番茄死秧的病菌鑒定及綜合防控措施

孫永生，蔣欣陶，劉愛(ài)群，李凌欣，張逸鳴，劉靜，王國(guó)政*

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.葫蘆島市南票區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 葫蘆島 125027；3.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

遼寧地處中國(guó)東北地區(qū)南部，四季分明，光照充足，晝夜溫差適度，非常適合保護(hù)地果菜類(lèi)生產(chǎn)，尤其適合番茄生產(chǎn)。遼寧省番茄種植面積約2.91 萬(wàn)hm2，占遼寧省蔬菜種植面積的32.4%[1]。由于種植模式單調(diào)，連作障礙、土傳病害逐年加重。同時(shí)由于種苗來(lái)源廣泛，土壤環(huán)境惡化，細(xì)菌性病害日趨盛行，遼寧省番茄主產(chǎn)區(qū)死秧問(wèn)題呈逐年上升趨勢(shì)，造成番茄大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了番茄種植戶的收入和生產(chǎn)積極性。

近年來(lái)，遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院專(zhuān)家采集了省內(nèi)番茄主產(chǎn)區(qū)北票、莊河、黑山、建平、南票、遼中等地的番茄死秧植株，運(yùn)用鏡檢，采用病菌分離培養(yǎng)、致病性鑒定和分子鑒定的方法，鑒定造成番茄死秧的主要原因是番茄潰瘍病、枯萎病和根腐病以及根結(jié)線蟲(chóng)病。研究發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)不同茬口抽樣番茄植株發(fā)病癥狀并不一致。越冬茬、早春茬口抽樣病株主要是番茄潰瘍病，潰瘍病的病原菌為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）。發(fā)病植株表現(xiàn)的主要癥狀是下部葉片首先發(fā)病，發(fā)病初期葉片邊緣出現(xiàn)褐色病斑，并伴有黃色暈圈，隨病情加重，病斑顏色加深變?yōu)楹诤稚?，并逐漸向內(nèi)擴(kuò)大，導(dǎo)致整個(gè)葉片黃化[2]。果實(shí)染病，果面出現(xiàn)網(wǎng)狀或大理石紋理。

秋延茬口抽樣病株死秧的主要原因是番茄枯萎病，其病原菌為尖胞鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。發(fā)病植株表現(xiàn)的癥狀是植株從近地面的葉序開(kāi)始發(fā)病，逐漸向上蔓延。發(fā)病初期，植株中下部葉片出現(xiàn)枯萎，隨著病害發(fā)生，植株中上部葉片陸續(xù)發(fā)病，葉片萎蔫但不脫落，直至最后全株葉片枯萎發(fā)黃，整株枯死。造成遼寧地區(qū)番茄死秧的另一個(gè)主要病害就是番茄腐霉根腐病，其病原菌是瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）。發(fā)病植株的癥狀是植株莖基部及地面處呈褐色橢圓形病斑，濕度大時(shí)，病斑迅速向上、向下擴(kuò)展，1～2 d 后可繞莖一周，呈灰褐色變軟凹陷，病莖上部葉片迅速萎蔫。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)植株萎蔫或枯死。田間濕度大時(shí)莖基部呈水漬狀腐爛并長(zhǎng)出白色絮狀霉層，根部變黑、腐爛。

隨著病原菌鑒定技術(shù)的不斷更新，鑒定手段從形態(tài)學(xué)鑒定到分子生物學(xué)鑒定。番茄潰瘍病形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，發(fā)病初期，葉片邊緣或葉脈間有淡綠色斑塊，呈水漬狀，隨后逐漸壞死變干，并擴(kuò)展至整個(gè)葉片。成株期發(fā)病，葉片從下至上葉緣褪綠變褐并向上卷曲，隨病情發(fā)展，葉柄或主莖上產(chǎn)生灰白色至灰褐色條狀枯斑，莖部開(kāi)裂并壞死，剖莖可見(jiàn)髓部中空，維管束褐變，病害擴(kuò)展緩慢時(shí)，病莖略變粗，其表面生出較多不定根或刺狀突起，造成全株枯死，但果實(shí)未出現(xiàn)“鳥(niǎo)眼斑”；此外，把發(fā)病植株的發(fā)病部位做成切片，在顯微鏡下觀察，能看到有膿狀的液體在顯微鏡下緩慢移動(dòng)，據(jù)此斷定是細(xì)菌性病害。本研究分析了番茄死秧的具體原因以及形成番茄死秧問(wèn)題的一套鑒定體系，為更準(zhǔn)確鑒定致病菌類(lèi)型，還采用序列分析方法進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，以期為遼寧設(shè)施番茄生產(chǎn)中存在的死秧現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從遼寧省內(nèi)主要番茄產(chǎn)區(qū)采集番茄潰瘍病病葉、病果以及病莖，帶回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)病菌分離[3]。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0[4]。

