成過程較清楚(圖6),而黃色素組分MFA(Y1)和MFB(Y3)、橙色素組分MMA(O2)和MMB(O4)等多種其他色素組分的具體合成過程及關(guān)鍵酶還有待闡述.本研究發(fā)現(xiàn),溫度對MFA(Y1)、MFB(Y3)、MMA(O2)和MMB(O4)也有顯著影響.在此基礎(chǔ)上,通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析,可為紅曲色素生物合成途徑的進(jìn)一步完善提供線索.