新疆地區(qū)漢族老年人阿爾茨海默病和輕度認(rèn)知功能障礙患者的外周血DNA絕對(duì)端粒長(zhǎng)度☆

趙永杰 鄒婷 段世偉 周曉輝

輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）的患者主要表現(xiàn)為記憶力減退，并存在一個(gè)或幾個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域的功能障礙，但社會(huì)職業(yè)或日常生活未受影響，尚不足以診斷為癡呆[1]，通常被認(rèn)為是從正常衰老到癡呆的過(guò)渡階段[2]。AD及MCI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，外周血DNA的ATL可能同其發(fā)病相關(guān)[3]，且不同地區(qū)研究結(jié)果差異較大，提示其發(fā)病可能受環(huán)境及地域的影響[4-5]。新疆為多民族聚居地區(qū)，其中以維吾爾族和漢族為常住居民，其地理環(huán)境及飲食習(xí)慣與中國(guó)其他地區(qū)存在較大差異。進(jìn)而導(dǎo)致新疆漢族人群生活習(xí)慣受其他少數(shù)民族的影響較大，致使其可能與內(nèi)地漢族人群在導(dǎo)致AD及MCI發(fā)病的表觀遺傳學(xué)機(jī)制方面存在差異。本研究選取新疆地區(qū)60歲及以上的漢族老年AD和MCI患者，采用橫斷面的研究方法，旨在探討新疆地區(qū)漢族老年人AD和MCI患者ATL差異，為進(jìn)一步研究新疆漢族AD及MCI患者發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇在2017年1月至2018年5月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科就診的年齡≥60歲、教育程度從文盲到研究生的老年人，根據(jù)美國(guó)精神病學(xué)會(huì)精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)Ⅳ修訂版（DSM-Ⅳ）[6]AD和MCI的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病例及對(duì)照的篩選。AD納入標(biāo)準(zhǔn)：采用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查（mini-mental state examination，MMSE），對(duì)得分小于下限（文盲組≤17分、小學(xué)組≤20分、中學(xué)及以上組≤24分）[7]的有認(rèn)知能力損害的患者，進(jìn)一步做蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montrealcognitive，Moca）、日常生活能力評(píng)定（activity of daily living，ADL）、缺血量表 （Hachinski ischemic scale，HIS）、臨床癡呆評(píng)定量表（clinical dementia rat ing，CDR）、總體衰退量表（gobal deterioration scale，GDS）等。MCI納入標(biāo)椎：①M(fèi)MSE評(píng)分：文盲18～21分，小學(xué)文化程度21～24分，中學(xué)文化程度25～27 分；②GDS評(píng)分為 2～3 級(jí)；③HIS≤4[8]。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除患血管性癡呆、路易體癡呆、額顳葉癡呆等疾病的患者；②排除由于譫妄、重性抑郁、精神分裂癥所致患者；③排除依從性不好，不簽署知情同意書(shū)的老人。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：選取性別、年齡與病例組相匹配、日常生活功能良好、否認(rèn)神經(jīng)中樞性系統(tǒng)疾病史及癡呆家族史的老年人。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：排除近3個(gè)月內(nèi)有急性腦血管疾病史，排除可能導(dǎo)致癡呆的系統(tǒng)性疾?。ɡ缂谞钕俟δ軠p退、維生素B12或葉酸缺乏、低血鈣、HIV感染）的老人。共入選AD組37例（男 20例，女 17例），MCI組 63例（男 27例，女 36例），對(duì)照組126例（男51例，女 75例）。本研究獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，獲得受試者同意并簽署了知情同意書(shū)。

一般資料采集：統(tǒng)一收集所有研究對(duì)象的年齡、性別等一般資料以及既往病史資料（高血壓、糖尿病病史、吸煙、飲酒史等）；

血樣采集：采集所有受試者的晨間空腹外周靜脈血5 mL，取部分外周血在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）等相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè)；其余外周血存放于-80℃冰箱中，作為全基因組 DNA的提取用。

1.2 外周血全基因組DNA的提取DNA的分離：用 E.Z.N.A.TM血液 DNA試劑盒（OmegaBio-Tek，諾克羅斯，美國(guó)）從血液中提取DNA，操作上嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)上進(jìn)行。使用P2000分光光度計(jì)（Telo Fisher HealthInc.，Waltham，MA，美國(guó)）測(cè)量 DNA濃度。生物公司根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)端粒引物，并提供了實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑。