1.2 儀器與設(shè)備

電磁爐，SH2128B，廣東美的生活電器制造有限公司；DTY-900 型超凈工作臺(tái)、過(guò)濾網(wǎng)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；搖床，HTS420，上海赫田科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

剪取染病葉片或莖段（壞死組織）病健交界處，置于培養(yǎng)皿內(nèi)。用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水清洗2 遍，第一遍清洗后倒出無(wú)菌水，第二遍加少量無(wú)菌水清洗。用剪刀將其在無(wú)菌水中剪碎。用無(wú)菌接種環(huán)（或牙簽）在NA培養(yǎng)基表面劃線培養(yǎng)。然后置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)72 h，當(dāng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落時(shí)挑取單菌落于NB 液體培養(yǎng)基中，于260 r/min 的搖床中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水配制成濃度為1×108CFU/mL 的菌懸液，備用。

1.4 致病性的鑒定方法

1.4.1 病原菌的分離

選擇播種后培育21～28 d 的2～3 片真葉期番茄幼苗。用打頂法將番茄苗生長(zhǎng)點(diǎn)剪斷，選取兩片較大葉片，用剪刀剪一刀，噴菌懸液，然后保濕，葉片濕度保持在90%以上，以利于發(fā)病[5]。接種后14 d 開(kāi)始觀察發(fā)病情況，如果接種潰瘍病菌的番茄植株均不同程度出現(xiàn)葉片萎蔫變黃、維管束變軟、莖壞死、植株死亡等典型細(xì)菌性潰瘍病癥狀時(shí)，認(rèn)為此病菌即是番茄死秧的致病菌。如果接種后14～28 d 內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)番茄潰瘍病的發(fā)病癥狀，認(rèn)為此病菌不是致病菌，要選擇新的單菌落做成菌懸液，重新做致病性鑒定[6]。

1.4.2 致病性的分子鑒定

取致病性鑒定成功后的單菌落，按照Dreier[6]報(bào)道的番茄細(xì)菌性潰瘍病菌一對(duì)特異性引物Cmm 5、Cmm 6（引物序列：Cmm 5 為5＇-GCGAATAAGCCCATAT-CAA-3＇；Cmm 6 為5＇CGTCAGGAGGTCGCTA-ATA-3＇），對(duì)1.4.1中分離物的菌懸液直接進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)采用25 μL 體系，包括細(xì)菌單菌落，10×PCR 緩沖液（含15 mmol/L Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL（每種dNTP 終濃度為200 μmol/L），10 μmol/L 上下游引物各1 μL（終濃度為200 nmol/L），5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.2 μL，加超純水至終體積為25 μL。

PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35 次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外燈下觀測(cè)是否得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。如果得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，認(rèn)為此病菌即為番茄細(xì)菌性潰瘍病。

1.5 致病菌的鑒定方法

1.5.1 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃濕熱滅菌20 min。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（potato sucrose agar，PSA）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.5.2 病原菌的分離

將感病的番茄組織（根莖處）用75%酒精擦洗干凈，投入3%次氯酸鈉溶液中消毒，在病健組織交界處用消毒的解剖刀切取1～2 mm 的病組織小塊，然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，最后用消毒的鑷子將組織小塊轉(zhuǎn)移到PDA 培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿放一塊病樣組織塊，將培養(yǎng)皿放入28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3 致病性鑒定

取適量的番茄種子，用3%次氯酸鈉稀溶液浸泡消毒，然后用清水投洗，藥劑除干凈后，再用50～60 ℃的溫水浸種30 min 左右，撈出后用清水浸種，用紗布將種子包好，然后放置到28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，定期投洗，待胚根露出白頭后開(kāi)始播種。將種子播到滅菌的育苗土中，待2～3 片真葉展平時(shí)，用濃度為105個(gè)孢子/mL 的孢子懸浮液浸根接種，放置到相對(duì)濕度大于85%的保濕棚中，7 d 后進(jìn)行病害調(diào)查[7-8]。對(duì)發(fā)病植株按照柯赫氏法則進(jìn)行病原菌再次分離與鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧地區(qū)番茄死秧的致病菌確定

