真皮巨噬細胞通過SNX25/Nrf2 通路調(diào)控組織中的NGF 而調(diào)節(jié)痛敏

一、研究背景

肌體皮膚常受到機械創(chuàng)傷，其感覺由外周感覺神經(jīng)元編碼，這些神經(jīng)元可分為感受非傷害性觸覺刺激的低閾值機械感受器和感受傷害性刺激的痛覺感受器。DRG 小直徑神經(jīng)元是痛覺神經(jīng)元，而中和大直徑神經(jīng)元優(yōu)先感受低閾值機械刺激。皮膚損傷通過激活傷害性感受器、損傷部位常駐或浸潤的非神經(jīng)細胞（包括巨噬細胞、肥大細胞和角質(zhì)細胞）導致炎癥介質(zhì)釋放。組織巨噬細胞可分為神經(jīng)相關(guān)亞群和血管相關(guān)亞群。皮膚巨噬細胞亞群與外周神經(jīng)密切相關(guān)，并在受損時促進后者再生。在神經(jīng)病理性疼痛時，巨噬細胞通過組織血管緊張素2 或補體5a 促進痛覺。

神經(jīng)生長因子NGF 是一種分泌型小蛋白，參與多種急、慢性疼痛。NGF 在包括巨噬細胞在內(nèi)的免疫細胞中表達，通過多種機制作用于感覺神經(jīng)元促進痛覺的傳遞。NGF 可增強感受傷害性離子通道的活性、基因表達和膜定位，而增高感覺神經(jīng)元的興奮性。人NGF突變導致遺傳性感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)V 型病變(HSAN-V)，其主要臨床表現(xiàn)是痛感缺失。HSAN-V 小鼠模型也表現(xiàn)出感覺神經(jīng)所支配區(qū)域的痛敏降低，但其機制是否通過NGF 調(diào)控仍有待明確。

該研究的作者偶然發(fā)現(xiàn)了一個缺乏痛敏的轉(zhuǎn)基因鼠品系，通過正向遺傳分析確認Snx25是一個痛覺調(diào)節(jié)基因。SNX 蛋白有參與膜轉(zhuǎn)運、細胞信號傳導和細胞器運動等功能。該研究表明，真皮巨噬細胞 (dMacs) 中SNX25 通過抑制泛素化介導的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 的降解、進而促進NGF 生成。dMacs 中的SNX25 通過NGF/TrkA 通路調(diào)控正常和病理狀態(tài)下的急性疼痛。因此，皮膚巨噬細胞-神經(jīng)元軸是在正常、神經(jīng)病理性或炎癥等條件下，皮膚感受疼痛的重要一環(huán)。

二、研究結(jié)果

1.Snx25+/-鼠對痛不敏感

先天性白質(zhì)腦病相關(guān)基因Mlc1轉(zhuǎn)基因鼠(Mlc1Tg) 與WT 鼠（C57BL/6J 背景）比較，表現(xiàn)出對機械痛敏降低。由于Mlc1Tg鼠具有129S6、CBA 和C57BL/6J 混合遺傳背景，所以Mlc1Tg鼠與C57BL/6J 鼠被回交七代后，再與C57BL/6J 背景的WT 鼠進行比較研究。正常狀態(tài)下Mlc1Tg鼠表現(xiàn)出對vonFrey 纖毛檢測的機械刺激閾值（VF 閾值）增高、對皮內(nèi)注射5%福爾馬林引起的急性炎性疼反應(yīng)（福爾馬林反應(yīng)，如舔爪子、甩腳等反應(yīng)）顯著降低；在L4脊髓背角中也少見c-Fos+神經(jīng)元。Mlc1Tg鼠是細菌人工染色體 (BAC) 轉(zhuǎn)基因鼠，由于BAC 插入導致Snx25、Slc25a4和Cap97三個基因缺失。為研究Snx25對疼痛的調(diào)控功能，構(gòu)建了Snx25全敲鼠。Snx25+/-雄鼠的VF 閾值比WT 高，與Mlc1Tg鼠相似；Snx25+/-鼠對福爾馬林反應(yīng)也比WT 低。盡管2月齡的Snx25+/-鼠的熱傷害感受正常，但6～8 月齡的Snx25+/-鼠對熱刺激的反應(yīng)潛伏期比WT 長。

Snx25+/-鼠在SNI 模型時的機械痛敏比WT 明顯減弱。3 周齡和成年Snx25+/-鼠的DRG 中大、小直接感覺神經(jīng)元的數(shù)量、分布與同齡的WT 相近，表明痛覺異常不是因為神經(jīng)元亞群丟失所造成的；2 月齡Snx25+/-鼠后足皮膚中PGP9.5+纖維面積與2月齡WT 相當，表明SNX25 缺失不影響外周感覺纖維的出芽/分枝等發(fā)育過程。

