水稻萌發(fā)耐淹性鑒定評價方法研究及種質(zhì)資源篩選

孫志廣 劉艷 李景芳 周振玲 邢運(yùn)高 徐波周群 王德榮 盧百關(guān) 方兆偉 王寶祥 徐大勇

（連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港222006；第一作者：zhiguangsun@126.com；*通訊作者：wbxrice@163.com；xudayong3030@sina.com）

隨著適宜直播水稻品種的成功培育和直播稻栽培技術(shù)水平的提高，加上種子萌發(fā)過程中提高對低氧的耐性有助于雜草的控制，資源和勞動力節(jié)約型的直播稻越來越受到種植戶的青睞[1-3]。土地的不平整和排水后的強(qiáng)降雨往往會導(dǎo)致直播稻播種后發(fā)生淹澇[4-5]。研究表明，土壤中O2含量超過3%才能滿足水稻對氧的正常吸收，O2含量超過5%水稻才能正常生長，而淹水6～10 h，稻田土壤中O2含量降至接近于0[6-7]。因此，淹澇會嚴(yán)重影響水稻種子的正常萌發(fā)，大幅降低直播稻的出苗率，進(jìn)而造成稻田缺棵斷壟、苗稀苗弱，給直播稻的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅[8]。強(qiáng)萌發(fā)耐淹性種質(zhì)在低氧環(huán)境脅迫下胚芽鞘能夠迅速伸長，這種淹水誘導(dǎo)的胚芽鞘伸長是幫助淹水植物重新與空氣接觸的重要逃逸機(jī)制[9]。因此，提高萌發(fā)期水稻品種的耐淹性有助于改善水稻的出苗整齊度及出苗率。

如何快速準(zhǔn)確篩選耐低氧萌發(fā)水稻種質(zhì)資源是培育萌發(fā)耐淹性水稻新品種和開展其遺傳機(jī)理研究的前提。建立簡便、高效而準(zhǔn)確的萌發(fā)耐淹性鑒定方法，明確水稻種質(zhì)萌發(fā)耐淹性評價標(biāo)準(zhǔn)是篩選萌發(fā)耐淹性水稻種質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。國內(nèi)外學(xué)者多采用水層隔絕空氣營造低氧環(huán)境，以淹水后的胚芽鞘長度為指標(biāo)進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定，該方法操作簡便、對設(shè)備要求不高，適合大規(guī)模種質(zhì)資源的篩選鑒定[10-12]。SUN 等[13]以30 ℃、10 cm 水深、萌發(fā)4 d 的胚芽鞘長為指標(biāo)進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定，在粳型雜草稻中克隆了決定低氧下強(qiáng)萌發(fā)的關(guān)鍵基因OsGF14h。王洋等[14]以30 ℃、5 cm 水深、萌發(fā)7 d 的胚芽鞘長為指標(biāo)進(jìn)行耐低氧萌發(fā)測定，在2 個水稻定位群體中檢測到8 個耐缺氧能力的QTL。JIANG等[15-16]以水溫30 ℃、水深20 cm、萌發(fā)5 d 后的胚芽鞘長為指標(biāo)評價了359 份水稻種質(zhì)的低氧發(fā)芽能力，表明水稻種質(zhì)間存在著明顯的地域和秈粳差異。陳孫祿等[17]在28 ℃、密閉的離心管中以萌發(fā)7 d 后的胚芽鞘長為指標(biāo)評價了256 份水稻種質(zhì)的萌發(fā)耐淹性，發(fā)現(xiàn)秈粳稻間的萌發(fā)耐淹性差異并不顯著。孫志廣等[18]以26 ℃、5 cm 水深、萌發(fā)7 d 的胚芽鞘長為指標(biāo)完成191份種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性鑒定，篩選獲得12 份強(qiáng)萌發(fā)耐淹性種質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)種質(zhì)資源間的萌發(fā)耐淹能力沒有明顯的地域性差異。由此可見，以往評價不同水稻種質(zhì)萌發(fā)耐淹能力時，由于缺乏統(tǒng)一的萌發(fā)耐淹性評價體系，在淹水天數(shù)、淹水溫度、淹水深度等方面存在較大差異，導(dǎo)致各研究者之間的鑒定結(jié)果難以比較，不利于水稻萌發(fā)耐淹性研究工作的開展。因此，確立萌發(fā)耐淹性鑒定的適宜淹水深度、調(diào)查時間和環(huán)境溫度十分必要。

