宏基因組學(xué)技術(shù)在蔬菜發(fā)酵中的應(yīng)用

張 令，羅 根，楊 巖，王泳儼，張美霞

（1. 重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶 404120；2. 重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 402160）

1 發(fā)酵蔬菜發(fā)展概況

發(fā)酵蔬菜歷史悠久，種類多樣。四川泡菜、東北酸菜和東北辣白菜等都是日常生活中普遍食用的發(fā)酵蔬菜[1]。發(fā)酵蔬菜含豐富的益生菌、膳食纖維、維生素及微量元素等[2]。在發(fā)酵過程中利用原料本身攜帶的微生物，在密封厭氧的條件下進(jìn)行無氧呼吸分解有機(jī)物產(chǎn)生相應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)，使產(chǎn)品具有獨特的風(fēng)味、品質(zhì)和營養(yǎng)價值，并深受廣大百姓的喜愛[3-4]。

不同地區(qū)具有各自特色的發(fā)酵蔬菜，其制作工藝及環(huán)境條件的不同，使其在發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)、代謝途徑及品質(zhì)特征的變化也產(chǎn)生差異[5]。在蔬菜發(fā)酵過程中，原料本身含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖及脂肪等有機(jī)物在微生物的作用下進(jìn)行酶解反應(yīng)產(chǎn)生氨基酸、單糖、脂肪酸和多酚類化合物，使產(chǎn)品具有獨特的風(fēng)味及豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[6]。細(xì)菌在發(fā)酵過程中起著重要的作用，蔬菜發(fā)酵過程中高度依賴于天然存在的乳酸桿菌，會隨著發(fā)酵的進(jìn)行不斷占據(jù)主導(dǎo)地位。而蔬菜發(fā)酵過程中也會存在常見的致病菌和腐敗微生物，在蔬菜發(fā)酵初期中存在常見的致病微生物和腐敗微生物，包括鞘氨醇單胞菌、假單胞菌和厭氧菌等，但這些真菌微生物在發(fā)酵早期迅速消失，可能是由于生態(tài)位選擇[7]。因此，為了保證產(chǎn)品質(zhì)量安全問題，必須對產(chǎn)品品質(zhì)檢測問題進(jìn)行解決。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，發(fā)酵食品微生物的檢測已不完全依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)皿技術(shù)，高通量測序技術(shù)以高通量、低成本等優(yōu)勢在一定程度上不僅彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)皿技術(shù)低效率、成本高等缺陷，還對產(chǎn)品質(zhì)量檢測的問題得到了很好的解決[8]。宏基因組測序技術(shù)以高效性、準(zhǔn)確性強(qiáng)等優(yōu)勢能系統(tǒng)地挖掘微生物的菌系構(gòu)成，并能有效地注釋發(fā)酵菌系的代謝功能[9]。目前，宏基因組測序技術(shù)已應(yīng)用于食品微生物、腸道微生物等領(lǐng)域的微生物群落研究中，為微生物群落結(jié)構(gòu)的分析作出了巨大的貢獻(xiàn)。以高通量測序技術(shù)的宏基因組技術(shù)為起點，綜述了宏組學(xué)技術(shù)對四川泡菜、東北酸菜和東北辣白菜不同腌制環(huán)境中微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)和潛在基因功能的研究進(jìn)展，以及各地區(qū)微生物菌群與品質(zhì)之間的相關(guān)性分析，為宏基因組學(xué)技術(shù)在蔬菜發(fā)酵行業(yè)中微生物的檢測和產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)化提供理論支撐。

2 宏基因組學(xué)技術(shù)

2.1 宏基因組學(xué)技術(shù)概述

宏基因組學(xué)技術(shù)是一種基因組檢測的新興手段。組學(xué)技術(shù)可從分子層面解釋宏觀表象與基因、代謝等之間的關(guān)系，與傳統(tǒng)方法相比具有顯著的優(yōu)勢[10]。Handelsman J 等人[11]第1 次將宏基因組定義為環(huán)境中全部微生物群的所有遺傳物質(zhì)。其是以特定環(huán)境中的總DNA 為對象，通過對研究微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系，并進(jìn)行比較分析來發(fā)掘潛在的生物學(xué)意義[12]。

