魚(yú)類細(xì)菌性疫苗的研究進(jìn)展

程曉艷

（萊陽(yáng)市漁業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，山東 煙臺(tái) 265200）

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高密度、規(guī)模化、集約化高速發(fā)展，病害已成為產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重大挑戰(zhàn)。目前來(lái)看，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類使用疫苗，是最理想的疫病防控手段，既可以防控魚(yú)類病害發(fā)生，減少產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，又可以減少或消除由于大量使用抗生素帶來(lái)的健康危害、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和水產(chǎn)品食品安全等問(wèn)題，從而支撐水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康、綠色發(fā)展?，F(xiàn)介紹目前魚(yú)類細(xì)菌性疫苗的具體制備方法、免疫方法、評(píng)價(jià)體系和開(kāi)發(fā)存在的問(wèn)題，旨在從根本上提高魚(yú)體的免疫力，減少病害發(fā)生頻率，以獲得最大經(jīng)濟(jì)效益。

1 我國(guó)魚(yú)類細(xì)菌性疫苗的研究現(xiàn)狀

20 世紀(jì)40 年代開(kāi)始，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)展了魚(yú)類疫苗的研究[1]。魚(yú)類疫苗包括細(xì)菌疫苗、病毒疫苗和寄生蟲(chóng)疫苗。其中，細(xì)菌疫苗由滅活或減毒活菌制成，用于主動(dòng)免疫接種。相比于病毒疫苗和寄生蟲(chóng)疫苗，細(xì)菌疫苗的研制方法相對(duì)簡(jiǎn)單、應(yīng)用相對(duì)廣泛，但大多數(shù)疫苗僅停留在試驗(yàn)階段，大規(guī)模商用較少。

20 世紀(jì)60 年代末，我國(guó)首個(gè)魚(yú)用疫苗——草魚(yú)出血病組織漿滅活疫苗研制成功。2002 年，李愛(ài)華等[2]研制了淡水魚(yú)類出血性致病菌嗜水氣單胞菌和河弧菌的二聯(lián)疫苗。2006 年，曹宏梅等[3]研制了海水魚(yú)類致病菌鰻弧菌和溶藻弧菌的二聯(lián)疫苗，發(fā)現(xiàn)二聯(lián)疫苗免疫對(duì)大菱鲆（Scophthalmus maximus）鰻弧菌和溶藻弧菌的免疫保護(hù)率分別為83.52%和83.24%。2009 年，潘燕華等[4]用肌內(nèi)注射和浸泡免疫方式，分析鰻弧菌減毒活疫苗對(duì)牙鲆（Paralichthys olivaceus）的免疫保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)注射或浸泡減毒活疫苗的牙鲆的免疫保護(hù)率達(dá)到100%，明顯高于滅活疫苗的60%。隨著基因工程技術(shù)的應(yīng)用，2014 年，龐歡瑛等[5]構(gòu)建了溶藻弧菌vscO基因缺失的減毒活疫苗ZJ03ΔvscO，可有效提高石斑魚(yú)對(duì)溶藻弧菌的免疫力。

2 制備與檢測(cè)

2.1 制備

2.1.1 菌液的培養(yǎng)

選取毒力較強(qiáng)、已經(jīng)確定保藏的菌種，將其接種于瓊脂平皿，在菌種的最適生長(zhǎng)溫度（不同的細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度不同，一般28~30 ℃）下培養(yǎng)24 h，生產(chǎn)出菌落，挑取適量單菌落，接種于液體培養(yǎng)基，在最適生長(zhǎng)溫度下，震蕩培養(yǎng)24 h，得到菌液。

2.1.2 菌液檢驗(yàn)

于無(wú)菌條件下，取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面，將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，在最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，要求無(wú)雜菌生長(zhǎng)。

2.1.3 菌含量測(cè)定

平板計(jì)數(shù)測(cè)定，將菌液稀釋后，用分光光度法測(cè)定細(xì)菌的吸光度（OD 值），計(jì)算細(xì)菌濃度，菌液濃度≥50×108cfu/mL。

2.1.4 菌液滅活

采用化學(xué)滅活和熱滅活2 種方法?；瘜W(xué)滅活法多使用甲醛、苯酚和三氯甲烷溶液。熱滅活法多使用60 或65 ℃水浴法。后進(jìn)行分裝，石蠟封口，貼標(biāo)簽，即可制成滅活菌苗。

2.2 檢測(cè)

2.2.1 無(wú)菌檢驗(yàn)

將滅活的菌苗經(jīng)28 ℃培養(yǎng)，設(shè)2 個(gè)平行，24 h后，檢查有無(wú)菌落形成。如果所接平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明疫苗中無(wú)活菌存在。

2.2.2 安全性檢驗(yàn)

將滅活的菌苗濃度稀釋至5×108cfu/mL，對(duì)20 尾健康活魚(yú)的腹部注射，劑量為0.2~0.5 mL/尾。正常投喂14 d，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，觀察魚(yú)體反應(yīng)。如果接種魚(yú)其運(yùn)動(dòng)、攝食等活動(dòng)無(wú)異常，成活率為100%，說(shuō)明所制備的疫苗安全。

