雙酚A 及其類似物對(duì)魚類骨骼發(fā)育的影響

高培潔，鄧昊陽(yáng)，段霖，張倩青，吳朗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

雙酚類化合物是指具有2 個(gè)羥苯基結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)，包括雙酚A（BPA）、雙酚S（BPS）、雙酚B（BPB）、四溴雙酚A（TBBPA）等。其中，BPA 最為常見(jiàn)，近年來(lái)在河流、湖泊、沉積物、土壤等環(huán)境介質(zhì)中被頻繁檢出[1]。研究表明，動(dòng)物骨骼發(fā)育障礙疾病，與雙酚類化合物污染密切相關(guān)[2]。水環(huán)境中廣泛存在的BPA 等，可能通過(guò)魚鰓呼吸、皮膚滲透等方式進(jìn)入魚體內(nèi)，干擾魚類骨骼代謝，影響骨骼發(fā)育，最終威脅其生存和種群維持?，F(xiàn)簡(jiǎn)述BPA 及其類似物，對(duì)魚類骨骼發(fā)育的毒性效應(yīng)及相關(guān)機(jī)理，以期為BPA 及其類似物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 BPA 及其類似物的來(lái)源和污染現(xiàn)狀

BPA 及其類似物是生產(chǎn)聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂的原料，廣泛應(yīng)用于罐頭內(nèi)層、食品和飲料包裝材料以及嬰兒奶瓶等工業(yè)產(chǎn)品中，可通過(guò)水解作用，從這些產(chǎn)品中滲透出來(lái)，隨廢水排放，最終匯集到河流、湖泊等水域中[3]。

雙酚類化合物的污染呈現(xiàn)全球性的特征。Yu等[4]在美國(guó)35 個(gè)州76 份工業(yè)廢水樣品中，均檢測(cè)到了BPA、BPS、雙酚F（BPF）、雙酚AF（BPAF）等多種雙酚類污染物。Yamazaki 等[5]在日本、韓國(guó)、印度主要河流中，也發(fā)現(xiàn)了BPA、BPS、BPF。我國(guó)黃河、長(zhǎng)江、珠江等主要水域以及浙江、上海、江蘇等沿海省份，也發(fā)現(xiàn)了多種雙酚類化合物殘留[6-8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，歐美及日本地表水中BPA 質(zhì)量濃度一般為0.002~21.000 μg/L[9]，我國(guó)地表水中BPA 質(zhì)量濃度一般為0.000 98~4.465 00 μg/L[10-11]，最高可達(dá)4 499 μg/L[12]。

魚類等水生動(dòng)物長(zhǎng)期生活在水中，對(duì)BPA 及其類似物有較高的富集能力。Luigi 等[13]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，意大利波河鯉（Cyprinus carpio）肝臟以及歐鳊（Abramis brama）、梭鱸（Sander lucioperca）和六須鲇（Silurus glanis），體內(nèi)的BPA 質(zhì)量比分別為53.1~204.1，58.9~1 529.6，36.6~392.2 和104.1~488.1 ng/g。我國(guó)太湖北部水域的BPA 質(zhì)量濃度為22.5~194.0 ng/L，而田螺、河蚌和魚類體內(nèi)干質(zhì)量比高達(dá)475 μg/kg[14]。一般來(lái)說(shuō)，生物體內(nèi)雙酚類化合物富集程度與生物棲息環(huán)境的雙酚類污染狀況密切相關(guān)，在其污染較重區(qū)域，生物體對(duì)雙酚類化合物的富集程度更高。例如，日本名古屋河流魚類體內(nèi)TBBPA質(zhì)量比為0.01~0.11 ng/g[15]，而中國(guó)巢湖工業(yè)污染區(qū)魚類體內(nèi)TBBPA 質(zhì)量比為28.5~39.4 ng/g[16]。

2 對(duì)魚類骨骼發(fā)育的影響

BPA 是一種內(nèi)分泌干擾物，可通過(guò)多種途徑，直接或間接干擾生物骨骼代謝和發(fā)育[17]。對(duì)魚類骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的影響，既可直接作用于魚體本身，也可通過(guò)親代傳遞給子代。

