溫陽(yáng)法調(diào)控失眠大鼠海馬炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡的機(jī)制研究

徐 添,黃春華,官磊瑤,劉浪輝,黃 梅,吳國(guó)燕

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004;2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006)

失眠表現(xiàn)為持續(xù)入睡困難、睡眠維持困難,并伴有日間社會(huì)功能障礙,是成人常見的睡眠障礙疾病,中國(guó)成人失眠發(fā)生率在30%以上[1-3]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,近年來研究證實(shí)失眠可誘發(fā)加重神經(jīng)炎癥,損害海馬神經(jīng)元,影響認(rèn)知記憶功能,長(zhǎng)期的失眠甚至?xí)黾宇净颊J(rèn)知障礙疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。因此,抑制神經(jīng)炎癥、保護(hù)神經(jīng)對(duì)改善失眠引起的認(rèn)知記憶損害、預(yù)防認(rèn)知障礙疾病具有重要意義。目前失眠的治療以認(rèn)知行為療法為主,輔以藥物和物理治療等綜合干預(yù),常用藥物包括苯二氮受體激動(dòng)劑或褪黑素受體激動(dòng)劑[2],但這些藥物的長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生過度鎮(zhèn)靜、耐受性、成癮性和神經(jīng)毒性等諸多不良反應(yīng),可損害學(xué)習(xí)記憶功能[6-7]。中醫(yī)對(duì)失眠病機(jī)的認(rèn)識(shí)多從“邪火亢盛,陰虧血少,神失所用”立論,認(rèn)為其病理變化總屬陽(yáng)盛陰衰,陰陽(yáng)失交。治療常以滋陰清熱、寧心安神為主,遣方用藥多用寒涼之品,鮮有從陽(yáng)虛論治者。然而中醫(yī)治療疾病的優(yōu)勢(shì)在于辨證求因、審因論治,對(duì)陰虛型失眠法當(dāng)滋陰斂陽(yáng),對(duì)陽(yáng)虛型失眠則當(dāng)扶陽(yáng)護(hù)陽(yáng)。但就目前臨床實(shí)際來看,醫(yī)者辨治失眠,多從陰虛陽(yáng)熱入手,很少有慮及陽(yáng)虛者,故而治療中難免有誤。為探索改善失眠的新穎療法,結(jié)合我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),本課題組前期采用溫陽(yáng)法(四逆湯+桂甘龍牡湯)治療陽(yáng)虛失眠,臨床發(fā)現(xiàn)療效顯著,但其能否介導(dǎo)抑制神經(jīng)炎癥、保護(hù)神經(jīng)從而改善睡眠和認(rèn)知功能尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建氯苯丙氨酸(PCPA)誘導(dǎo)的失眠大鼠模型,旨在明確溫陽(yáng)法改善睡眠和認(rèn)知功能的作用機(jī)制,為失眠所致認(rèn)知障礙的發(fā)病原因以及相關(guān)治療方法研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠12只,體重(200±20)g,6～8周齡,購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。本實(shí)驗(yàn)因受疫情影響委托福建安布瑞生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室實(shí)施實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)前,大鼠飼養(yǎng)于福建安布瑞生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)環(huán)境2周,室溫(22±2)℃,濕度(50±10)%,12 h晝夜交替,飼養(yǎng)期間可自由飲水?dāng)z食。實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建安布瑞生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACVC FJABR2022041301)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 四逆湯+桂甘龍牡湯組成:熟附子(先煎)、干姜各10g,炙甘草20g,桂枝10g,白芍20 g,柴胡15 g,枳殼15 g,龍骨、牡蠣各30 g(先煎)。用量按《傷寒論》中桂甘龍牡湯原方用量確定,按不同動(dòng)物劑量折算系數(shù)推算得出。實(shí)驗(yàn)所用中藥飲片及地西泮(浙江醫(yī)藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H33020250,規(guī)格:2.5 mg/片)均購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。將上述中藥按照傳統(tǒng)煎法獲取湯劑,合并2次濾液,以恒溫水浴鍋濃縮成1∶1藥液,生藥濃度為1g/mL,玻璃瓶密閉盛裝,置于冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3主要試劑 白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào):MM-0047R2),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào):MM-0180R2),PCPA(APExBIO,批號(hào):B5036213377BD),RIPA強(qiáng)裂解液(meilunbio,批號(hào):MA0151),蛋白酶抑制劑Cocktail(meilunbio,批號(hào):MB2678),PMSF(凱基,批號(hào):KGP610),蛋白磷酸酶抑制劑復(fù)合物Ⅰ(100×)(meilunbio,批號(hào):MB12707),BCA蛋白定量試劑盒(Thermo,批號(hào):23209),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(meilunbio,批號(hào):MA0159),PAGE凝膠超快速制備試劑盒(meilunbio,批號(hào):MA0382),10%預(yù)染彩虹蛋白marker(meilunbio,批號(hào):MA0342),SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X) (碧云天,批號(hào):P0015L),脫脂奶粉(BBI,批號(hào):A600669-0250),PVDF膜(Millipore,批號(hào):IPVH00010),超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(百賽生物,批號(hào):S6009M),十二烷基硫酸鈉(sigma,批號(hào):151-21-3),TRIS(meilunbio,批號(hào):77-86-1),甘氨酸(meilunbio,批號(hào):56-40-6),HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(proteintech,批號(hào):SA00001-1),HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) (proteintech,批號(hào):SA00001-2),GAPDH(proteintech,批號(hào):60004-I-Ig)。