一是番茄潰瘍病。遼寧省內(nèi)主要番茄產(chǎn)區(qū)采集的番茄潰瘍病樣，并從中分離獲得純化菌株。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，證實(shí)所得菌株均為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Cmm）。這與其它地區(qū)所報(bào)道的番茄潰瘍病菌一致[7-8]。然而，本鑒定方法采集的樣本僅來(lái)自遼寧省，存在一定局限性。但引起番茄潰瘍病的病原菌并沒(méi)有生理小種分化，只是致病力有所差異。這與前人的研究基本一致[9-11]。二是番茄枯萎病和根腐病。首先，通過(guò)觀察植株的表現(xiàn)癥狀，番茄整株萎蔫，觀察近地面莖部腐爛程度，莖基部腐爛初步認(rèn)定為根腐病，枯萎病莖基部不腐爛，剖開(kāi)近地面的莖，如果維管束變褐，初步認(rèn)定是枯萎病，枯萎病只有近地面部分維管束變褐而不是整個(gè)植株維管束都變褐。然后通過(guò)顯微鏡鏡檢認(rèn)定是鐮刀菌，最后通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子鑒定。

2.2 遼寧地區(qū)番茄死秧致病菌的致病性

2.2.1 病原菌的形態(tài)觀察

發(fā)病菌株在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)5 d，挑取菌絲轉(zhuǎn)移至PSA 培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)，4 d 后觀察菌落形態(tài)及顏色的變化，記錄菌落直徑；觀察大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形狀及著生方式，產(chǎn)孢細(xì)胞形態(tài)特征，分生孢子座的產(chǎn)生等情況，測(cè)量30～50 個(gè)大型分生孢子和小型分生孢子的長(zhǎng)度和寬度[12-13]。

2.2.2 病原菌及病害的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

發(fā)病菌絲在PSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d 后，菌落平均直徑為4.0 cm，菌株間存在差異，氣生菌絲絨狀或氈狀，白色或粉色，常帶有紫色或紅色。小型分生孢子較多，卵形或腎形，0～1 個(gè)隔膜，假頭狀著生在產(chǎn)孢細(xì)胞上，大小5～11.5 μm×2～4 μm。大型分生孢子美麗型，較勻稱(chēng)，基細(xì)胞足跟明顯，多數(shù)為3～4 個(gè)隔膜，大小13～38 μm×2.3～4.5 μm。厚垣孢子頂生或串生，球形。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，較短，單生或具分枝。表現(xiàn)出尖孢鐮刀菌的特征，初步鑒定為番茄枯萎病。

如果發(fā)病菌絲在PSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d 后，菌落平均直徑為3.9 cm，氣生菌絲較少，薄絨狀，白色至淺灰色；背面在菌落中心形成褐色。小型分生孢子數(shù)量多，假頭狀著生，卵形或腎形，大小5.5～11 μm×2.2～4 μm。大型分生孢子馬特型，兩端較鈍，頂胞稍彎。2～8 個(gè)隔膜，大小10～60 μm×3～4.9 μm。厚垣孢子球形，單生、對(duì)生、頂生或串生。產(chǎn)孢細(xì)胞較長(zhǎng)，長(zhǎng)筒形，單瓶梗，大多數(shù)瓶梗長(zhǎng)于50 μm，可達(dá)到200 μm?？僧a(chǎn)生土黃色分生孢子座。表現(xiàn)出茄病鐮刀菌的特征，初步鑒定為番茄根腐病。

（2）分子鑒定

選取51 株代表菌株進(jìn)行分子鑒定。采用CTAB 法提取菌株基因組DNA。利用真菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）通用引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：模板DNA 2 μL（10～50 μg/L），ITS1 和ITS4 引物各1 μL（10 μmol/L），Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送測(cè)序公司測(cè)序。通過(guò)NCBI 核酸數(shù)據(jù)中的BLAST 程序，提交測(cè)定得到的ITS-r DNA 序列與GENBANK 中核酸序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)經(jīng)形態(tài)鑒定的種類(lèi)進(jìn)行分子驗(yàn)證[14]，進(jìn)而鑒定為番茄枯萎病和根腐病。

3 番茄死秧的綜合防控措施

3.1 選用抗病或耐病品種

選用抗病或耐病品種是植物病害防治最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一。選擇抗枯萎病和根腐病的番茄品種，如‘維也納F1’‘奧地利2 號(hào)’‘吉麗2 號(hào)’‘羅拉’等。

3.2 種子消毒

種子消毒是防治番茄潰瘍病的有效途徑之一。先把種子放在35～38 ℃溫水預(yù)熱8～10 min，后放在55 ℃熱水浸種30 min，待水溫下降到室溫再浸泡20 min，清洗干凈，于25～28 ℃恒溫箱催芽；或用0.5%的消毒劑1 號(hào)浸泡種子1 h，撈出后用清水沖洗30 min 后播種；或用3%次氯酸鈉浸種20 min 后用清水洗凈藥液，稍晾干后再催芽播種。