2.1 早期發(fā)育

動(dòng)物試驗(yàn)表明，BPA 及其類似物，對(duì)魚類骨骼發(fā)育具有不利影響，且在生命早期階段表現(xiàn)尤為明顯。Kramer 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，BPA 聚合物（Bis-GMA）可損害斑馬魚（Danio rerio）胚胎軟骨的骨化。任文娟等[19]研究了BPA 及其類似物對(duì)斑馬魚胚胎的心率、孵化率和7 d 體長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，對(duì)于硬骨魚類胚胎和仔稚魚，BPP（雙酚P）的毒性最大，其次是BPAP（雙酚AP）、BPAF、BPZ（雙酚Z），BPA、BPB 和BPF，BPS 的毒性最小。Moreman 等[20]也發(fā)現(xiàn)，BPA、BPS、BPF 和BPAF 均可影響斑馬魚幼苗骨骼發(fā)育，導(dǎo)致其脊柱彎曲、尾部彎曲和顱面異常等。

體外細(xì)胞試驗(yàn)[21]也表明，BPA（2.5~12.5 μm）暴露，可導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖速度降低，加劇成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞凋亡；熒光定量PCR 結(jié)果顯示，在成骨細(xì)胞形成中具有關(guān)鍵作用的runx2、osterix、beta-catenin等基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，而促凋亡相關(guān)基因bax和caspase-9 轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。此外，BPA 對(duì)金魚體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)也有影響。研究[22]表明，BPA 暴露，可降低金魚血漿中鈣水平，抑制降鈣素分泌，擾亂體內(nèi)鈣平衡，從而可能影響其骨骼發(fā)育。

2.2 遺傳毒性效應(yīng)

BPA 及其類似物對(duì)魚類骨骼發(fā)育的影響可能具有傳代效應(yīng)。研究[23]發(fā)現(xiàn)，稀有鯽（Gobiocypris rarus）親本經(jīng)BPA 暴露后，其子代角舌骨和下頜骨縮短，骨骼畸形率增加，同時(shí)軟骨骨化延遲，生長(zhǎng)速度延緩。在分子水平上，骨骼發(fā)育關(guān)鍵基因runx2、sox9、bmp2b等的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)。斑馬魚親本及子代胚胎經(jīng)BPA 及其類似物暴露后，子代幼魚軟骨細(xì)胞異常增生，細(xì)胞排列擁擠、紊亂，且凋亡速度加快，最終導(dǎo)致咽顱軟骨的角度及長(zhǎng)度顯著增大（長(zhǎng)），呈現(xiàn)長(zhǎng)頭巨眼畸形[24]。

3 干擾魚類骨骼代謝的機(jī)理

3.1 直接影響

魚類骨骼的發(fā)育主要涉及軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相互作用[25]。這些骨細(xì)胞的凋亡及分化，對(duì)于維持骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義[26]。研究[27]發(fā)現(xiàn)，BPA 及其類似物可通過(guò)多種信號(hào)通路，（如FoxO、RANKL/RANK、Wnt/β-catenin 等），調(diào)控參與骨形成和骨代謝的功能蛋白的表達(dá)，干擾骨細(xì)胞凋亡和分化，進(jìn)而影響骨骼發(fā)育。

3.1.1 對(duì)FoxO 通路的影響

FoxO 通路在維持細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬方面，起著至關(guān)重要的作用[28]。過(guò)量ROS 和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的潛在因素。一旦過(guò)量的ROS 克服了抗氧化水平，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)；丙二醛和8-羥基脫氧鳥苷過(guò)量，也會(huì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。斑馬魚親本及胚胎經(jīng)BPA 暴露后，BPA 可能通過(guò)激活FoxO 信號(hào)通路，造成活性氧的過(guò)度形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而造成咽顱軟骨發(fā)育受損[28]。BPA 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，已在多種魚類中發(fā)現(xiàn)，如鯉和稀有鯽[29-31]。

