食品微生物檢驗(yàn)的方法及質(zhì)量控制要點(diǎn)分析

耿 營

（東營市疾病預(yù)防控制中心，山東東營 257000）

人們的消費(fèi)和健康觀念逐漸發(fā)生改變，對食品安全問題也越來越重視。生產(chǎn)條件差異、監(jiān)管力度不足等問題使食品質(zhì)量參差不齊，食品安全問題時(shí)有發(fā)生，如毒酸奶、地溝油等[1]。食品微生物檢測可幫助人們掌握食品中的微生物的含量與類型，了解食品加工環(huán)境及食品的衛(wèi)生狀況，判斷食品的致病菌、毒素等有害成分的污染程度，為衛(wèi)生管理、傳染病控制、預(yù)防食物中毒等提供科學(xué)依據(jù)。

1 現(xiàn)存問題

雖然食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)不斷發(fā)展，檢驗(yàn)水平不斷提高，但由于各種因素的影響，食品微生物檢驗(yàn)仍然存在較多不足，影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。①檢驗(yàn)人員專業(yè)水平參差不齊，在檢驗(yàn)過程中存在采樣不當(dāng)、儀器操作失誤、操作能力差、態(tài)度不認(rèn)真和法律意識淡薄等問題，導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。②不同食品檢驗(yàn)方法存在差異，需要選擇適宜的技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。隨著新檢驗(yàn)技術(shù)的推出，檢驗(yàn)精度更高、檢驗(yàn)特異性更強(qiáng)、檢驗(yàn)靈敏度更好，采用新技術(shù)對提高食品微生物檢驗(yàn)水平具有重要的意義，但受各種因素的影響，食品微生物檢驗(yàn)中常存在新技術(shù)引進(jìn)不足、推廣受限的情況[2]。③食品微生物檢驗(yàn)對環(huán)境要求高，通常需要干凈無菌、溫濕度適宜、空氣質(zhì)量達(dá)標(biāo)的檢驗(yàn)環(huán)境，但實(shí)際中常有實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不達(dá)標(biāo)的情況，影響食品微生物檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[3]。④在樣品采樣中，常出現(xiàn)采樣隨意、未按要求采樣、樣品采樣操作錯(cuò)誤和樣品保存不當(dāng)?shù)惹闆r，影響檢驗(yàn)結(jié)果。

2 檢驗(yàn)方法

2.1 傳統(tǒng)檢測法

傳統(tǒng)檢驗(yàn)法包括顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、間接（活菌）計(jì)數(shù)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測法。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將樣品處理后放在顯微鏡下觀察微生物的種類，并計(jì)數(shù)。間接（活菌）計(jì)數(shù)法是將樣品稀釋后再培養(yǎng)，培養(yǎng)基表面的一個(gè)菌落來源于樣品的一個(gè)活菌，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算樣品的大概活菌數(shù)量，可以測定奶制品等食品中的細(xì)菌等微生物的含量。PCR 檢測技術(shù)是將一段DNA 作為模板，在DNA 聚合酶和核苷酸底物作用下擴(kuò)增該段DNA 至足夠數(shù)量，進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，可以對轉(zhuǎn)基因大豆、玉米等農(nóng)作物中的微生物進(jìn)行定性、定量分析[4]。

2.2 分析化學(xué)技術(shù)

不同微生物的化學(xué)組成、代謝產(chǎn)物不同，可據(jù)此判斷微生物的種類[5]。分析化學(xué)技術(shù)可用于碳水化合物、食品添加劑等檢測，常用的方法有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和高效液相色譜法。

2.3 免疫分析檢測技術(shù)

免疫分析檢測技術(shù)根據(jù)技術(shù)特點(diǎn)可以分為3 種。①免疫熒光技術(shù)需特異性熒光抗體與抗原標(biāo)本反應(yīng)，再干燥、封片、鏡檢即可。②免疫層析技術(shù)用化學(xué)法將小分子偶聯(lián)到大分子上，固定到硝酸纖維素膜上后進(jìn)行檢測。③免疫磁珠分離技術(shù)是在樣品中添加磁珠后混合，再添加高梯度磁場讓磁珠與樣品分離，移除樣品，得到磁珠標(biāo)記和未標(biāo)記細(xì)胞組分。免疫分析檢測技術(shù)常用于冷凍豬肉、牛奶等食品中沙門氏菌、大腸埃希菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌等微生物的檢驗(yàn)。

2.4 生物傳感器檢測技術(shù)

生物傳感器檢測技術(shù)將生物受體復(fù)合物與物理化學(xué)傳感器連接，用以觀察并判斷微生物的種類，如微生物傳感器、免疫傳感器、酶傳感器和DNA 雜交傳感器等，常用于肉類鮮度的評定和食品中大腸桿菌、沙門氏菌等微生物的檢驗(yàn)。

2.5 分子生物學(xué)技術(shù)