1.4主要儀器 Morris水迷宮(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司,型號(hào):YKT-5300),離心機(jī)(中國(guó)白洋,型號(hào):B320A),超低溫冷凍儲(chǔ)存箱(中科美菱,型號(hào):DW-HL340),微量冷凍離心機(jī)(貝克曼,型號(hào):Microfuge-22R),熒光定量PCR儀(美國(guó) ABI,型號(hào):7300型),PCR儀(美國(guó)BIO-RAD,型號(hào):PTC100),數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海邦西儀器科技有限公司,型號(hào):HH-52),蛋白垂直電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司,型號(hào):POWER PAC 200),軌道式搖床(杭州米歐儀器有限公司,型號(hào):GS-20),化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司,型號(hào):ChemiDoc Touch),酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-BAD公司,型號(hào):680),電子分析天平(賽多利斯,型號(hào):BS 224 S),磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器,型號(hào):MYP13-2S)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 將12只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、溫陽(yáng)組、地西泮組,每組3只。除空白組大鼠外,其他組大鼠均連續(xù)2 d腹腔注射PCPA 350 mg/kg誘導(dǎo)建立失眠模型,空白組注射等量生理鹽水,以自主活動(dòng)增多提示造模成功。給藥量按成年人60 kg,大鼠用量為人的10倍換算,溫陽(yáng)組給予四逆湯+桂甘龍牡湯10 g/kg灌胃,地西泮組給予地西泮1 mg/kg灌胃,模型組和空白組給予等量生理鹽水灌胃,均每天1次,連續(xù)灌胃7 d。

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 在一個(gè)高35 cm、直徑150cm的水池中裝滿水(染成白色),將一個(gè)直徑12 cm平臺(tái)淹沒在水面以下1 cm處。Morris水迷宮房間光線均勻,且四面墻壁具有明顯不同的標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)采用3 d訓(xùn)練加1 d測(cè)試的方案。在為期3 d的訓(xùn)練中,每天進(jìn)行8次測(cè)試,包括4個(gè)不同位置的隨機(jī)起點(diǎn)入水。在每次試驗(yàn)中,若1 min內(nèi)未找到平臺(tái),則人工引導(dǎo)至平臺(tái)停留20 s,記錄每只大鼠逃避(找到平臺(tái))潛伏期。如果大鼠在1 min內(nèi)未能完成任務(wù),潛伏期標(biāo)記為60 s。計(jì)算每只大鼠每日(8次測(cè)試)的平均逃避潛伏期以及每日成功到達(dá)率。每只大鼠離開水池后,立即用毛巾和加熱燈擦干。經(jīng)過3 d的訓(xùn)練后,在第4天進(jìn)行測(cè)試:移除平臺(tái)(其原始區(qū)域稱為平臺(tái)區(qū)域),讓大鼠自由游泳1 min,記錄目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間和距離、找到目標(biāo)的活動(dòng)時(shí)間和距離,并計(jì)算目標(biāo)象限的游泳距離與總距離之比。