檢測疼痛相關(guān)分子標志物的表達時發(fā)現(xiàn)，TRPV1 和TrkA 在Snx25+/-鼠DRG、坐骨神經(jīng)和脊髓中的表達比WT 鼠顯著降低。原代培養(yǎng)的Snx25+/-鼠DRG 神經(jīng)元，辣椒素誘導的Ca2+水平比WT 幅度??；Snx25+/-鼠DRG 中TRPV1、Scn9a（編碼NaV1.7）和Scn10a（編碼NaV1.8）的mRNA 表達比WT 低。表明Snx25+/-鼠的疼痛不敏感表型與其外周感覺神經(jīng)元中疼痛相關(guān)因子的表達減少有關(guān)。

2.特異性敲除DRG 神經(jīng)元內(nèi)Snx25 對疼痛仍敏感

Snx25fl/fl鼠與Advilin(Avil)CreERT2鼠雜交，并口服0.05%他莫昔芬 (TAM) 2 周以誘導基因重組，條件性敲除DRG 神經(jīng)元中的Snx25（Snx25Avil-cKO鼠）。在給予TAM 后第3 周，Snx25Avil-cKO鼠DRG 中SNX25 的表達顯著比Snx25fl/fl鼠低；但Snx25Avil-cKO鼠的VF 閾值和福爾馬林反應(yīng)正常，TRPV1、Scn9a和Scn10a的mRNA 表達也正常。表明DRG 神經(jīng)元中SNX25 不參與疼痛相關(guān)因子的表達和痛覺的調(diào)控。

3.骨髓源性巨噬細胞 (BMDMs) 的SNX25 調(diào)控痛覺

免疫組化研究顯示，Snx25+/-鼠后足皮膚中MHC-II+CD206+F4/80+巨噬細胞的數(shù)量以及CD206的表達與WT 相似。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Snx25+/-鼠BMDMs 的總體形態(tài)與WT 鼠比較沒有顯著差異。為了進一步明確dMacs 對痛覺的貢獻，用WT 或Snx25+/-鼠的巨噬細胞相互移植制作巨噬細胞嵌合體鼠，在移植后28 天，發(fā)現(xiàn)接受Snx25+/-骨髓移植的WT 鼠的VF 閾值增高，而接受WT 骨髓巨噬細胞的Snx25+/?鼠的VF 閾值降低。

免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，Snx25+/-鼠在注射福爾馬林后3 天，Iba1+CD206+標記的dMacs 比WT 鼠更少、趨化因子表達更低；在SNX25+/-鼠后足皮膚中的TGF-β 受體1 (TGF-βR1) 表達上調(diào)，該受體有抑制免疫反應(yīng)的作用，并可被SNX25 所降解；在注射后7 天，Snx25+/-鼠后足皮膚和DRG 中CCR2+免疫細胞浸潤程度低于WT，但差異無統(tǒng)計學意義。以上研究表明，SNX25 在BMDMs 的dMacs 中缺失，影響了正常和炎癥條件下的痛覺感受。

4.巨噬細胞特異性Snx 25cKO 鼠對痛覺不敏感

Snx25fl/fl鼠與Cx3cr1CreERT2/WT鼠雜交，培育出條件性敲除單核細胞和巨噬細胞中SNX25鼠(Snx25Cx3cr1-cKO)。與Snx25fl/fl鼠比較，Snx25Cx3cr1-cKO鼠VF 閾值升高、福爾馬林反應(yīng)減少；DRG 中Scn9a和Scn10a表達也減少，而DRG 神經(jīng)元的大小與分布都正常；后足皮膚中Cxcl5、Cxcl2、Il1b和Cxcl3的mRNA 表達降低；皮 膚CD45+CD11b+F4/80+細 胞 中Ccl2、Ccl3、Ccl4和Cxcl2的mRNA 表達也降低，而CD11b+F4/80+細胞的比例沒有變化。表明dMacs 的SNX25 對化學刺激后的炎性痛以及正常狀態(tài)下的痛覺有貢獻。

為確定SNX25+dMacs 與外周神經(jīng)之間的關(guān)系，該研究將Snx25Cx3cr1-cKO鼠與Ai39Tg/+鼠雜交培育Snx25CX3cr1-Cko/Ai39Tg/+鼠，TAM 誘導黃色熒光蛋白(YFP) 在CX3CR1+MHC-II+標記的dMacs 表達，而在CD117+肥大細胞中不表達。Snx25Cx3cr1-Cko/Ai39Tg/+鼠的真皮中，YFP+CX3CR1+標記的dMacs 與PGP9.5+纖維相靠近，表明SNX25+dMacs 與外周感覺纖維密切相關(guān)；而免疫組化研究發(fā)現(xiàn)WT 鼠皮膚中的F4/80+細胞和CD206+細胞與PGP9.5+神經(jīng)末梢明顯共定位。