本研究利用20 份水稻種質(zhì)資源分析低氧環(huán)境不同梯度處理下（溫度、調(diào)查時間、淹水深度）水稻胚芽鞘的長度，明確了水稻萌發(fā)耐淹性鑒定適宜的淹水深度、溫度和最佳調(diào)查時間，建立了一種簡便高效的水稻萌發(fā)耐淹性鑒定評價方法，并利用該方法進(jìn)行水稻萌發(fā)耐淹性種質(zhì)資源篩選，為水稻萌發(fā)耐淹性優(yōu)異種質(zhì)資源的發(fā)掘和創(chuàng)新利用提供有效方法和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料共計160 份，其中20 份種質(zhì)用于水稻萌發(fā)耐淹性鑒定方法的建立，分別來自我國江蘇、浙江、天津、廣東、安徽、江西以及印度的具有不同萌發(fā)耐淹能力的水稻品種（表1）。其余140 份材料用于種質(zhì)資源篩選。這些水稻種質(zhì)資源于2020年5 月15 日播種于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛農(nóng)場試驗(yàn)基地（東經(jīng)119°32′，北緯34°56′），10 月15 日同時收獲，為減少種子休眠帶來的影響，所有供試材料均在50 ℃條件下處理1周以打破種子休眠。本實(shí)驗(yàn)于2021年7—9 月在連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

表1 參試品種名稱及來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻萌發(fā)耐淹性鑒定方法確立

每品種挑選飽滿均一的干種子36 粒，分3 次重復(fù)，在1.5%（v/v）次氯酸鈉溶液中處理12 min，并用純水沖洗8 次，將種子置于20 cm 深的透明塑料杯中，隨后將純水小心的倒入杯中，確保種子沉入杯底。共設(shè)3個溫度梯度（20 ℃、25 ℃和30 ℃）、7 個時間梯度（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d）和6 個水深梯度（3 cm、6 cm、9 cm、12 cm、15 cm 和18 cm），將這些杯子根據(jù)不同處理置于不同參數(shù)的人工氣候培養(yǎng)箱（海博RX-500DH）中，每天傍晚檢查水位線刻度并補(bǔ)充相應(yīng)水分，每3 d 更換1 次純水。按照預(yù)定處理天數(shù)測量胚芽鞘長，精確到1 mm，隨機(jī)區(qū)組排列，剔除雙極值后，取3 次胚芽鞘長度的平均值作為表型值進(jìn)行比較分析。

1.2.2 種質(zhì)資源篩選

參照本研究確立的方法進(jìn)行水稻萌發(fā)耐淹性種質(zhì)資源篩選，溫度設(shè)置為30 ℃，淹水深度為20 cm（容器深度為20 cm，方便注水），在淹水后第11 d 測量胚芽鞘長度，其余步驟同上。

1.3 統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，利用GraphPad Prism 8.3.0 軟件進(jìn)行折線圖、箱線圖、頻率分布直方圖繪制和不同處理?xiàng)l件下參試種質(zhì)胚芽鞘長的描述性統(tǒng)計分析，利用萬深SC-E 種子大米外觀品質(zhì)檢測分析儀系統(tǒng)進(jìn)行參試種質(zhì)資源稻谷籽粒性狀分析，利用Origin 2021 軟件，根據(jù)Pearson’s 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 描述性統(tǒng)計分析

本研究發(fā)現(xiàn)，在各處理間粳稻的平均胚芽鞘長度均高于秈稻，除淹水6 cm 時粳稻的胚芽鞘長最小值低于秈稻外，其余各處理粳稻的胚芽鞘長最小值均大于秈稻；在16 個處理中，粳稻胚芽鞘長最大值低于秈稻的處理有5 個（淹水天數(shù)3 d、13 d、淹水深度6 cm、溫度20 ℃、25 ℃）；在各處理中，秈稻品種的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)均高于粳稻，說明秈稻品種的個體之間差異大，離散程度高（表2）。