在宏基因組學(xué)技術(shù)檢測成本逐漸降低和測序準(zhǔn)確度不斷提升下，微生物群落的研究逐漸進(jìn)入成熟階段。該技術(shù)克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)皿技術(shù)只分離少數(shù)可培養(yǎng)微生物的困境，并且測序速度快、準(zhǔn)確性強(qiáng)，更有利于低豐富群落物種的鑒定，從而提高微生物群落研究的完整性[12]。不僅提高了研究效率，還能得到豐富的微生物群落結(jié)構(gòu)變化數(shù)據(jù)。通過生物信息分析后，可進(jìn)行物種豐度、基因預(yù)測、基因功能注釋等分析。目前，宏基因組測序廣泛應(yīng)用于土壤、人體、動物腸道、植物等領(lǐng)域，并取得了顯著的成就[13]。例如，研究冬蟲夏草對大鼠腸道菌群的影響中，通過對冬蟲夏草注射和空白組大鼠的糞便進(jìn)行宏組學(xué)測序，LEfSe 差異性分析和KEGG 功能注釋顯示出注射冬蟲夏草的大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與代謝途徑發(fā)現(xiàn)明顯變化，結(jié)論得出注射冬蟲夏草夠促進(jìn)益生菌生長，蟲草多糖也可能會對腸道菌群產(chǎn)生影響，KEGG 顯示CCs 可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群增強(qiáng)抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)能力[14]。研究宏基因組學(xué)第2 代測序技術(shù)與傳統(tǒng)實驗室培養(yǎng)在膿毒癥病原學(xué)診斷中進(jìn)行對比，把入選的膿毒癥患者的標(biāo)本同時送檢宏基因組學(xué)第2 代測序技術(shù)和實驗室細(xì)菌培養(yǎng)。經(jīng)過對結(jié)果進(jìn)行對比分析后發(fā)現(xiàn)，宏組學(xué)技術(shù)在感染性疾病病原體的診斷方面時間更短、陽性率更高，并且在罕見病原體診斷準(zhǔn)確性有顯著優(yōu)勢，可縮短患者診斷時間[15]。研究黃酒對D -半乳糖致衰老小鼠模型腸道微生物菌群的影響中，通過在黃酒的干預(yù)下對腸道細(xì)菌16S rDNA 基因進(jìn)行測序。結(jié)果表明，在黃酒的干預(yù)下致衰老鼠抗氧化酶活性升高，丙二醛下降，并顯著干預(yù)了致衰老鼠的認(rèn)知能力和微生物菌群結(jié)構(gòu)[16]。

宏基因組學(xué)技術(shù)以高效性、低成本等優(yōu)點可以解決許多微生物不可培養(yǎng)的問題，在一定程度上也打破了人們對于微生物菌群認(rèn)知的局限性，促進(jìn)了人們在宏觀上對微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)及演替相互作用上的深入研究，并有利于人們能夠更好地了解微生物環(huán)境的群落結(jié)構(gòu)。

2.2 高通量測序技術(shù)在宏基因組學(xué)中的應(yīng)用

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，其技術(shù)特點以高通量、高效率、低耗材等優(yōu)勢在微生物研究領(lǐng)域中迅速發(fā)展[17]。20 世紀(jì)70 年代中期，Sanger 建立的雙脫氧末端終止法被廣泛使用，其核心技術(shù)采用96 孔毛細(xì)管電泳。第1 代測序技術(shù)具有讀長較長、準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%的特點，但是仍存在通量小、耗時長和成本高等技術(shù)缺點[18]。第2 代測序技術(shù)是以高通量測序技術(shù)為依托，包括焦磷酸合成法、磁珠的連接測序法、邊合成邊測序法，其核心技術(shù)采用邊連接合成邊測序，技術(shù)特點與第1 代Sanger 測序技術(shù)相比在一定程度上彌補(bǔ)通量低和成本高等缺陷，并很快在不同領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[19]。而第3 代測序技術(shù)是以SMRT 芯片為測序載體，依賴零級模波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)觀察核酸的聚合。其技術(shù)特點集通量高、低成本等多種優(yōu)點于一身的新型測序技術(shù)，為深入研究微生物群落提供了新的途徑[20]。

2.3 宏基因組學(xué)技術(shù)在發(fā)酵食品微生物群落中的應(yīng)用

發(fā)酵食品種類多樣，酒精飲料、乳制品、豆制品、醬腌菜、調(diào)味品等都是發(fā)酵食品中常見的產(chǎn)品[21]。由于發(fā)酵食品中的微生物是一個復(fù)雜集體，在發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中微生物群落結(jié)構(gòu)特征、演替變化規(guī)律和功能基因的研究尚少，導(dǎo)致食品安全問題在日常生活中頻頻出現(xiàn)。