2.2.3 相對(duì)免疫保護(hù)率測(cè)定

取上述菌苗，對(duì)同規(guī)格20~40 尾活魚(yú)注射，劑量為0.2~0.5 mL/尾。投喂30~60 d 后捕撈，用同源強(qiáng)毒株菌種攻毒，攻毒后，正常喂養(yǎng)7 d，統(tǒng)計(jì)死亡率。若浸泡免疫的保護(hù)率為70%以上、注射免疫保護(hù)率為80%以上，則為合格疫苗。相對(duì)免疫保護(hù)率計(jì)算公式為：相對(duì)免疫保護(hù)率（%）=(對(duì)照組平均死亡率-免疫組平均死亡率）/對(duì)照組平均死亡率×100%

3 免疫方法

免疫方法主要有浸泡免疫、注射免疫和口服3 種。

3.1 浸泡免疫

浸泡免疫是將疫苗配成適當(dāng)濃度，加到水體中，魚(yú)體通過(guò)鰓和體表黏膜的吸收進(jìn)行免疫。其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)魚(yú)體創(chuàng)傷小，有利于水生動(dòng)物群體免疫?？赏ㄟ^(guò)優(yōu)化氯化鈉浸泡液濃度、浸泡時(shí)間和溫度等免疫條件，提高浸泡免疫效果。蔣昕彧等[6]采用超聲波輔助浸泡法，導(dǎo)入草魚(yú)嗜水氣單胞菌疫苗，相比單純浸浴法，可獲得較好的免疫保護(hù)效果。

3.2 注射免疫

注射免疫是將疫苗直接注入魚(yú)體內(nèi)，其所需疫苗量少，受環(huán)境影響小。張麗等[7]以浸泡和注射2 種免疫方法，用遲緩愛(ài)德華氏菌對(duì)養(yǎng)殖大菱鲆進(jìn)行全菌疫苗免疫，發(fā)現(xiàn)注射和浸泡接種2 種方法，均使大菱鲆對(duì)腹水病產(chǎn)生免疫效果，且注射免疫效果優(yōu)于浸泡免疫。2019 年，洪楊等[8]設(shè)計(jì)了一種魚(yú)類疫苗自動(dòng)注射設(shè)備，可有效提高注射作業(yè)效率，降低人工接種強(qiáng)度，有利于魚(yú)苗注射接種技術(shù)的推廣。

3.3 口服免疫

口服免疫是將疫苗添加到飼料中，通過(guò)口服進(jìn)行免疫。魚(yú)用疫苗最理想的接種途徑，是把疫苗混合到餌料中進(jìn)行口服免疫，但其免疫效果遠(yuǎn)不及注射法和浸浴免疫，主要原因是魚(yú)吸收疫苗前，胃內(nèi)的消化酶已將疫苗分解。因此，邊慧慧等[9]將鰻弧菌滅活疫苗制備成微囊口服疫苗，對(duì)牙鲆進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)其免疫效果優(yōu)于普通口服疫苗。

4 魚(yú)類免疫佐劑

免疫佐劑是指能非特異增強(qiáng)抗原的免疫原性或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。按照來(lái)源，可分為動(dòng)植物提取物（蜂膠、皂角苷、甘草素）、微生物類衍生物（葡聚糖、肽聚糖、脂多糖）、人工合成的有機(jī)物和無(wú)機(jī)鹽（鋁鹽）、生物活性分子類（細(xì)胞類因子CK）等。張念慈等[10]通過(guò)試驗(yàn)證明，只要在疫苗中加入少量莨菪堿，即可明顯增強(qiáng)疫苗的浸泡免疫效果。韓雯等[11]用皂角苷浸泡大菱鲆，證明皂角苷具有提高魚(yú)類非特異免疫效果。任燕等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻油聚乙二醇單酯葡萄糖苷，可提高異育銀鯽嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫效果。

5 疫苗效果評(píng)價(jià)方法

由于魚(yú)種、環(huán)境等差異，目前還沒(méi)有統(tǒng)一的魚(yú)用疫苗效果評(píng)價(jià)方法。疫苗效果評(píng)價(jià)指標(biāo)分為非特異性免疫評(píng)價(jià)指標(biāo)、特異性免疫評(píng)價(jià)指標(biāo)和相對(duì)免疫保護(hù)率。非特異性免疫評(píng)價(jià)指標(biāo)有溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、血清抑菌活性、外周白細(xì)胞數(shù)量變化、外周紅細(xì)胞數(shù)量變化和非特異性免疫相關(guān)基因的表達(dá)量（補(bǔ)體系統(tǒng)中C3、補(bǔ)體C4 基因表達(dá)量、細(xì)胞因子基因表達(dá)量變化）等；特異性免疫評(píng)價(jià)指標(biāo)有血清抗體效價(jià)、主要組織相容性復(fù)合體基因表達(dá)量變化。相對(duì)免疫保護(hù)率是在免疫試驗(yàn)后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)免疫組和對(duì)照組的死亡率，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率，它更直接地表明疫苗免疫效果。相對(duì)免疫保護(hù)率越高，表示疫苗免疫效果越好。