3.1.2 對(duì)RANKL/RANK 通路的影響

核因子κB 受體活化素配體（RANKL）/RANK信號(hào)通路，可調(diào)控多核破骨細(xì)胞前體的形成和活化，進(jìn)而幫助骨骼重建[32]。RANKL 是一種核因子kappa-b 受體激活因子配體，主要在成骨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中表達(dá)[33]。而RANK 是RANKL 的受體，多在破骨細(xì)胞中特異性表達(dá)，二者的結(jié)合，可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞成熟并增強(qiáng)其骨吸收的作用[34]。Hwang等[21]發(fā)現(xiàn)，BPA 可以抑制破骨細(xì)胞中RANK 的表達(dá)，并且下調(diào)RANKL 誘導(dǎo)的NFATc1、MAPK 和AKT等信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的凋亡，干擾骨發(fā)育。

3.1.3 對(duì)Wnt/β-catenin 通路的影響

Wnt/β-catenin 通路在骨發(fā)育及骨重塑的過(guò)程中，不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，而且可以通過(guò)影響RANKL-RANK-OPG 信號(hào)調(diào)節(jié)軸，間接調(diào)控骨吸收作用。研究[35]表明，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活，可以抑制RANKL 的表達(dá)，并上調(diào)骨保護(hù)蛋白（OPG）水平，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞分化、成熟以及破骨細(xì)胞的骨吸收作用。研究[36]發(fā)現(xiàn)，BPA 可以通過(guò)破壞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來(lái)干擾骨骼發(fā)育。體外細(xì)胞試驗(yàn)[37]也表明，BPA（250 μm）可顯著降低人骨髓干細(xì)胞（hBMSCs）中Wnt/β-catenin/LEF 通路的轉(zhuǎn)錄靶基因β-catenin 和細(xì)胞周期蛋白D1 的核水平，最終導(dǎo)致β-catenin 信號(hào)通路缺失，阻礙其發(fā)揮正常功能。

3.1.4 對(duì)BMP 信號(hào)通路的干擾

BMP 信號(hào)家族是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族的一個(gè)多樣化子集。BMP 與細(xì)胞表面的BMP受體（BMPR）結(jié)合。BMPR 由Ⅰ型受體和Ⅱ型受體組成。BMP 與BMPR 結(jié)合誘導(dǎo)Ⅱ型受體磷酸化并激活Ⅰ型受體。激活的Ⅰ型受體，可以通過(guò)受體調(diào)節(jié)蛋白SMAD 家族蛋白的磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，使該蛋白能夠定位于細(xì)胞核并調(diào)節(jié)基因表達(dá)[38]。當(dāng)BMP 蛋白表達(dá)下降時(shí)，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將無(wú)法進(jìn)行，用于調(diào)控骨骼形成和修復(fù)的基因runx2、osx、bglap2 和col1a1 的表達(dá)量也同步下降[39]。在斑馬魚骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，腹弓外胚層表達(dá)bmp4，顱面表達(dá)bmp2，咽內(nèi)胚層、外胚層表達(dá)bmp5和bmp7a/b[40]。研究[41]發(fā)現(xiàn)，組合敲除bmp2 和bmp4，或者組合敲除bmp2 和bmp7，都會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化異常。Fan 等[23]通過(guò)稀有鯽的遺傳毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將雌性親代暴露于BPA 中，子代bmp2、bmp4、bmp6 的表達(dá)均顯著下降，同時(shí)出現(xiàn)軟骨畸形和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象。上述研究結(jié)果表明，BPA可通過(guò)減弱BMP 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)作用，進(jìn)而干擾骨骼發(fā)育[23]。

3.2 間接影響

3.2.1 干擾性激素正常功能

雌激素、黃體酮和雄激素等性激素是骨代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。黃體酮和睪酮可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，雌激素則可抑制破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成[33]。

BPA 可與性激素相關(guān)受體結(jié)合，干擾內(nèi)源性激素的穩(wěn)態(tài)，抑制成骨細(xì)胞分化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低血漿鈣水平，進(jìn)而影響骨骼發(fā)育[17]。例如，BPA 可競(jìng)爭(zhēng)性地與雌激素受體ERγ 結(jié)合，抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化、骨鈣素表達(dá)、堿性磷酸酶（ALP）活性以及骨礦化，進(jìn)而導(dǎo)致骨丟失和骨質(zhì)疏松[2]。在對(duì)金魚（Carassius auratus）的研究中，BPA 也表現(xiàn)出雌激素拮抗作用，導(dǎo)致血漿中鈣水平和ALP 活性降低[22]。黃文龍[24]也發(fā)現(xiàn)，BPA可通過(guò)與雌激素受體、雄激素受體或雌激素相關(guān)受體結(jié)合，干擾斑馬魚咽顱軟骨發(fā)育。