1.3 反應(yīng)體系按照2×MasterMix 5.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，Template 1.5 μL，H2O 3.0 μL 的反應(yīng)體系置于96孔板 （上海晶安生物科技有限公司）上，并封膜冰箱內(nèi)保存，將完全標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照（Thermo Fisher Scientiific，Uppsala，Sweden），水為陰性空白對(duì)照，于羅氏480熒光定量PCR儀器（Roche，Basel，Switzerland）中按操作步驟全自動(dòng)檢測(cè)。

1.4 絕對(duì)端粒長(zhǎng)度測(cè)量通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測(cè)外周血DNA的端粒重復(fù)拷貝數(shù)（T）和內(nèi)參單拷貝基因36B4基因的拷貝數(shù)（S），將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)的樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的Ct值表示為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)的循環(huán)數(shù)，根據(jù)4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)主要由PCR儀配套軟件收集（如圖1）。對(duì)不同引物分別分析，各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于分析樣本的這個(gè)基因的拷貝數(shù)。使用如下公式得到相應(yīng)的絕對(duì)端粒長(zhǎng)度：端粒長(zhǎng)度=端?？截悢?shù)/對(duì)照拷貝數(shù)/92×6。

圖1 測(cè)試樣品的溶解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

ROCHE480程序?yàn)椋?總變性：95℃，10 min；循環(huán) （45x）：95℃ 15 s，60℃ 1 min； 收集溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 10 s；降溫：40℃ 10 s；備注：收集熒光，持續(xù)收集熒光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示；計(jì)數(shù)資料以M（QL，QU）表示；符合正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)的三組計(jì)量資料比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；不符合正態(tài)性和（或）方差齊性檢驗(yàn)的三組計(jì)量資料間及組間的兩兩比較采用秩和檢驗(yàn)；采用雙變量相關(guān)分析方法計(jì)算ATL與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較三組間一般資料在性別、年齡、空腹血糖、TG、TL、LDL原發(fā)性高血壓、糖尿病、吸煙和飲酒狀況等比較中均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見(jiàn)表 1）。

2.2 ATL在AD、MCI和對(duì)照組間的比較AD組ATL 為：0.0503（0.0446，0.0543），MCI組為：0.0464（0.0456，0.0476）， 對(duì)照組為：0.0479（0.0463，0.0501），三組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組短于 AD 組（P=0.001），且短于對(duì)照組（P=0.0006），而 AD組 ATL與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖 2A）。

2.3 分層分析后AD、MCI和對(duì)照組的ATL（見(jiàn)表2）

2.3.1 按性別分組后ATL在AD、MCI和對(duì)照組間的比較（圖2B）男性中，ATL在AD組、MCI及對(duì)照組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組ATL短于AD組（P=0.012），且短于對(duì)照組（P=0.040）。女性中，ATL在 AD 組、MCI及對(duì)照組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組ATL短于對(duì)照組（P=0.007）。

2.3.2 按文化程度分組后ATL在AD、MCI和對(duì)照組間的比較（圖2C）高中以下學(xué)歷者中，ATL在AD組、MCI及對(duì)照組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組短于對(duì)照組（P=0.002）。 高中及以上學(xué)歷者中，ATL在AD組、MCI及對(duì)照組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組短于AD組（P=0.015）。

表1 AD組、MCI組和對(duì)照組間一般資料比較

2.3.3 按是否患高血壓分組后ATL在AD、MCI和對(duì)照組間的比較（圖2D）未患高血壓者中，ATL在AD組、MCI及對(duì)照組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組短于對(duì)照組（P=0.041）。患有高血壓者中，ATL在AD組、MCI及對(duì)照組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組短于 AD組（P=0.001），MCI組短于對(duì)照組（P=0.009）。

圖2 外周血DNA的ATL在AD、MCI和對(duì)照組間的比較 A：三組之間的比較；B：性別分層中三組之間的比較；C：文化程度分層中三組之間的比較；D：是否患高血壓分層中三組之間的比較；E：在年齡分層中三組之間的比較

2.3.4 按年齡分層分組 外周血DNA的ATL在AD、MCI和對(duì)照組間的比較，（圖2E）年齡在60～75歲者中，ATL在AD組、MCI及對(duì)照組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組短于對(duì)照組（P=0.009）。年齡在 76～90 歲者中，ATL 在 AD組、MCI及對(duì)照組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，MCI組短于 AD 組（P=0.008），MCI組短于對(duì)照組（P=0.018）。