1.6.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)測(cè)試設(shè)備為一個(gè)開放式箱體(100 cm×100 cm×50 cm),在11:00—13:00,將大鼠置入曠場(chǎng),允許其自由探索5 min, 記錄其水平穿越方格數(shù)和站立次數(shù)。

1.6.3海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu) 將大鼠海馬組織進(jìn)行石蠟包埋、切片,放入-20℃冰箱中預(yù)冷30 min,二甲苯中脫蠟10 min,換用新鮮的二甲苯,再脫蠟10 min,無水乙醇10 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min,蒸餾水10 min;蘇木素染色5 min,水洗,直至無染色液流出;再浸入PBS中返藍(lán)5 min;伊紅染色15 s,浸入95%乙醇中快速脫色3 s,再浸入無水乙醇中快速脫色2 s,水洗,直至無染色液流出;浸入無水乙醇中脫水10 min,浸入二甲苯中透明10 min,中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察各組海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。

1.6.4海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況 取海馬組織石蠟包埋切片,放入-20 ℃冰箱中預(yù)冷30 min,脫蠟,然后滴加適量的1x蛋白酶K工作液,37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min,PBS漂洗3次后按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。綠色熒光為凋亡細(xì)胞,Dapi染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.6.5血清IL-1β、TNF-α水平 取大鼠血清,采用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平。

1.6.6海馬組織中Caspase-3和Bcl-2 mRNA表達(dá)情況 采用qRT-PCR法檢測(cè):取海馬組織細(xì)胞,加入1mL的RNAiso Plus裂解細(xì)胞并滅火RNA酶,分離核酸蛋白復(fù)合物,轉(zhuǎn)移至EP管中離心后加入20 μL的DEPC水,充分溶解離心管底部的RNA,使用RNA定量?jī)x測(cè)定RNA濃度及純度,按照下列反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。去基因組DNA反應(yīng):模板RNA(1 μg),gDNA Purge 1 μL,gNase Free Water至10 μL,42 ℃孵育5 min,反應(yīng)結(jié)束后冰上放置;反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):第一步反應(yīng)液 10 μL,2×NovoScript?Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 10 μL,50 ℃孵育15 min,75 ℃孵育5 min,終止反應(yīng),產(chǎn)物貯存于-20 ℃;PCR反應(yīng)體系共20 μL,反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s,56 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 38 s,95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。Caspase-3、Bcl-2及GAPDH基因序列見表1。采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行基因表達(dá)分析(相對(duì)定量)。

表1 Caspase-3、Bcl-2及GAPDH 引物序列

1.6.7海馬組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 稱取海馬組織50 mg,加預(yù)冷的蛋白裂解液,置冰上充分研磨,4 ℃下12 000 r/min離心30 min,取上清液,按BCA蛋白質(zhì)試劑盒檢測(cè)各組蛋白量。用Western blot法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)量,每孔上樣量為50 μg,進(jìn)行12% SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,室溫封閉1 h,加入一抗?jié)舛确謩e為1∶300和1∶200,置4 ℃過夜,洗膜,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作用2 h,ECL顯色,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值,內(nèi)參為β-actin。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)繪圖采用GraphPad Prism 9.3.0軟件。各組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組大鼠目標(biāo)象限時(shí)間、目標(biāo)象限的游泳距離、距離比均明顯短于空白組(P均<0.05),找到目標(biāo)的活動(dòng)時(shí)間和距離均明顯長(zhǎng)于空白組(P均<0.05)。溫陽(yáng)組和地西泮組大鼠目標(biāo)象限時(shí)間、目標(biāo)象限的游泳距離、距離比均明顯長(zhǎng)于模型組(P均<0.05),找到目標(biāo)的活動(dòng)時(shí)間和距離均明顯短于模型組(P均<0.05),且溫陽(yáng)組各指標(biāo)變化較地西泮組更加顯著(P均<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 空白組和失眠各組大鼠水迷宮平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 空白組和失眠各組大鼠水迷宮記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組大鼠的水平穿越方格數(shù)和站立次數(shù)均明顯多于空白組(P均<0.05);溫陽(yáng)組大鼠的水平穿越方格數(shù)和站立次數(shù)均明顯少于模型組(P均<0.05);地西泮組大鼠的水平穿越方格數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),站立次數(shù)明顯少于模型組(P<0.05);溫陽(yáng)組大鼠的水平穿越方格數(shù)和站立次數(shù)與地西泮組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 空白組和失眠各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3各組大鼠海馬組織HE染色表現(xiàn) 與空白組比較,模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu)損傷比較嚴(yán)重,細(xì)胞層次變少,排列比較紊亂,分布不均勻,細(xì)胞間隙增大,存活細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞體皺縮變小,胞核固縮而深染,形狀不規(guī)則;與模型組比較,溫陽(yáng)組和地西泮組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損害相對(duì)減輕,細(xì)胞排列稍紊亂,層次增多,存活細(xì)胞數(shù)目增多,有少量細(xì)胞皺縮。見圖4。

