柴胡疏肝散異病同治2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和抑郁癥的作用機(jī)制

常 碩，劉懷珍，陶慶雪，郭錦晨

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（合肥230031）；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病中心-內(nèi)分泌科（合肥230031）；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（合肥 230038）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是臨床最常見、最重要的代謝性疾病之一，其發(fā)病主要與胰島素缺陷和（或）胰島素抵抗有關(guān)。抑郁癥（depressive Disorders，DD）和非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是T2DM 患者常見的并發(fā)癥?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，T2DM、NAFLD 與DD 之間存在某些相互作用，增加了三種疾病發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，也為臨床治療三種疾病帶來了諸多挑戰(zhàn)[1]。臨床上，T2DM人群患NAFLD 和DD 的概率遠(yuǎn)大于普通人群[2-3]，這不僅加重了T2DM 患者的致殘率、死亡率，更為T2DM 患者的治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。而傳統(tǒng)中醫(yī)的“異病同治”理念對疾病共病的治療優(yōu)勢尤為突出，是中醫(yī)辨證論治的生動體現(xiàn)，它將辨病與辨證有效地連接在一起，促進(jìn)了中西醫(yī)結(jié)合的發(fā)展[4]。

柴胡疏肝散一方出自《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》，由芍藥、川芎、香附、柴胡、甘草、陳皮、枳殼7 味中藥組成，全方謹(jǐn)遵《內(nèi)經(jīng)》“木郁達(dá)之”之旨，具有疏肝解郁，行氣止痛之效。秦伯末《謙齋醫(yī)學(xué)講稿》中指出：“本方即四逆散加川芎、香附和血理氣……專以疏肝為目的?！爆F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示柴胡疏肝散具有抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保肝、抗纖維化、干預(yù)神經(jīng)傳遞等作用[5]。并且已有臨床研究證實(shí)此方治療T2DM[6]、NAFLD[7]、DD[8]療效確切。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對接技術(shù)探討柴胡疏肝散異病同治T2DM、NAFLD 及DD 的作用機(jī)制，為柴胡疏肝散治療三病共病提供科學(xué)依據(jù)，以供臨床參考。

1 方法

1.1 柴胡疏肝散藥物活性成分的篩選

將柴胡疏肝散全方中的芍藥、川芎、香附、柴胡、甘草、陳皮、枳殼分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫平臺（TCMSP）中，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為條件進(jìn)行篩選，把結(jié)果錄入EXCEL 表格中。

1.2 柴胡疏肝散潛在作用靶點(diǎn)篩選及基因名標(biāo)準(zhǔn)化

把1.1 中篩選得到的化合物ID（Mol ID）輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫，收集每個活性成分的潛在靶點(diǎn)信息，并錄入EXCEL中保存。進(jìn)入UniProt（http://www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫，收集所有已經(jīng)驗(yàn)證過的人類基因，錄入EXCEL，以此基因名作為標(biāo)準(zhǔn)將上一步在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中收集到的潛在靶點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)化命名并保存。

1.3 疾病靶點(diǎn)的篩選

為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確與統(tǒng)一，疾病的靶點(diǎn)均在Gene Cards（http://www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫中篩選，分別以Type 2 diabetes、Nonalcoholic fatty liver disorder、depressive disorder為檢索詞，獲取疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。將1.2中標(biāo)準(zhǔn)化后的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Venny2.1在線平臺取交集，得到藥物-疾病的共同作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將柴胡疏肝散中單味藥及活性成分，藥物-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.0軟件中，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.4 中得到的共同靶點(diǎn)輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫，以“Homo sapiens”為條件，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。并將此數(shù)據(jù)庫的分析數(shù)據(jù)以“tsv”格式保存，導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 軟件中，以度值（Degree）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）為條件篩選出柴胡疏肝散異病同治T2DM、NAFLD 和DD 的核心靶點(diǎn)，并在Cytoscape3.7.0軟件中構(gòu)建核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因功能和通路富集分析

將1.5 中得到的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在線數(shù)據(jù)庫平臺，以“OFFICE_GENE_SYMBOL”與“Homo sapiens”為條件，對靶點(diǎn)分別進(jìn)行生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）分析及Kyoto encyclopedia of genes and gnomes（KEGG）富集通路分析。

1.7 分子對接驗(yàn)證

在PubChem 數(shù)據(jù)庫找出活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，在RCS PDB 數(shù)據(jù)庫找出靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，通過Pymol 2.4.0軟件及AutodockTools 1.5.7軟件對兩者預(yù)處理后，在Autodockvina 1.1.2軟件中進(jìn)行對接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出柴胡疏肝散中各藥物有效活性成分?jǐn)?shù)目分別為：陳皮5個、柴胡13個、川芎6個、香附16 個、枳殼5 個、芍藥8 個、甘草88 個，刪除重復(fù)值后，共有123個符合條件的化合物，并將不同藥物中相同的活性成分進(jìn)行統(tǒng)計，見表1。