表2 按性別及文化程度分組后AD、MCI及對(duì)照組的ATL

2.4 各組外周血DNA的ATL與相關(guān)臨床指標(biāo)的相關(guān)性從表3可見(jiàn)，在MCI組中，ATL與年齡呈正相關(guān)（r=0.264，P=0.037），余均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

表3 AD組、MCI組及對(duì)照組ATL與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

端?？梢员Ｗo(hù)攜帶遺傳信息的染色體的完整性，隨著年齡的增長(zhǎng)，端粒長(zhǎng)度逐漸縮短[10]，當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短到臨界值時(shí)，細(xì)胞將不再分裂，從而引起機(jī)體衰老以及其他功能失調(diào)[11-12]。有研究結(jié)果顯示，生活方式的不同會(huì)影響外周血DNA的 ATL，如 LIAN[4]和 RAFIEL等[5]的研究均表明，遵循健康生活方式 （包括較高的水果和蔬菜攝入量）的個(gè)體，外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)。且近年來(lái)國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)ATL在不同認(rèn)知水平患者中的差異，2006 年 HONIG 等[13]、2011 年HOCHSTRASSER等[14]、2012年HONIG 等[15]、2019年曼玉奎等[16]的研究結(jié)果均表明，AD患者ATL較對(duì)照組明顯下降；然而，MOVERARE-SKRTIC 等[17]于2011 年的研究則表明，AD患者外周血DNA的ATL與健康對(duì)照組相似，MCI患者外周血DNA的ATL較AD及對(duì)照組縮短。

本研究結(jié)果顯示MCI組外周血DNA的ATL較AD組及對(duì)照組顯著縮短，而AD組與對(duì)照組間ATL無(wú)差異，且在性別、文化程度、是否患高血壓及年齡的分層分析中也發(fā)現(xiàn)了MCI組ATL顯著縮短，該研究結(jié)果提示了在AD患者中可能存在某種使其端粒長(zhǎng)度維持穩(wěn)定的機(jī)制。國(guó)外已有學(xué)者對(duì)其做了相關(guān)研究[18-20]，AD患者ATL維持穩(wěn)定的原因可能在于：首先，AD會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)某些細(xì)胞丟失，而這些細(xì)胞中包含短端粒長(zhǎng)度的細(xì)胞數(shù)目較多，同時(shí)這些細(xì)胞內(nèi)伴隨有端粒的損耗以及亞端粒低甲基化的發(fā)生；其次，AD患者外周血中白細(xì)胞最長(zhǎng)端粒數(shù)目成比例下降，中等長(zhǎng)度端粒數(shù)目增加，最短端粒數(shù)目不變導(dǎo)致了AD患者中的端粒長(zhǎng)度偏于正常，而MCI患者中不存在上述生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)而使得MCI患者中ATL較AD組及對(duì)照組中短。

然而本研究在分層分析的兩兩比較中未發(fā)現(xiàn)女性AD組與MCI組間、文化程度在高中以下AD組與MCI組間、文化程度在高中及以上MCI組與對(duì)照組間、未患高血壓AD組與MCI組間、年齡在60～75歲AD組與MCI組間ATL存在差異，其原因可能在于ATL在女性中受到絕經(jīng)年齡早晚的影響[21]，絕經(jīng)年齡較晚的婦女ATL比絕經(jīng)年齡較早的婦女要長(zhǎng)，本研究中未能采集女性患者的絕經(jīng)年齡，在絕經(jīng)年齡中可能存在選擇偏移導(dǎo)致以上結(jié)果；其次，較低的受教育程度可能會(huì)掩蓋認(rèn)知功能下降的診斷[22-23]，進(jìn)而導(dǎo)致文化程度較低的患者診斷準(zhǔn)確率下降，從而結(jié)果中出現(xiàn)ATL變化不明顯；分層分析結(jié)果尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前有研究認(rèn)為，AD、MCI組端粒長(zhǎng)度與年齡呈負(fù)相關(guān)[24]，而在本研究結(jié)果分析中，MCI組端粒長(zhǎng)度與年齡之間呈正相關(guān)，由于本研究中樣本量較少，結(jié)果尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)漢族老年AD、MCI及正常對(duì)照組中外周血DNA的ATL存在差異，為AD及MCI發(fā)病機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。該結(jié)果與國(guó)內(nèi)研究結(jié)果存在差異，而與國(guó)外SOFIA MS等的研究結(jié)果相似，其原因可能在于新疆特殊的地理環(huán)境及飲食習(xí)慣。本研究結(jié)果提示AD患者中可能存在某種其ATL維持穩(wěn)定的機(jī)制，但尚需進(jìn)一步研究。