圖4 空白組和失眠各組大鼠海馬組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠海馬組織TUNEL染色表現(xiàn) 4組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡情況無明顯差異。見圖5。

圖5 空白組和失眠各組大鼠海馬組織TUNEL染色表現(xiàn)(×200)

2.5各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較 模型組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平均明顯高于空白組(P均<0.05)。溫陽(yáng)組和地西泮組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05),溫陽(yáng)組血清IL-1β和TNF-α水平與地西泮組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖6。

2.6各組大鼠海馬組織中Caspase-3及Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組比較,模型組大鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05),海馬組織中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,溫陽(yáng)組和地西泮組大鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),海馬組織中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);溫陽(yáng)組大鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量與地西泮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,海馬組織中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于地西泮組(P<0.05)。見圖7。

圖7 空白組和失眠各組大鼠海馬組織中Caspase-3及Bcl-2mRNA表達(dá)情況

2.7各組大鼠海馬組織中Caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)情況 與空白組比較,模型組大鼠海馬組織中Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05),海馬組織中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,溫陽(yáng)組和地西泮組大鼠海馬組織中Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),海馬組織中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);溫陽(yáng)組大鼠海馬組織中Caspase-3 和Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量與地西泮組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖8。

圖8 空白組和失眠各組大鼠海馬組織中Caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)情況

3 討 論

神經(jīng)炎癥相關(guān)的神經(jīng)元凋亡是失眠的重要中樞機(jī)制之一。近年來抗失眠藥物的探索逐漸突出對(duì)神經(jīng)元保護(hù)和抗凋亡作用的研究[8-9],多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),睡眠剝奪后老鼠血清、脾臟、肝臟中促炎性因子IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯升高,且海馬神經(jīng)元損傷程度與其表達(dá)量存在明顯的相關(guān)性[10-12]。Zhang等[13]研究顯示,大腦中的藍(lán)斑神經(jīng)元(LCns)在失眠中存在線粒體壓力,可導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?Sirtuin- 3(SirT3) 活性降低,凋亡水平增加,最終導(dǎo)致LCns的退化。此外,神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)是造成神經(jīng)元凋亡的直接誘因,持續(xù)神經(jīng)炎性反應(yīng)可誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡,造成諸多中樞損傷[14]。另外長(zhǎng)時(shí)間的睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物海馬組織結(jié)構(gòu)的改變,增加細(xì)胞凋亡。Caspase-3是Caspase蛋白激酶家族中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶,對(duì)于細(xì)胞凋亡起決定性的調(diào)控作用[15-16]。Bcl-2對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用,其作用類似于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,能抑制凋亡蛋白活性,減少神經(jīng)元的凋亡[17]。有理由推測(cè),異常增高的炎性反應(yīng)和伴隨的神經(jīng)元凋亡,可能構(gòu)成了失眠的關(guān)鍵中樞機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,造模后的失眠大鼠運(yùn)動(dòng)能力、認(rèn)知能力及記憶能力均有所下降,對(duì)新環(huán)境的探究行為、焦慮和緊張度較高,海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu)損傷較為嚴(yán)重,血清IL-1β和TNF-α水平明顯升高,Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯降低。表明失眠大鼠海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)加重,誘導(dǎo)了神經(jīng)元的凋亡。