在評(píng)價(jià)疫苗效果時(shí)，可選取1 個(gè)或多個(gè)敏感指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。隋虎辰等[13]用添加多糖佐劑的遲緩愛(ài)德華氏菌滅活疫苗，來(lái)免疫大菱鲆。通過(guò)測(cè)定血清中溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、血清抗體效價(jià)和相對(duì)免疫保護(hù)率4 個(gè)指標(biāo)，評(píng)價(jià)各疫苗組的免疫效果。刁菁等[14]通過(guò)檢測(cè)牙鲆抗體效價(jià)、6 種免疫相關(guān)基因表達(dá)變化及相對(duì)免疫保護(hù)力指標(biāo)，對(duì)脂多糖和酵母β 葡聚糖的免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

6 疫苗開(kāi)發(fā)存在的問(wèn)題

6.1 思想保守，疫苗使用率低

部分水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)人員缺乏防病意識(shí)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中不愿意投入較多的資金進(jìn)行疫苗免疫。發(fā)生病害時(shí)，養(yǎng)殖人員也傾向于使用價(jià)格較低的抗生素類藥物治療，導(dǎo)致大量耐藥菌出現(xiàn)，造成藥物殘留，對(duì)食品安全及人類健康造成重大威脅。

6.2 疫苗研發(fā)成本較高，商業(yè)疫苗開(kāi)發(fā)少

我國(guó)魚(yú)類養(yǎng)殖品種較多，病害類型及病原也不同，其免疫系統(tǒng)對(duì)不同病害的抵抗力和感受性不同，因此適用疫苗也不同，增加了疫苗研發(fā)成本。此外，目前疫苗審核需要臨床試驗(yàn)，而自發(fā)使用疫苗的養(yǎng)殖從業(yè)人員較少，試驗(yàn)基地養(yǎng)殖魚(yú)類的品種和數(shù)量，均無(wú)法滿足細(xì)菌性疫苗臨床試驗(yàn)需求。若將疫苗免費(fèi)發(fā)放，既增加了研發(fā)成本，又承擔(dān)了極大風(fēng)險(xiǎn)，使得企業(yè)研發(fā)商業(yè)疫苗的積極性不高。

6.3 影響免疫應(yīng)答的因素較多

影響免疫應(yīng)答的因素較多。首先，魚(yú)的年齡和體質(zhì)量、性別、營(yíng)養(yǎng)狀況、生理狀態(tài)和群體效應(yīng)等，均影響免疫應(yīng)答，體格強(qiáng)壯的魚(yú)免疫機(jī)能旺盛，魚(yú)處于應(yīng)激狀況下免疫應(yīng)答會(huì)受到影響。其次，抗原的劑量和進(jìn)入機(jī)體途徑均顯著影響免疫應(yīng)答。再次，溫度對(duì)魚(yú)類免疫應(yīng)答的影響也很大。當(dāng)環(huán)境溫度高于免疫臨界溫度時(shí)，魚(yú)類才能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而且在適宜的生長(zhǎng)溫度內(nèi)，溫度越高，免疫應(yīng)答越快。最后，除溫度外，季節(jié)、光周期、可溶性污染物及藥物、佐劑的選擇也影響免疫效果。

7 建議

7.1 加大推廣宣傳力度

建議科研院所、高校、漁業(yè)技術(shù)推廣機(jī)構(gòu)借助網(wǎng)絡(luò)、媒體等平臺(tái)，推廣疫苗防病技術(shù)，增強(qiáng)養(yǎng)殖者的環(huán)境保護(hù)和水產(chǎn)品質(zhì)量安全意識(shí)，提高其健康養(yǎng)殖水平，使魚(yú)用疫苗逐步替代藥物，實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖。

7.2 簡(jiǎn)化審批手續(xù)

魚(yú)用疫苗審批是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，需要科研機(jī)構(gòu)與養(yǎng)殖企業(yè)相互合作。建議簡(jiǎn)化疫苗審批手續(xù)，加快魚(yú)用疫苗成果快速向產(chǎn)業(yè)端轉(zhuǎn)化。

7.3 研究方向

目前，我國(guó)已經(jīng)建立了滅活疫苗、減毒活疫苗等成熟的漁用疫苗技術(shù)開(kāi)發(fā)路線，并成功開(kāi)發(fā)了漁用疫苗產(chǎn)品[15]。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建以疫苗接種為核心的水產(chǎn)病害免疫綜合防控體系，是今后魚(yú)類疫苗研究工作中的主要方向。通過(guò)加強(qiáng)對(duì)病原的血清學(xué)和流行規(guī)律、佐劑、免疫增強(qiáng)劑、抗原載體、疫苗體外評(píng)估系統(tǒng)、疫苗自動(dòng)化接種設(shè)備等方面的系統(tǒng)研究，形成完備的魚(yú)類病害免疫綜合防控體系，推進(jìn)我國(guó)魚(yú)類多聯(lián)、高效疫苗的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。此外，還需加強(qiáng)重點(diǎn)魚(yú)品種主要疫苗的全覆蓋接種工作。