發(fā)酵食品中品質(zhì)和風(fēng)味等重要表觀因素受微生物菌群結(jié)構(gòu)變化影響較大[22]。發(fā)酵食品在后熟過程中的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等物質(zhì)為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，形成氨基酸、醇、醛、酮、酯等成分并不斷發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，相互協(xié)同作用使發(fā)酵食品具有特殊的色香味，而發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)的形成主要包括原料基質(zhì)的水解反應(yīng)、微生物代謝產(chǎn)物的合成反應(yīng)或酶催化各分子進(jìn)行的生化反應(yīng)，所以對微生物菌群的研究有助于優(yōu)化產(chǎn)品品質(zhì)[23]。例如，以不同發(fā)酵階段的羊肉香腸為研究對象，分別采用高效液相色譜法和宏基因組技術(shù)測定發(fā)酵過程中生物胺含量變化和微生物群落演替，并對發(fā)酵微生物和酶的豐度與功能進(jìn)行注釋和相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品中8 種生物胺隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中精氨酸含量最高。樣品中鑒定出大量微生物，細(xì)菌中的葡萄球菌屬、弧菌屬、酒球菌屬和嗜血桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。通過Spearman 相關(guān)性分析顯示出生物胺與微生物部分細(xì)菌屬具有相關(guān)性，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫分析得出生物胺的代謝與微生物和酶具有相互作用[24]。因此，宏基因組測序數(shù)據(jù)能夠直觀地對發(fā)酵食品微生物群落多樣性進(jìn)行解析。同時，通過生信分析數(shù)據(jù)處理后能夠?qū)ξ⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)及功能基因代謝途徑變化的相關(guān)性分析研究起到重要作用。

目前，隨著宏基因組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，已經(jīng)在許多領(lǐng)域上挖掘出尚未發(fā)現(xiàn)的微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律、功能性基因，以及更多不可培養(yǎng)微生物，為生物發(fā)酵工程等微生物應(yīng)用領(lǐng)域研究提供巨大貢獻(xiàn)。但是在蔬菜發(fā)酵行業(yè)微生物研究領(lǐng)域中仍存在一些難以解決的問題，并限制了蔬菜發(fā)酵行業(yè)的迅速發(fā)展。所以，該技術(shù)在蔬菜發(fā)酵中是一個很有前景但仍尚未充分開發(fā)的領(lǐng)域。

3 宏基因組學(xué)技術(shù)在蔬菜發(fā)酵中的應(yīng)用

在發(fā)酵蔬菜漫長的研究過程中，發(fā)現(xiàn)研究領(lǐng)域中主要涉及產(chǎn)品的品質(zhì)、風(fēng)味及微生物菌群結(jié)構(gòu)等[25]。產(chǎn)品品質(zhì)的研究主要有亞硝酸鹽、蛋白質(zhì)、氨基酸、粗纖維、總酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等，蛋白質(zhì)、粗纖維在發(fā)酵過程中會受到微生物的作用下分解為相應(yīng)的氨基酸等物質(zhì)，并釋放一定的能量改變發(fā)酵過程中封閉的內(nèi)部條件，改變微生物衍生替代，從而微生物代謝產(chǎn)生的物質(zhì)會對產(chǎn)品的風(fēng)味造成相應(yīng)的影響。近年來，宏基因組學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于蔬菜發(fā)酵過程中的微生物菌群研究，并產(chǎn)生了一定的成果。

3.1 在四川泡菜生產(chǎn)中的應(yīng)用

四川泡菜是一種鹽泡漬發(fā)酵蔬菜，其含有豐富膳食纖維及B 族維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[26]。在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乳酸，能刺激消化腺分泌消化液，從而促進(jìn)食物消化吸收。泡菜大多味道酸甜、爽口，能提升食欲，且泡菜中的生蒜、生姜、辣椒等成分不僅能殺菌，還能促進(jìn)身體新陳代謝，有促排汗的作用。泡菜的熱量較低，含有的膳食纖維可加快腸道蠕動，預(yù)防便秘[27]。