有研究表明大部分就診的認(rèn)知障礙患者合并睡眠障礙,睡眠障礙的個(gè)體患認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)更高[18]。然而目前睡眠障礙與認(rèn)知障礙的直接因果關(guān)系沒有具體的數(shù)據(jù)描述,認(rèn)為睡眠障礙可能作為惡性循環(huán)的一部分參與到阿爾茨海默病(AD)的病理機(jī)制中[4,19]。一項(xiàng)薈萃分析顯示,與無睡眠障礙者相比,有睡眠障礙的受試者發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)更高[20],且整體睡眠障礙及其亞型(如失眠、睡眠呼吸障礙)和其他睡眠問題(如日間過度嗜睡、睡眠相關(guān)運(yùn)動(dòng)障礙、晝夜節(jié)律睡眠障礙和非特異性睡眠問題)可以增加全因癡呆、AD、血管性癡呆(VD)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[21]。腦脊液tau和Aβ水平被認(rèn)為是AD神經(jīng)變性最敏感、最特異性的生物標(biāo)志物。在一項(xiàng)回顧性觀察研究中,發(fā)現(xiàn)認(rèn)知障礙患者的腦脊液t-tau/Aβ比值高,且與睡眠障礙有關(guān)[22]。因此,正常人群發(fā)生睡眠障礙通過改善睡眠可以延緩認(rèn)知功能下降,同時(shí)也可通過改善睡眠達(dá)到改善認(rèn)知功能的目的。本研究采用四逆湯+桂甘龍牡湯進(jìn)行干預(yù),方中熟附子味辛甘性熱有毒,歸心脾腎經(jīng),能助少陰之火;干姜味辛性熱,守而不走,固守中土,運(yùn)轉(zhuǎn)樞機(jī);炙甘草一者助干姜以建中陽(yáng),一者性味甘緩,可制附子之峻猛。諸藥合用,補(bǔ)益水中之火,健運(yùn)中部之樞紐,樞機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn),氣機(jī)升降有序,心腎交通,生生不息,回歸身體“和”之道。正如近代名醫(yī)章次公謂“失眠患者,單純應(yīng)用養(yǎng)陰、安神、鎮(zhèn)靜藥物效果不佳時(shí),適當(dāng)加入桂、附一類興奮藥時(shí),每收佳效”。又《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治》云:“火逆下之,因燒針煩躁者,桂枝甘草龍骨牡蠣湯主之。”提示桂枝甘草辛甘化陽(yáng),以助心陽(yáng),心陽(yáng)得復(fù),而得安寧。龍骨、牡蠣重鎮(zhèn)潛降以導(dǎo)龍入海,寧心安神。該方具有調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、和陰益陽(yáng)、潛鎮(zhèn)攝納之功,用以治療失眠癥能起到調(diào)節(jié)陰陽(yáng)、安神定志的作用。因此,兩方合用,共奏扶陽(yáng)抑陰、運(yùn)轉(zhuǎn)樞機(jī)、引導(dǎo)氣機(jī)升降之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,溫陽(yáng)組大鼠運(yùn)動(dòng)能力、認(rèn)知能力及記憶能力均明顯改善,在一定程度上緊張焦慮的情緒得到緩解;海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損害相對(duì)減輕,細(xì)胞排列稍紊亂,層次增多,存活細(xì)胞數(shù)目增多,有少量細(xì)胞皺縮;血清IL-1β和TNF-α水平均明顯降低,Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯降低,Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯升高。表明以四逆湯+桂甘龍牡湯為基礎(chǔ)方的溫陽(yáng)法能有效抑制神經(jīng)炎癥,減輕失眠引起的海馬神經(jīng)元損傷和凋亡,改善認(rèn)知記憶功能。

綜上所述,以四逆湯+桂甘龍牡湯為基礎(chǔ)方的溫陽(yáng)法可明顯改善PCPA致失眠大鼠的睡眠障礙和認(rèn)知記憶功能,機(jī)制可能與抑制神經(jīng)炎性、減輕失眠引起的海馬神經(jīng)元損傷和凋亡相關(guān)。本研究結(jié)果為溫陽(yáng)法防治失眠和認(rèn)知記憶損害提供了一定科學(xué)依據(jù),但缺乏不同劑量中藥組的對(duì)比研究,有待進(jìn)一步完善。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。