芒柄花黃素對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和豐度的影響

楊翼飛，徐桂瑤，王 琴，趙倩云，羅浩銘，曾久平，吳 旭,2，李明星

1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系細(xì)胞治療與細(xì)胞藥物瀘州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（瀘州646000）；2.川南醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究院（瀘州 646000）

人體腸道內(nèi)定植著數(shù)萬億的微生物群（細(xì)菌、真菌與病毒），這類被稱為腸道菌群的微生物能與宿主長期相互作用，形成“宿主—菌群”共生關(guān)系，通過參與和調(diào)控宿主一系列生命活動(dòng)而影響機(jī)體的健康與疾病發(fā)展[1]。在腸道菌群中有150～170 種細(xì)菌占主導(dǎo)地位，并發(fā)揮著腸道結(jié)構(gòu)屏障維持、免疫保護(hù)、代謝與神經(jīng)調(diào)節(jié)等重要功能[2]。

異黃酮類化合物是一類廣泛存在于天然植物中的酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗血栓與免疫調(diào)節(jié)等作用[3-5]。芒柄花黃素（formononetin，F(xiàn)MN）是一種富含于豆科植物如紅車軸草等的異黃酮化合物，也是甘草、當(dāng)歸、黃芪、葛根和雞血藤等中藥的活性成分之一，已被證實(shí)具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗凋亡等多種活性[6]。目前有諸多研究結(jié)果表明，F(xiàn)MN能夠有效抑制生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與生長，如乳腺癌[7]、肺癌[8]、胃癌[9]和膀胱癌[10]等。此外，已有研究指出，F(xiàn)MN 作為黃芪有效成分之一，是黃芪治療炎癥性腸病動(dòng)物模型的主要藥效物質(zhì)之一[11]，同時(shí)FMN 也在利用黃芪提取物改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而抑制結(jié)腸癌進(jìn)展的研究中發(fā)揮重要作用[12]。此外，F(xiàn)MN作為一種潛在益生元，可以有效調(diào)節(jié)宿主代謝和降低全身系統(tǒng)炎癥，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，并可通過提高乙酸和丁酸產(chǎn)生菌豐度緩解高脂飲食導(dǎo)致的肥胖[13]。然而，F(xiàn)MN 對宿主腸道菌群生長的直接影響研究卻鮮見報(bào)道。本文擬采用16S rRNA高通量測序技術(shù)，研究FMN對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與豐度的影響，揭示含有FMN 成分的中藥對腸道菌群生長以及可能對機(jī)體健康狀況產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）級雄性C57BL/6J小鼠，6周齡，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)SPF 級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)對動(dòng)物的處置完全遵守對動(dòng)物的倫理要求，并經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（編號：201703142）。

1.2 材料與試劑

芒柄花黃素（Solarbio,SF8070），E.Z.N.A.? soil DNA kit（Omega Bio-tek,Norcross,GA,USA），AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA），NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，USA）。

1.3 主要儀器

超微量分析天秤（美國康州HZ 電子有限公司，HZK-FA210S）；渦旋混勻器（德國IKA 公司，C-MAGHS7）；GeneAmp PCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI 公司，9700）；Quantus Fluorometer（美國普洛麥格Promega公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物給藥與樣品采集 將12只C57BL/6J雄性小鼠飼養(yǎng)于SPF 動(dòng)物房，適應(yīng)7 d 后，隨機(jī)分為對照組（CTRL）和給藥組（FMN），每組各6 只。給藥組小鼠每天灌服FMN，劑量為5 mg/kg（根據(jù)健康成年人每日推薦臨床劑量與小鼠之間按體表面積折算的等效劑量比值計(jì)算確定），對照組小鼠每天灌胃與給藥組相同體積的PBS。每天下午5：00～6：00 灌胃給藥，持續(xù)10 d。所有小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)：12 h明暗周期交替，自由取食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心條件保持在（23±2）℃的恒定溫度。

實(shí)驗(yàn)第11 d，取各組小鼠新鮮糞便收集于無菌1.5 mL EP 管中，干冰速凍后，立即轉(zhuǎn)移于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 DNA提取及測序 將小鼠新鮮糞便用干冰運(yùn)送至測序公司，根據(jù)DNA 提取試劑盒說明書的具體步驟對小鼠糞便中微生物總基因組DNA 進(jìn)行提取。后續(xù)的一系列PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、檢測與定量方法如本團(tuán)隊(duì)前期的研究所報(bào)道[14-15]。最后利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進(jìn)行微生物群落多樣性及交互式分析（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4.3 序列處理和分析 使用Fastp 0.19.6 軟件對樣本原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，并使用Flash 1.2.11 軟件進(jìn)行拼接。使用Uparse 7.0.1090，把所得序列按照97%的相似度，進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units,OTU）聚類，并將嵌合體剔除。利用RDP 2.11軟件對每條序列按照物種分類順序進(jìn)行注釋，比對Silva 138 16S rRNA數(shù)據(jù)庫，將比對閾值設(shè)置為70%。