陸曉晴等人[28]通過對25 ℃泡菜自然發(fā)酵過程中微生物菌群消長規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)泡菜的可溶性蛋白質(zhì)經(jīng)過幾天，可溶性蛋白持續(xù)下降，但速度明顯減緩，逐漸到達(dá)一個穩(wěn)定狀態(tài)。史梅莓等人[29]通過人工接種3 種單菌及多菌對多輪發(fā)酵四川泡菜品質(zhì)的影響中發(fā)現(xiàn)，接種后的四川泡菜可以加快發(fā)酵速度，品質(zhì)更加穩(wěn)定。錢楊等人[30]以4 種原料（蘿卜、豇豆、辣椒及混合蔬菜） 分別發(fā)酵四川泡菜，采用高通量測序技術(shù)對不同蔬菜原料四川泡菜中微生物多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，辣椒泡菜中的微生物多樣性最豐富，豇豆泡菜中微生物多樣性最低，蘿卜泡菜和混合泡菜中共同含有5 種細(xì)菌屬。在分析微生物菌群與理化因子的相關(guān)性的研究中顯示，辣椒泡菜中微生物與pH 值相關(guān)性最強(qiáng)，豇豆泡菜中微生物與醋酸相關(guān)性最強(qiáng)。在發(fā)酵過程中高濃度鹽和微生物菌株的產(chǎn)酸能力能夠保證產(chǎn)品的品質(zhì)，所以在泡菜發(fā)酵過程中產(chǎn)酸菌株為代表的鹽球菌（Halococcus）、醋酸桿菌（Acidobacteriota） 和乳酸菌（Lactobacillus） 等可作為重要檢測指標(biāo)[31]。Mi T 等人[32]通過宏基因組測序技術(shù)研究鹽濃度對自然發(fā)酵蘿卜泡菜品質(zhì)及微生物多樣性的影響，在對泡菜中微生物菌群多樣性的分析中發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（Firmicu-tes）、變形菌門（Proteobacteria） 和子囊菌門（Ascomycota）為主要菌門，魏斯氏菌屬和乳桿菌屬（Lactobacillus）為優(yōu)勢菌屬。在風(fēng)味物質(zhì)檢測出多種物質(zhì)后與微生物菌群進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌屬與風(fēng)味物質(zhì)顯著性相關(guān)，而真菌與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性較弱。雖然乳酸桿菌在發(fā)酵過程中起到至關(guān)重要的作用，但是在發(fā)酵蔬菜中品質(zhì)是由微生物之間相互作用決定的。發(fā)酵過程中微生物菌群組成存在明顯差異，所以品質(zhì)也會受到不同時期微生物菌群豐度的影響。這些研究結(jié)果，有助于在理解發(fā)酵蔬菜中微生物菌群的分布及與品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性[33]。

3.2 在東北辣白菜生產(chǎn)中的應(yīng)用

東北辣白菜以大白菜為主，通過加入食鹽、白砂糖、辣椒粉等佐料腌制而成[34]。其酸甜的口感可以促進(jìn)人體內(nèi)腸胃內(nèi)蛋白質(zhì)的分解與吸收，開胃健食。辣白菜中含有維生素、胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有延緩衰老和皮膚老化的作用，其含有大量的粗纖維能夠促進(jìn)人體腸胃功能、緩解便秘等功能。辣白菜也含有乳酸菌，其能夠抑制有害細(xì)菌的繁殖，調(diào)節(jié)腸胃微生物菌群[35]。

劉長蕾等人[36]研究以朝鮮族辣白菜為原料，在發(fā)酵過程中微生物菌群變化。結(jié)果顯示，明串珠菌是蔬菜發(fā)酵初期的主要優(yōu)勢微生物，在辣白菜中發(fā)酵20 d 后消失。但乳酸菌是辣白菜和酸菜整個發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌屬。Chang L X 等人[37]以東北地區(qū)辣白菜為原料，采用高通量測序分析其微生物菌群多樣性，研究微生物菌群與品質(zhì)相關(guān)理化性質(zhì)及其相關(guān)性分析，結(jié)果表明優(yōu)勢門為變形菌門（Proteobacteria） 和厚壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢屬為乳酸桿菌屬、泛菌屬、魏氏菌屬和假單胞菌屬。乳酸桿菌與魏氏菌屬與pH 值和鹽度呈正相關(guān)，與色胺呈負(fù)相關(guān)，假單胞菌與鹽度呈負(fù)相關(guān)。其中，發(fā)酵過程中乳酸菌和芽孢桿菌可以同時消耗葡萄糖等碳水化合物，分解發(fā)酵蔬菜產(chǎn)生主要的乳酸和乙酸。另外，根據(jù)微生物菌群與品質(zhì)相關(guān)理化指標(biāo)的相關(guān)性，可得出乳酸菌含量的增加會產(chǎn)生大量的乳酸，普氏菌屬產(chǎn)生乙酸和琥珀酸，羅斯氏菌屬分離出多種糖來生產(chǎn)丁酸，產(chǎn)生的酸進(jìn)而可促進(jìn)發(fā)酵過程的進(jìn)行保證產(chǎn)品的品質(zhì)[38]。楊柳等人[39]研究以朝鮮族辣白菜為原料，在自然發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)與主要呈味物質(zhì)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵時間的延長，主要呈味物質(zhì)的含量顯著增加。宏基因組學(xué)測序技術(shù)結(jié)果顯示在不同發(fā)酵階段微生物菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，并與呈味物質(zhì)呈正相關(guān)。因此，通過對酸度和鹽濃度的研究過程，可以更好地分析在發(fā)酵過程中微生物菌群在不同發(fā)酵時期中發(fā)揮的主要作用。