3.3 藥劑防治

在定植時(shí)，使用防治鐮刀菌和細(xì)菌的藥劑蘸根或灌根，可選用甲霜·噁霉靈加四霉素灌根或者咯菌腈加硫酸銅鈣灌根。定植后10～15 d 使用以上藥劑灌根一次。定植后25～30 d 使用以上藥劑再灌根一次，防治效果非常好。

根結(jié)線蟲(chóng)可以通過(guò)對(duì)不同殺線蟲(chóng)藥劑單劑和復(fù)配藥劑的篩選，篩選出遼寧地區(qū)防治線蟲(chóng)效果比較好的藥劑是41.7%氟吡菌酰胺（路富達(dá)）、5%氟鈴脲+30%噻蟲(chóng)胺、3%辛硫磷+5%阿維菌素。

3.4 培育健壯植株

培育健壯植株是解決土傳病害的一種常見(jiàn)方法，也是植株抵御外界病原菌侵染的一種有效方法[15]。從蔬菜栽培角度，防治病害最實(shí)用的方法就是培育健壯植株，提高植株免疫力。首先要培育健壯的苗，其次是培養(yǎng)發(fā)達(dá)的根系，最后在植株生長(zhǎng)期調(diào)節(jié)好莖葉和果實(shí)之間的平衡生長(zhǎng)。

3.5 嫁接

嫁接是防治土傳病害最主要的措施之一[16-18]。選擇抗鐮刀菌的番茄砧木嫁接可以降低枯萎病和根腐病的發(fā)生。由于番茄嫁接常用的砧木是番茄，篩選抗病砧木比較困難，嫁接成本也高，所以番茄嫁接技術(shù)在遼寧省內(nèi)應(yīng)用并不廣泛。

3.6 土壤消毒

土壤消毒是防治土傳病害、細(xì)菌性病害和根結(jié)線蟲(chóng)的重要方式。目前生產(chǎn)中比較常用的土壤消毒劑是氰胺化鈣、棉隆和威百畝。氰氨化鈣作為一種高效的土壤消毒劑，可有效地防治鐮刀菌屬引起的番茄枯萎病、根腐病和線蟲(chóng)。棉隆是一種光譜性的土壤熏蒸、消毒劑，低毒、使用范圍廣，在土壤中能分解出異硫氰酸甲酯、甲醛和硫化氫等，這些氣體能迅速擴(kuò)散至土壤團(tuán)粒間，能殺滅土壤中的細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)。威百畝是一種低毒、高效、使用范圍廣的農(nóng)藥，在土壤中降解產(chǎn)生異硫氰酸甲酯，能有效殺滅土壤中的真菌、細(xì)菌和線蟲(chóng)[19]。使用氰氨化鈣和棉隆熏蒸消毒時(shí)，注意澆水不易過(guò)多，土壤含水量60%～70%即可，土壤含水量過(guò)多，氣體在土壤里不易流動(dòng)，影響消毒效果。土壤消毒還需要盡量提高棚內(nèi)溫度和土壤溫度、延長(zhǎng)消毒時(shí)間，提高土壤消毒劑的利用率和使用效果。

3.7 施用生防菌劑

生防菌劑作為一種環(huán)境友好型的防治土傳病害的方法，已經(jīng)在生產(chǎn)中被廣泛的應(yīng)用。目前遼寧地區(qū)生產(chǎn)中應(yīng)用比較多的是熒光假單胞桿菌500～670 g/667 m2，M22 枯草芽孢桿菌500 g/667 m2[20]，哈茨木霉菌T～22 用量1 000 g/667m2，l0 億孢子枯草芽孢桿菌可濕性粉劑500 倍液灌根。

4 小結(jié)

番茄死秧問(wèn)題已成為阻礙遼寧省設(shè)施番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題之一，部分地區(qū)、部分番茄種植戶談番茄色變，遇到番茄死秧，束手無(wú)策。遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜栽培、植物保護(hù)、土壤與肥料專(zhuān)家聯(lián)合攻關(guān)，對(duì)遼寧省番茄死秧問(wèn)題進(jìn)行了細(xì)致的研究與分析，基本摸清了遼寧省番茄死秧的主要原因，并提出了科學(xué)的防治方法。解決遼寧地區(qū)番茄死秧問(wèn)題，重在通過(guò)選擇抗病品種、種子消毒，定植后的藥劑防治、培育健壯植株、選擇抗病砧木嫁接、土壤消毒及有效利用生防菌劑的綜合防治措施。