將Snx25Cx30cr1-cKO鼠骨髓移植到Snx25fl/fl鼠，制備骨髓巨噬細胞嵌合體，TAM 口服2 周進行誘導，測試Snx25Cx3cr1-cKO鼠小膠質(zhì)細胞對疼痛不敏感是否有貢獻。TAM 誘導BMT 組的VF 閾值比BMT 前以及未誘前顯著升高；SNI 模型中，誘導組機械性痛敏較未誘導組減弱。表明在正常和神經(jīng)病理狀態(tài)下，調(diào)控痛敏的是dMacs 中的SNX25，而非小膠質(zhì)細胞中的SNX25。

5.SNX25 通過NGF 信號調(diào)控痛敏

Snx25+/?鼠在正常狀態(tài)和福爾馬林注射30 min后，后足皮膚中表達NGF 比WT 低；NGF 在WT 鼠MHC-II+F4/80+Iba1+標記的dMacs 中原位表達，在Snx25+/-BMDMs 中的表達減少。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，Snx25+/-鼠的TrkA 在坐骨神經(jīng)結(jié)扎8 h 后的神經(jīng)結(jié)扎遠端的積聚比WT 顯著減少，表明Snx25+/?DRG 中NGF/TrkA 復(fù)合物的逆行轉(zhuǎn)運減少。Snx25Cx3cr1-cKO鼠與Ai32Tg/+鼠雜交培育Snx25Cx30cr1-cKO/Ai32Tg/+鼠，通過YFP 來追蹤Snx25-KO 巨噬細胞，以檢測SNX25對調(diào)節(jié)巨噬細胞來源NGF 表達的作用。通過觀察誘導Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠的BMDMs 表達YFP，發(fā)現(xiàn)YFP+BMDMs 中Ngf的mRNA 表達比YFP?BMDMs中的明顯減少，表明SNX25調(diào)控Ngf的mRNA表達。接受Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠骨髓移植的WT 鼠，經(jīng)誘導后有44% MHC-II+dMacs 檢測到有Ai32Tg/+來源的YFP 表達。免疫印跡研究顯示，Snx25Cx3cr1-cKO鼠后足皮膚中NGF 表達比Snx25fl/fl鼠更低。

為研究dMacs 中Ngf的mRNA 表達，在WT鼠后背皮膚分選Lin?CD11b+CD64+Ly6C?MHC-II+標記 的dMacs、Lin?CD11b+CD64?Ly6C+MHC-IIlo標 記的真皮單核細胞 (dMonos) 和Lin?CD11b+CD64?Ly6C?MHC-II+標記的真皮樹突細胞 (dDCs)。RT-qPCR 研究顯示，WT 鼠Snx25的mRNA 表達在dDCs 中低于dMacs 和dMonos，但dMacs 和dMonos 之間無 顯著性 差 異。Snx25+/?或Snx25Cx3cr1-cKO鼠dMacs中Ngf的mRNA 表達比WT 的dMacs 低；通過移植整個Snx-25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠的骨髓巨噬細胞到WT 鼠制備骨髓巨噬細胞嵌合體，在誘導后從受體鼠皮膚中分選MHC-II+YFP?標記的dMacs 中的Ngf 的mRNA 表達，比供體來源的MHC-II+YFP+標記的dMacs 要低；Snx25+/-鼠在皮內(nèi)注射NGF 24 h 后，檢測到VF 閾值恢復(fù)正常，而注射PBS 則沒有恢復(fù)。以上研究表明，dMacs中的SNX25通過調(diào)節(jié)NGF表達進而調(diào)控痛敏。

6.SNX25 通過Nrf2 調(diào)節(jié)Ngf 的mRNA 表達

特異性siRNA 敲減BMDMs 中的Nrf2后可顯著降低Ngf的mRNA 表達。細胞Nrf2 的表達受泛素化和蛋白酶體降解的調(diào)控，該調(diào)控可被Keap1 蛋白阻斷。293T 細胞在蛋白酶體抑制劑MG132 處理后，多聚泛素化的Nrf2 蛋白增加，并在siRNA 敲減Snx25后進一步升高；相反，與僅過表達Nrf2相比，293T 細胞在瞬時轉(zhuǎn)染過表達SNX25 和Nrf2 后，多聚泛素化的Nrf2 則降低。293T 細胞過表達鼠源的Snx25和Nrf2后，SNX25 與Nrf2 可免疫共沉淀；體外泛素化檢測發(fā)現(xiàn)，敲減Snx25的BMDMs 中泛素化Nrf2蛋白的表達比對照有所增加。Snx25+/-鼠后足皮膚中受Nrf2 調(diào)控的血紅素加氧酶1 比WT 有所減少，通過siRNA 敲減加速Nrf2 降解的Keap1，可以恢復(fù)Snx25+/?BMDMs中的Ngf表達。以上研究表明，SNX25 通過調(diào)控Nrf2 泛素化進而調(diào)控Ngf的mRNA 表達。