表1 柴胡疏肝散藥物中的共有活性成分Table 1 Common active ingredients in Chaihu Shugan Powder

2.2 藥物靶點(diǎn)篩選及基因名標(biāo)準(zhǔn)化

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫共篩選出柴胡疏肝散2 995 個潛在作用靶點(diǎn)，其中陳皮95 個、柴胡348 個、川芎42 個、香附496個、枳殼123個、芍藥123個、甘草1 768個，將得到的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，刪除重復(fù)后剩余251個有效靶點(diǎn)。

2.3 藥物與疾病交集靶點(diǎn)篩選

對1.3 中獲得的3 種疾病的基因靶點(diǎn)進(jìn)行多次“Relevance score”參數(shù)截取，篩選出T2DM相關(guān)靶點(diǎn)1 622個、NAFLD相關(guān)靶點(diǎn)1 513個，DD相關(guān)靶點(diǎn)1 600個，將上述靶點(diǎn)與2.2篩選到的藥物靶點(diǎn)取交集，得到交集靶點(diǎn)共70個，見圖1。

圖1 交集靶點(diǎn)VEEN圖Figure 1 Venn diagram of intersecting targets

2.4 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.0 軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖2。其中粉色菱形代表藥物名稱（CX為川芎，CP為陳皮，CH為柴胡，BS為白芍，ZK為枳殼，XF為香附，GC為甘草），黃色圓形和紫色圓形代表藥物成分（XF1-XF10 分別代表香附的10 種不同活性成分），紫紅色六邊形代表藥物之間的相同成分（各字母含義見表1），橙色正方形代表藥物與疾病之間的共同靶點(diǎn)，綠色箭頭形狀代表3種疾病。

圖2 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Network diagram of Drug-Ingredient-Disease-Target

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

根據(jù)1.5 步驟篩選得到柴胡疏肝散異病同治T2DM、NAFLD和DD的19個核心靶點(diǎn)。為提高所篩選到的核心靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，按照1.4 與1.6 步驟找出柴胡疏肝散分別治療T2DM、NAFLD、DD 的核心靶點(diǎn)各有39 個、31 個、26 個，將此3 組核心靶點(diǎn)取交集后與上述19 個核心靶點(diǎn)再次取交集，最終得到18 個核心靶點(diǎn)。此18 個核心靶點(diǎn)均在上述19 個靶點(diǎn)中，故以70 個靶點(diǎn)篩選出的核心靶點(diǎn)為依據(jù)，構(gòu)建交集核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，及其可視化分析，見表2、表3 與圖3。其中IL6、TNF、AKT1、IL1B、VEGFA 的度值較大，且在2.6 KEGG富集通路中出現(xiàn)的頻次分別為11、12、19、8、7次，提示此5個靶點(diǎn)可能為柴胡疏肝散異病同治T2DM、NAFLD和DD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 PPI network diagram of key targets

表2 核心靶點(diǎn)的篩選Table 2 Screening of core targets

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)信息Table 3 Information of key targets

2.6 基因功能分析和KEGG分析

將得到的70 個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至DAVID 在線數(shù)據(jù)庫平臺，進(jìn)行基因功能GO 分析和KEGG 分析，分別得到BP、CC、MF 條目597、55、78 個，以及151 條KEGG 信號通路。以P≤0.01為篩選條件,按P值大小分別選取GO 分析中的前10 條繪制成氣泡圖，見圖4。選取KEGG 分析中的前20 條信號通路（刪除與本研究無關(guān)的信號通路，如Pathways in cancer，Human cytomegalovirus infection，Amoebiasis 等）做KEGG 基因富集分析圖，見圖5。

圖4 GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis

圖5 交集靶點(diǎn)KEGG富集分析Figure 5 KEGG enrichment analysis of intersecting targets

2.7 分子對接驗(yàn)證

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[9-10]，柴胡中的主要成分柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 在抗炎、抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)具有顯著作用。柴胡是柴胡疏肝散中的君藥，故將上述兩個主要成分以及表2 中Degree 值靠前的6 個藥物成分與核心靶點(diǎn)（TNF、IL6、VEGFA、PPARG、IL1B、AKTI）進(jìn)行虛擬分子對接，結(jié)果顯示結(jié)合能均≤-6.0 kcal/mol，表明以上活性成分與預(yù)期篩選的靶點(diǎn)能夠穩(wěn)定結(jié)合，現(xiàn)將所有對接結(jié)合能結(jié)果制作成熱圖展示并選取其中結(jié)合能較好的對接體進(jìn)行可視化展示，見圖6、圖7。