用Mothur 1.30.2 繪制稀釋曲線和Alpha 多樣性進(jìn)行分析。通過QIIME 1.9.1 采用主坐標(biāo)分析（PCoA）進(jìn)行Beta 多樣性分析。利用上海美吉生信云平臺的LEfSe程序?qū)崿F(xiàn)線性判別分析（LDA）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析是衡量物種豐度的指標(biāo)，用于反映微生物群落的豐富度和多樣性。本研究主要分析Sobs、Chao、Ace 和Shannon 四個(gè)Alpha 多樣性指標(biāo)，其中Sobs、Chao 和Ace 這三個(gè)指數(shù)可反映群落的物種數(shù)量豐度，值越大，微生物群落數(shù)量越豐富。Shannon 指數(shù)可衡量微生物組成的多樣性，值越大，微生物群落多樣性越高。從圖1A-1C可以看出，與對照組相比，F(xiàn)MN組 的Sobs、Chao 和Ace 指數(shù)值均有顯著增加（P ＜0.05）。由圖1D可知，F(xiàn)MN組較對照組Shannon指數(shù)值明顯升高（P ＜0.05）。

圖1 Alpha多樣性指數(shù)及稀釋曲線Figure 1 Alpha diversity indices and rarefaction curve

稀釋曲線從樣本中隨機(jī)抽取測序數(shù)據(jù)量，觀測物種數(shù)量（Sobs、Chao 和Ace 指數(shù)，圖1E-1G）和多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)，圖1H）值曲線圖。由分析曲線結(jié)果可知，兩組樣本的稀釋性曲線均趨向平坦，可判斷本研究中測序數(shù)據(jù)量足夠，測序深度合理，可以準(zhǔn)確反映本研究小鼠糞便樣本中絕大多數(shù)腸道微生物的多樣性信息，數(shù)據(jù)可以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性分析可比較不同樣本間群落組成與結(jié)構(gòu)的相似程度或差異關(guān)系。為進(jìn)一步研究FMN 給藥干預(yù)后，F(xiàn)MN 組與對照組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的相似程度。本研究基于樣本操作分類單元（OTU）水平對兩組的菌群多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis,PCoA）。由圖2 可以看出，兩組菌群相對處于不同區(qū)域，且在PC2軸上有明顯差異。

圖2 基于OTU水平的PCoA分析Figure 2 PCoA analysis based on OTU level

2.3 物種分類學(xué)分析

2.3.1 菌群構(gòu)成分析Venn 圖可用于統(tǒng)計(jì)多樣本中不同組間所共有和其中單個(gè)樣本所獨(dú)有的物種數(shù)目，有利于直觀的展現(xiàn)不同樣本中物種不同分類水平組成的相似性及重疊情況。如圖3A所示，本研究根據(jù)97%的OTU序列相似度對CTRL和FMN兩組的核心OTU進(jìn)行物種組成分析，對照組平均OTU 數(shù)為571，F(xiàn)MN組平均OTU 數(shù)為576，其中兩組共有545 個(gè)相同OTU，而有31個(gè)OTU為FMN組所特有，較對照組有所增加。

圖3 菌群構(gòu)成分析Figure 3 Analysis of microbial composition

由圖3B可知，兩組樣品的菌群組成在門水平上分析主要分為4個(gè)門，分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres），其中以擬桿菌門和厚壁菌門為主要菌門。對照組擬桿菌門和厚壁菌門比例分別為37.72%和56.92%，F(xiàn)MN 組對應(yīng)比例分別為52.29%和38.65%。兩組主要門水平上的菌群豐度差異（圖3C）顯示，與對照組相比，F(xiàn)MN 組擬桿菌門豐度顯著增加（P ＜0.01），厚壁菌門豐度顯著減少（P ＜0.01），變形菌門豐度顯著減少（P ＜0.05），脫鐵桿菌門有上升趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.2 屬水平菌群組成及物種差異性分析 在菌群屬水平（圖4A）上，F(xiàn)MN 組相較于對照組有7 個(gè)屬明顯增加，其中FMN 組中norank_o__Clostridiales顯著增加（P ＜0.01），unclassified_o__Clostridiales、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、Odoribacter、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、脫鹵桿菌屬（Dehalobacterium）和unclassified_f__Helicobacteraceae均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖4 屬水平菌群組成及物種差異性分析Figure 4 Analysis of microbial composition and difference on genus level

為進(jìn)一步探究芒柄花黃素對小鼠腸道菌群屬水平菌群組成的影響，確定兩組之間具有顯著差異的微生物類群，在組間進(jìn)行LEfSe 分析，得到分類進(jìn)化分支圖（圖4B）和LDA 評分圖（LDA ＞3.5，圖4C）。結(jié)果顯示，F(xiàn)MN 組中，梭菌目（Clostridiales，從綱到目）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、糞球菌屬（Coprococcus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、unclassified_o__Clostridiales（從科到屬）、norank_o__Clostridiales（從科到屬）unclassified_f__Helicobacteraceae、norank_o__Bacteroidales（從科到屬）、臭氣桿菌科（Odoribacteraceae）、Odoribacter為優(yōu)勢富集菌群。