①核酸探針技術(shù)利用堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)行檢測，先用特異的基因探針與樣品DNA 進(jìn)行雜交，形成互補(bǔ)序列后檢測目標(biāo)DNA。②基因芯片技術(shù)是將基因探針固定在載體上，當(dāng)溶液中的核酸序列與基因芯片上核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)配對時(shí)，可以獲得一組與探針序列完全互補(bǔ)的序列，重組出靶核酸序列。③放射檢驗(yàn)技術(shù)是標(biāo)記培養(yǎng)基中碳源的碳，當(dāng)使用培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，會消耗碳，根據(jù)碳來確定樣品中微生物的種類、數(shù)量，通常用于食品中的副溶血性弧菌、李斯特菌、沙門氏菌、霍亂弧菌和鴨疫中的默氏桿菌等致病菌的檢測。

2.6 其他技術(shù)

①抗體檢驗(yàn)技術(shù)中最常用的是酶聯(lián)免疫吸附法。食品微生物檢驗(yàn)可利用人工抗體與抗原發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生復(fù)合物，通過比色法測得結(jié)果，此法常用于檢測食品樣品中的金黃色葡萄球菌含量。②不同分子的導(dǎo)電性能存在差異，電導(dǎo)分析法可通過溶液導(dǎo)電率大小來測出某些微生物的含量，得出檢測結(jié)果，食品檢驗(yàn)中比較常用的是Mathus 系統(tǒng)。③商品化快速檢驗(yàn)技術(shù)中ATP 生物發(fā)光法可以通過ATP 與熒光物質(zhì)的結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞鑒定；染色成像計(jì)數(shù)法可以通過熒光過濾膜觀察細(xì)胞顏色，判斷細(xì)胞的活性，綠色細(xì)胞為死細(xì)胞，橙色細(xì)胞為存活細(xì)胞。

3 質(zhì)量控制要點(diǎn)

食品微生物檢驗(yàn)涉及的環(huán)節(jié)較多，任何一個(gè)環(huán)節(jié)存在紕漏或不足將直接影響檢驗(yàn)質(zhì)量。食品檢驗(yàn)全步驟主要涉及檢驗(yàn)人員、檢驗(yàn)技術(shù)、環(huán)境和樣品的采樣及保存等，要確保食品檢驗(yàn)質(zhì)量，需要從這些方面入手。

3.1 檢驗(yàn)人員

檢驗(yàn)人員的綜合素質(zhì)直接影響檢驗(yàn)質(zhì)量，要對檢驗(yàn)人員進(jìn)行培訓(xùn)，培訓(xùn)內(nèi)容包括基礎(chǔ)理論、基本技能、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、法律法規(guī)、檢驗(yàn)新技術(shù)和質(zhì)量管理等。基礎(chǔ)理論培訓(xùn)可以鞏固檢驗(yàn)人員的理論知識；基本技能培訓(xùn)可以強(qiáng)化檢驗(yàn)人員的操作水平；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)可以讓檢驗(yàn)人員熟悉各項(xiàng)操作要求，保證檢驗(yàn)操作符合標(biāo)準(zhǔn)；法律法規(guī)培訓(xùn)可以讓檢驗(yàn)人員熟悉行業(yè)相關(guān)法律法規(guī)政策，提高法律風(fēng)險(xiǎn)意識；檢驗(yàn)新技術(shù)培訓(xùn)可以讓檢驗(yàn)人員掌握新技術(shù)，不斷提高檢驗(yàn)技術(shù)水平。

3.2 檢驗(yàn)技術(shù)

食品微生物檢驗(yàn)方法眾多，如顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、PCR 檢測技術(shù)、核酸探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)等。不同方法的適用范圍、準(zhǔn)確度存在差異，檢驗(yàn)人員需要熟悉各類檢驗(yàn)技術(shù)的適用范圍，在不同種類的食品檢驗(yàn)中選擇適宜的檢驗(yàn)技術(shù)。例如，顯微鏡直接計(jì)數(shù)法適用于酵母菌、霉菌孢子等觀察計(jì)數(shù)；PCR 檢測技術(shù)方便快捷、成本低，但操作嚴(yán)格、易受污染、定量困難，在食品檢驗(yàn)中適用于大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌和草魚腸道細(xì)菌等檢測；核酸探針技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，但操作要求高、工作量大、成本高、不能檢測毒素，在食品檢驗(yàn)中適用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等檢測；基因芯片技術(shù)靈敏度、特異度較高，但成本高、操作復(fù)雜，在食品檢驗(yàn)中適用于腸出血性大腸埃希氏菌、志賀氏菌等檢測；流式細(xì)胞術(shù)檢測速度快、檢測指標(biāo)多，但容易受食品基質(zhì)的影響，主要適用于益生菌檢測、微生物活性檢測、致病菌檢測等。