3.2.2 干擾神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)

神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)調(diào)節(jié)動(dòng)物體的運(yùn)動(dòng)行為具有重要作用，而雙酚類化合物能夠通過(guò)干擾神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)，間接影響骨骼發(fā)育。研究[42]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA），可通過(guò)提高成骨基因mRNA 的表達(dá)、ALP 活性和鈣離子的吸收，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化；一旦GABA 缺乏，將導(dǎo)致顱面骨骼發(fā)育異常[43]。Imanishi 等[44]報(bào)道，BPA 在大鼠體內(nèi)可與γ-氨基丁酸（GABA）受體作用，抑制GABA 反應(yīng)。

3.2.3 干擾免疫系統(tǒng)

骨健康水平下降與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)，接觸BPA，可能對(duì)骨骼產(chǎn)生退行性影響[45-46]。Gascon 等[47]發(fā)現(xiàn)，孕婦產(chǎn)前接觸BPA，可能影響后代Th1 淋巴細(xì)胞和Th2 淋巴細(xì)胞活性，進(jìn)而影響先天性免疫系統(tǒng)。Monasterio 等[48]指出，Th1 淋巴細(xì)胞可以通過(guò)產(chǎn)生IL-1β、IL-12、IFN-γ，增強(qiáng)成骨細(xì)胞和Th17 淋巴細(xì)胞上的RANKL 表達(dá)，間接發(fā)揮破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨基質(zhì)吸收。鯉長(zhǎng)時(shí)間暴露于BPA 中，可導(dǎo)致體內(nèi)大量ROS 產(chǎn)生并積累，從而造成T 細(xì)胞的死亡[49]，進(jìn)而影響機(jī)體的骨穩(wěn)態(tài)。

4 結(jié)語(yǔ)

BPA 及其類似物在水環(huán)境中廣泛存在，其對(duì)魚類等水生動(dòng)物骨骼發(fā)育的影響不容忽視。目前，關(guān)于低劑量雙酚類化合物骨骼毒性效應(yīng)的試驗(yàn)證據(jù)仍不充分，其影響程度因種屬、暴露時(shí)間和暴露方式等不同而異，其作用機(jī)理多樣且不完全明確，仍需要開(kāi)展更多針對(duì)不同類型水生動(dòng)物骨骼毒性的相關(guān)研究。另外，不同代謝形態(tài)的雙酚類化合物，對(duì)水生動(dòng)物的毒理效應(yīng)及機(jī)理可能不同，因此，可選取對(duì)污染物比較敏感的水生動(dòng)物[如稀有鯽、劍尾魚（Xiphophorus helleri）等]的生理生化、基因表達(dá)等指標(biāo)為標(biāo)志物，探究在水生生物體內(nèi)，雙酚類化合物不同代謝形態(tài)與其毒理效應(yīng)之間的關(guān)系，進(jìn)而相對(duì)完整地評(píng)價(jià)雙酚類化合物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

在自然水體中，雙酚類化合物的污染常伴隨多種環(huán)境污染物存在。目前，國(guó)內(nèi)外的研究多為單一雙酚類化合物的毒性效應(yīng)，而關(guān)于其他污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)方面的研究報(bào)道較少。在后續(xù)研究中，一方面可以模擬現(xiàn)實(shí)水環(huán)境的污染水平，重點(diǎn)研究水環(huán)境中雙酚類化合物與其他常見(jiàn)污染物（如抗生素、重金屬離子等）的聯(lián)合毒性；另一方面，完善野外采集的水體理化指標(biāo)和水生生物相關(guān)毒性指標(biāo)的數(shù)據(jù)庫(kù)，綜合評(píng)價(jià)水環(huán)境中雙酚類的生態(tài)毒理效應(yīng)。