如圖5所示，與對照組相比較，F(xiàn)MN組中糞球菌屬（Coprococcus）（P ＜0.01）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（P ＜0.05）、unclassified_o__Clostridiales（P ＜0.01）、norank_o__Clostridiales（P ＜0.01）、Odoribacter（P ＜0.05）和norank_o__Bacteroidales（P ＜0.05）豐度顯著增加，而unclassified_f__Lachnospiraceae（P ＜0.05）較對照組豐度顯著降低。

圖5 各組間主要差異關(guān)鍵菌屬Figure 5 The specific difference of key genus among the groups

3 討論

定植在宿主腸道中的數(shù)萬億的微生物群與宿主之間存在互惠互利的共生關(guān)系。宿主為腸道微生物群提供了重要的棲息地和營養(yǎng)物質(zhì)，而腸道微生物群又通過產(chǎn)生有益的營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素[16-17]和短鏈脂肪酸（short chain fatty acid,SCFAs）[18-19]的合成能有效維持機(jī)體正常代謝和腸道免疫系統(tǒng)的成熟。然而，腸道微生物群穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變即菌群失調(diào)，則將會(huì)增加一系列腸道疾病風(fēng)險(xiǎn)[20-22]。因此，維護(hù)正常的腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對機(jī)體健康極其重要。

本研究基于16S rRNA 高通量測序技術(shù)，探究了芒柄花黃素對小鼠腸道菌群的影響。通過Alpha 多樣性和Beta 多樣性分析可知，芒柄花黃素在一定程度上能夠提高小鼠腸道菌群的群落多樣性及豐富度，并調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)。此外，基于門屬水平對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵菌屬變化分析表明：與對照組相比，在門水平上，F(xiàn)MN給藥后擬桿菌門、變形菌門和脫鐵桿菌門豐度升高，而厚壁菌門豐度降低；在屬水平上，F(xiàn)MN組糞球菌屬、瘤胃球菌屬、unclassified_o__Clostridiales、norank_o__Clostridiales、Odoribacter和norank_o__Bacteroidales豐度增多，unclassified_f__Lachnospiraceae豐度減少。

早前研究表明，厚壁菌門的增加和擬桿菌門的減少與多種常見高發(fā)疾病的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切，如炎癥性腸病[23]、肥胖與非酒精性脂肪肝[24]。糞球菌屬、瘤胃球菌屬、Odoribacter和屬于擬桿菌門的norank_o__Bacteroidales，這些腸道菌群為常見的SCFAs 的產(chǎn)生菌，如瘤胃球菌屬能夠產(chǎn)生包括丁酸鹽在內(nèi)的SCFAs[25-27]。這些益生菌能夠幫助宿主分解和利用多糖，且在體內(nèi)酵解作用產(chǎn)生的SCFAs 能為宿主提供能量，并促進(jìn)腸道健康，此外，相關(guān)SCFAs的增加可以有效降低腸道炎癥風(fēng)險(xiǎn)[28-29]。Clostridiales菌屬能夠發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)從而降低結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)[30]。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)unclassified_f__Lachnospiraceae的增加與2型糖尿病、直腸癌的發(fā)生相關(guān)[31-33]。從這些主要菌群在兩組之間的變化可以看出，F(xiàn)MN 給藥后可使小鼠腸道有益菌群增加而潛在致病菌群減少。

異黃酮作為一類與營養(yǎng)、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域相關(guān)的植物雌激素，有廣泛的藥理作用[34]。研究表明，人體每日攝入高劑量異黃酮，例如韓國人和日本人平均每天攝入30 mg異黃酮可減少代謝性疾病的發(fā)病率，尤其是肥胖[35]。臨床研究也顯示，異黃酮可極大降低更年期女性的更年期綜合癥、偏頭痛、糖尿病和高血壓等癥狀風(fēng)險(xiǎn)[36-37]。早前的研究結(jié)果都提示異黃酮對于人體健康具有潛在的保護(hù)效應(yīng)。而FMN 作為一種被廣泛研究的異黃酮成分，經(jīng)研究證明可促進(jìn)有益菌的生長。腸道菌群作為人體肝臟以外的第二個(gè)代謝性“隱形器官”，對機(jī)體正常的新陳代謝和免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要[38-39]。

本研究以腸道菌群為主要切入點(diǎn)，探究FMN 對健康小鼠腸道菌群組成與結(jié)構(gòu)的影響，揭示FMN 對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示FMN 可能作為一種潛在益生元，有效調(diào)節(jié)腸道菌群，從而促進(jìn)腸道微生態(tài)健康。

4 結(jié)論

芒柄花黃素可提高小鼠腸道菌群豐富度與多樣性，并改變菌群結(jié)構(gòu)、增加有益菌優(yōu)勢。