3.3 環(huán)境

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要干凈、無菌、溫度適宜，避免雜菌生長形成污染影響檢驗(yàn)結(jié)果[6]。實(shí)驗(yàn)室需限制閑雜人員進(jìn)入，避免外界污染源進(jìn)入室內(nèi)；定期檢測工作臺、物品表面、空氣中的病原菌含量，定期消毒；室內(nèi)不可堆放雜物，以免形成消毒死角；每次實(shí)驗(yàn)前需要檢查水浴鍋、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱和微生物限度檢驗(yàn)儀等儀器設(shè)備的運(yùn)行情況，確保儀器正常運(yùn)行是保證檢驗(yàn)質(zhì)量的前提；每次檢測結(jié)束后必須清潔工作臺表面等，用專門的器皿裝剩余培養(yǎng)基、雜物，防止形成污染源。

3.4 樣品的采樣和保存

不同的樣品采樣方法、保存方法、檢驗(yàn)要求存在差異。在采樣之前，采樣人員要檢查相關(guān)證件，準(zhǔn)備好無菌的注射器、剪刀、鏟子和樣品袋等采樣工具。采用隨機(jī)采樣方式，若樣品被污染要第一時(shí)間重新采樣。采樣后，將樣品裝入專用容器中密封保存，保證樣品從采樣地點(diǎn)到實(shí)驗(yàn)室的過程中不被污染，貼好標(biāo)簽，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、人員。取樣后，對于容易變質(zhì)的樣品，如畜肉、魚類、乳制品和新鮮蔬菜瓜果等，要密封后低溫冷藏保存，防止變質(zhì)。檢驗(yàn)人員要根據(jù)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，貝類要在6 h 內(nèi)檢驗(yàn)，其他可在3 d 內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)，未進(jìn)行檢驗(yàn)的樣品要做好儲存，防止交叉感染、變質(zhì)，冷凍的樣品要防止融化。

3.5 儀器設(shè)備

食品微生物檢驗(yàn)需要借助多種儀器設(shè)備，儀器設(shè)備的性能、精密度以及檢驗(yàn)人員的儀器操作是否規(guī)范都會影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，做好儀器設(shè)備的管理是食品微生物檢驗(yàn)質(zhì)量控制的關(guān)鍵所在。儀器設(shè)備要定期做好維護(hù)工作，包括日維護(hù)、周維護(hù)、月維護(hù)等，記錄維護(hù)情況，以保持儀器良好的性能，保障檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在檢驗(yàn)前，檢驗(yàn)人員要檢查儀器設(shè)備的性能、精密度，做好調(diào)試，確保儀器無異常。在檢驗(yàn)過程中，檢驗(yàn)人員要按照儀器設(shè)備的使用說明書規(guī)范使用儀器設(shè)備。例如，使用高壓滅菌器滅菌時(shí)，加入的滅菌物要符合相關(guān)規(guī)定要求；培養(yǎng)箱中不可放入過冷、過熱的物品，避免影響培養(yǎng)箱性能；冰箱要每天監(jiān)測溫度，溫度浮動在1 ℃內(nèi)，每季度檢查消毒情況，確保平均菌落數(shù)＜103CFU·mL-1；干熱滅菌箱要定期校準(zhǔn)，每半年檢查一次滅菌效果。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)菌株的管理

標(biāo)準(zhǔn)菌株在食品微生物檢驗(yàn)中起到與樣本對照的作用，具有可追溯的遺傳學(xué)特性，標(biāo)準(zhǔn)菌株的管理會直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的判讀，影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。因此，標(biāo)準(zhǔn)菌株管理是食品微生物檢驗(yàn)質(zhì)量控制中的重要部分，標(biāo)準(zhǔn)菌株要通過正規(guī)途徑購買，可以選擇國內(nèi)外認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)購買。購買后的菌株要按照要求進(jìn)行管理，由技術(shù)負(fù)責(zé)人、微生物室負(fù)責(zé)人雙人雙鎖管理，放在加鎖的冰箱內(nèi)，并做好標(biāo)準(zhǔn)菌株的分類存放。標(biāo)準(zhǔn)菌株要詳細(xì)登記菌種名稱、編號、數(shù)量、分離日期和動物致病力等信息，菌種傳代要在5 代以內(nèi)，防止交叉感染。定期檢查標(biāo)準(zhǔn)菌株的活性，要做好不符合要求、失去活力的菌株的滅菌處理，防止污染，并需注明銷毀原因及情況。傳代后的菌株，要檢查形態(tài)、菌落、毒性等，每移種3 次就需要做一次全面的鑒定，對于污染和變異的菌株，要做好滅菌處理。

4 結(jié)語

食品檢驗(yàn)與食品安全息息相關(guān)，通過食品檢驗(yàn)可以了解食品是否存在質(zhì)量問題，食品微生物檢驗(yàn)方法眾多，不同檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度、優(yōu)缺點(diǎn)、適用范圍等存在差異，需檢驗(yàn)人員在檢驗(yàn)時(shí)選擇適宜的檢驗(yàn)技術(shù)。加強(qiáng)對食品檢驗(yàn)的質(zhì)量控制對保障食品安全至關(guān)重要，需加強(qiáng)對檢驗(yàn)人員、檢驗(yàn)技術(shù)、環(huán)境、樣品的采樣及保存的管理，提高食品微生物檢驗(yàn)質(zhì)量。