圖6 分子對接熱圖Figure 6 Heat map of molecular docking

圖7 分子對接結(jié)果Figure 7 Results of molecular docking

3 討論

胰島素抵抗與慢性炎癥反應(yīng)貫穿著T2DM 與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展過程，其中胰島素抵抗的發(fā)生可進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)與脂代謝紊亂，這兩種病理過程又分別是DD 和NAFLD 發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，由此可見，T2DM、NAFLD 與DD 之間存在復(fù)雜的病理反應(yīng)，使三病互為因果。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為T2DM 屬于“消渴”范疇；NAFLD歸屬于“肝癖”病[11]；抑郁癥則屬于“郁證”范疇。此三病雖歸屬于不同系統(tǒng)疾病，但綜合分析三病核心病機(jī)總不離“肝郁氣滯”[12-14]。《丹溪心法》指出：“氣血沖和，萬病不生。一有怫郁，諸病生焉”，故臨床常以柴胡疏肝散異病同治。全方融疏肝、養(yǎng)肝、健脾于一體，“辛疏酸斂合法，肝脾氣血兼顧”，切合消渴、肝癖與郁證的核心病機(jī)。

經(jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散異病同治T2DM、NAFLD和DD 的主要有效化學(xué)成分為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素等。槲皮素和山奈酚都屬于黃酮類化合物，兩者均可改善胰島素抵抗和減輕炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為黃酮類化合物具有抗炎、保護(hù)神經(jīng)、維持血糖平衡等藥理作用[15]。有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[16]，槲皮素可以通過改善胰島素抵抗而對NAFLD有顯著療效，既證明了槲皮素對2 型糖尿病的作用，又闡釋了槲皮素治療NAFLD 的機(jī)制。β-谷甾醇對脂代謝有積極作用[17]，目前常應(yīng)用于非酒精性脂肪肝的治療和預(yù)防。柚皮素屬于二氫黃酮類化合物，具有抗炎、降血脂、抗菌、抗氧化、抗癌抗腫瘤等廣泛藥理作用，在治療炎癥和胰島素抵抗引發(fā)的各種疾病中具有積極意義，如T2DM、NAFLD等[18-19]。

由表3 可知IL6、TNF、IL1B、VEFGA、PPARG 等靶點(diǎn)在藥物治療疾病中可能起著關(guān)鍵作用。TNF-α 與IL6 已被證實(shí)為炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物[20]，其中IL6 是一種促炎癥細(xì)胞因子，其濃度常在炎癥反應(yīng)過程中增加，TNF-α則可以刺激免疫細(xì)胞合成IL6、IL1B等炎性細(xì)胞因子。IL1β是趨化因子家族中IL1存在的分子形式之一，其過度表達(dá)可誘導(dǎo)下游細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL4、IL6、VEGF 等[21]，他們可直接加重炎癥反應(yīng)，影響神經(jīng)發(fā)生和干擾神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)，而抑郁癥的發(fā)生則與此有關(guān)[22]。另外有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明[23]，IL1β 亦是治療T2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在T2DM患者中使用IL1β受體拮抗劑可顯著降低血糖濃度，改善胰島B 細(xì)胞功能。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）是一種轉(zhuǎn)錄因子[24]，可參與脂肪代謝、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗等過程。VEGFA 可正向調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)的發(fā)生與增殖，提高抑郁患者的認(rèn)知功能，減少抑郁患者的不良情緒[25]。

GO、KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散異病同治過程主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路等。糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是在高血糖狀態(tài)在經(jīng)過非酶糖基化反應(yīng)產(chǎn)生的一種病理產(chǎn)物，是加重糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)鍵因素，并且其形成過程是不可逆的。AGEs與相應(yīng)受體（RAGE）相互結(jié)合所形成的通路介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程，加重了胰島素抵抗和脂代謝紊亂[26-27]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[28]，葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）的信號表達(dá)可能與缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-α）基因表達(dá)及其依賴的信號通路有關(guān)，其最終結(jié)果加重了脂肪組織中的炎癥與胰島素抵抗，當(dāng)HIF-α基因沉默時，GIP及其誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)隨之減少。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)的重要通路之一，眾所周知，MAPK信號通路參與了抑郁癥的發(fā)病機(jī)制[29]。在慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激（CUMS）誘導(dǎo)的抑郁小鼠模型中，MAPK信號通路的活化與小鼠抑郁癥狀及小鼠體內(nèi)炎癥因子的過度表達(dá)相關(guān)[30]，且有報告指出，對p38MAPK 信號通路的阻斷不僅可以降低IL6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，亦可有效發(fā)揮抗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）作用[31]。Toll 樣受體（TLRs）信號通路已經(jīng)被證實(shí)與胰島素抵抗及神經(jīng)炎癥有密切聯(lián)系，Luteolin干預(yù)慢性炎癥及改善胰島素功能即是主要通過參與此信號通路完成的[32-33]。

分子對接結(jié)果表明，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的柴胡疏肝散的有效活性成分以及柴胡的主要成分與有效靶點(diǎn)之間具有良好的結(jié)合能，證明了柴胡疏肝散所含的活性成分與靶點(diǎn)可以有效作用于T2DM、NAFLD 和DD。

4 結(jié)論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)和分子對接技術(shù)闡釋了柴胡疏肝散通過多靶點(diǎn)、多通路異病同治T2DM、NAFLD 和DD 的作用機(jī)制，為中醫(yī)異病同治理念提供了科學(xué)支撐，為T2DM 及其并發(fā)癥的治療提供了治療方案。