3.3 在東北酸菜生產(chǎn)中的應(yīng)用

東北酸菜是芥菜通過晾曬后放入殺菌消毒罐中，加入適量食鹽、米醋等佐料用鵝卵石壓緊密封保存1 個月即可[40]。酸菜中含有大量的膳食纖維，對預(yù)防和治療便秘非常有效。酸菜含有的有益菌可以抑制腸道中致病菌的生長，具有調(diào)整腸道菌群、預(yù)防腸炎及結(jié)腸炎類疾病的作用[41]。

孟繁博等人[42]通過收集11 種芥菜作為酸菜的發(fā)酵原料，研究不同品種芥菜對發(fā)酵酸菜品質(zhì)的影響中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵第8 天中，全部樣品的總酸均超過0.35 g/100 g?！八脑虑唷敝芯SC 的含量最高，“鎮(zhèn)江青菜”中還原糖含量最高。孫煒寧[43]應(yīng)用16Sr DNA高通量測序技術(shù)首次在東北酸菜中鑒定出屬于腸桿菌的果膠桿菌（Pectobacterium） 和拉恩氏菌（Rahnella）。賈晶晶等人[44]以不同鹽濃度的酸菜為原料，通過高通量測序技術(shù)對不同鹽濃度的樣品進(jìn)行微生物菌群多樣性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品在門水平上，Proteobacteria（變形菌門） 和Firmicutes（厚壁菌門） 均為優(yōu)勢菌門；在屬水平上，Enterobacter（腸桿菌屬） 和Lactococcus（乳球菌屬） 為優(yōu)勢菌屬。周姝靜等人[45]以東北酸菜為材料，通過Illumina Novaseq 測序平臺進(jìn)行高通量測序研究東北酸菜發(fā)酵前后期細(xì)菌多樣性及差異性變化。研究顯示，樣品前后期微生物菌群差異性變化不大，其具有4 種共同的微生物菌屬為魏斯氏屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）。在通過宏基因組學(xué)測序技術(shù)對東北酸菜和辣白菜的共同研究下，發(fā)現(xiàn)兩者的優(yōu)勢菌門都含有變形菌門（Proteobacteria） 和厚壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢菌屬都含有乳酸桿菌、明串珠菌等，進(jìn)而推測在同一地區(qū)的發(fā)酵蔬菜過程中會受到相同外界因素的影響隨著產(chǎn)生相同主要的發(fā)酵菌株。

4 結(jié)語

如上所述，近年來宏基因組學(xué)技術(shù)已應(yīng)用到發(fā)酵蔬菜領(lǐng)域上，并取得了一定的研究成果。由于宏基因組學(xué)技術(shù)在食品發(fā)酵行業(yè)的應(yīng)用上仍存在一些不足，如測序的成本高、數(shù)據(jù)量龐大，在數(shù)據(jù)分析過程仍存在困難；測序序列片段短等問題也使發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展受到了一定的阻礙。

隨著宏基因組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已有對蔬菜發(fā)酵中的四川泡菜、東北酸菜和東北辣白菜中的微生物群落的研究，并從基因?qū)用娣治霾⑻接懳⑸飳κ卟税l(fā)酵過程中品質(zhì)及風(fēng)味的影響，分析在不同發(fā)酵地區(qū)中微生物受到不同程度的影響下，發(fā)現(xiàn)理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)的測定會影響微生物菌群在整體發(fā)酵過程中的作用，不同地區(qū)的發(fā)酵蔬菜中所含菌屬與品質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性分析，從而建立發(fā)酵蔬菜腌制過程中關(guān)鍵因素之間的相關(guān)性分析模式，為進(jìn)一步優(yōu)化蔬菜發(fā)酵生產(chǎn)工藝和提升產(chǎn)品質(zhì)量提供理論支撐，并為蔬菜發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的工業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。