7.SNX25 是dMacs 的關(guān)鍵痛覺調(diào)控因子

該研究在小鼠后足皮內(nèi)連續(xù)2 次注射Clodronate liposome 消除小鼠體內(nèi)的dMacs，用免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在第2 次注射后3 天，Clodronate liposome處理鼠皮內(nèi)CD206+或MHC-II+巨噬細胞比脂質(zhì)體對照顯著減少，但VF 閾值增高；免疫印跡分析顯示，Clodronate liposome 處理鼠皮內(nèi)NGF、SNX25和CD206 的表達低于脂質(zhì)體對照組。表明在正常狀態(tài)下dMacs 是痛覺所必需的。

DRG 中的巨噬細胞可參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控。免疫組化共標顯示，WT 和Snx25+/-鼠DRG 的MHC-II+巨噬細胞與PGP9.5+神經(jīng)相接近，CD206+或F4/80+巨噬細胞低中度表達Snx25。GFP+鼠的全骨髓巨噬細胞靜脈移植到WT 鼠后5 周檢測發(fā)現(xiàn)，約60%的MHC-II+DRG 巨噬細胞表達GFP，而坐骨神經(jīng)中的GFP+MHC-II+巨噬細胞很少，表明DRG 中發(fā)生了巨噬細胞的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換。為檢測DRG 巨噬細胞對疼痛過敏的影響，研究者手術(shù)暴露Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+、Snx25fl/fl和Ai32Tg/+鼠的L4～5DRGs，注射4-OHT誘發(fā)條件性敲除DRG 內(nèi)的Snx25；在注射后第5 天用免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG中檢測到Ai32Tg/+來源的YFP+巨噬細胞，Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠則沒有；Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG 中91% YFP+細胞是SNX25?，表明局部給予4-OHT誘導基因重組并成功條件性敲除SNX25。SNX25免疫熒光定量分析顯示，在注射4-OHT 后5 天，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG 內(nèi)CD206+巨 噬 細 胞僅14%是SNX25+（與Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠比較），證實4-OHT 處理基本消除了DRG 巨噬細胞中的SNX25。注射4-OHT 后5 天，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠同側(cè)后足VF 閾值與對側(cè)接近、同側(cè)后足VF 閾值與注射前接近、且與Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠VF 閾值接近，表明DRG 巨噬細胞中的SNX25 在正常條件下不參與痛覺調(diào)控。在正常狀態(tài)下，F(xiàn)4/80+DRG巨噬細胞表達NGF 較低，表明DRG 巨噬細胞對NGF 表達及疼痛傳導的調(diào)節(jié)機制不同于dMacs，即dMacs 的SNX25 而非DRG 巨噬細胞內(nèi)的SNX25在正常狀態(tài)下調(diào)節(jié)急性疼痛。

三、討論

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)Snx25+/-鼠和Snx25Cx3cr1-cKO鼠在正常和誘導疼痛條件下都可以降低痛反應(yīng)。SNX25 通過抑制Nrf2 的泛素化和蛋白酶降解，以調(diào)節(jié)Ngf的mRNA 轉(zhuǎn)錄，并進一步維持dMacs 中Ngf 的生成。SNX25 的缺失加速了Nrf2 的降解而降低NGF 表達，從而導致對疼痛不敏感。

已證實HSAN-V病人的主要臨床表現(xiàn)是痛覺喪失，是由NGF 基因突變導致的。該研究在Snx25Cx3cr1-cKO鼠中減少NGF 表達在一定程度上模擬了HSAN-V 的病理，但該研究沒有繼續(xù)觀察NGF 缺失的長期效應(yīng)如神經(jīng)末梢退化和收縮等形態(tài)學改變。NGF 的中和單克隆抗體已在研發(fā)過程中，可能作為緩解頑固性疼痛的治療手段。盡管關(guān)節(jié)痛和骨壞死等意想不到的不良反應(yīng)阻礙了這些單克隆抗體進入臨床，但NGF 仍然是研發(fā)鎮(zhèn)痛藥物的良好靶標。dMacs 中SNX25/Nrf2 軸可能將HSAN-V 的無痛表型橋聯(lián)到痛敏狀態(tài)，可能成為代替抗NGF 單克隆抗體的非常有前景的藥物靶標。但NGF 也可以由如角質(zhì)細胞等非炎癥細胞產(chǎn)生，因此需要進一步來研究調(diào)控外周NGF 的細胞和分子機制。