表2 不同處理下胚芽鞘長描述性統(tǒng)計分析

2.2 低氧脅迫對水稻胚芽鞘長度的影響

在30 ℃條件下，淹水深度為3 cm 時參試粳稻的平均胚芽鞘長為50.8 mm，淹水深度≥6 cm 時參試粳稻的胚芽鞘長顯著降低，平均為43.5 mm，各處理之間差異不顯著；當(dāng)淹水深度為3 cm 和6 cm 時，參試秈稻的平均胚芽鞘長分別為45.5 mm 和40.1 mm，淹水深度≥9 cm 時參試秈稻的胚芽鞘長顯著降低，平均為35.4 mm，各處理間差異不顯著（圖1A）。在淹水深度20 cm 條件下，溫度分別為20 ℃和25 ℃時，粳稻種質(zhì)的平均胚芽鞘長分別為29.1 mm 和28.4 mm，兩者間差異不顯著；當(dāng)溫度升高至30 ℃，粳稻種質(zhì)的平均胚芽鞘長升高到42.5 mm，與20 ℃和25 ℃溫度處理存在極顯著差異；溫度為20 ℃、25 ℃和30 ℃時，參試秈稻的平均胚芽鞘長分別為23.7 mm、24.4 mm 和36.5 mm，變化趨勢與粳稻一致（圖1B）。調(diào)查時期梯度處理結(jié)果表明，隨著處理時間的延長，所有參試材料的胚芽鞘長度均呈不斷增加的趨勢（圖1C）。

圖1 不同低氧條件下秈粳稻胚芽鞘長的比較

2.3 水稻萌發(fā)耐淹性最適溫度、淹水深度、調(diào)查時期確定

從圖1A 可見，當(dāng)淹水深度≥6 cm 時，參試粳稻種質(zhì)的平均胚芽鞘長不再降低，維持在一個比較穩(wěn)定的水平，因此，認(rèn)為粳稻種質(zhì)萌發(fā)耐淹性鑒定的臨界水深為6 cm；同理，參試秈稻種質(zhì)萌發(fā)耐淹性鑒定的臨界水深為9 cm。由圖2A 可見，無論是秈稻還是粳稻，其胚芽鞘長的四分位差均在30 ℃處理時達(dá)到最大，因此，推測在30 ℃下進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定能夠較好將不同水稻品種的低氧發(fā)芽能力予以區(qū)分。從圖2B 可見，隨著調(diào)查時間的增加，參試種質(zhì)胚芽鞘長的四分位差呈先增加后降低的趨勢，秈粳稻均在第11 d 達(dá)到峰值，因此認(rèn)為淹水處理11 d 是水稻萌發(fā)耐淹性鑒定調(diào)查的最佳時期。

圖2 不同低氧脅迫下秈粳稻胚芽鞘長的四分位差

2.4 籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性的相關(guān)性分析

為了解析水稻籽粒性狀對萌發(fā)耐淹性的影響，本研究對參試種質(zhì)的籽粒性狀與低氧下的胚芽鞘長進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，參試種質(zhì)的萌發(fā)耐淹性與千粒重、粒寬呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.69、0.68；與籽粒長寬比、粒長呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.65、-0.46（圖3A）；將秈粳亞種單獨(dú)分析，發(fā)現(xiàn)粳稻的萌發(fā)耐淹性僅與千粒重呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.65，而秈稻的萌發(fā)耐淹性與籽粒性狀不相關(guān)（圖3B 和圖3C）。

圖3 籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性的相關(guān)性分析

2.5 萌發(fā)耐淹性種質(zhì)資源篩選

利用上述確立的鑒定方法，對140 份地方種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定，結(jié)果表明，參試種質(zhì)在低氧條件下的胚芽鞘長呈連續(xù)性分布，變化范圍為13.6～56.8 mm，平均值為41.8 mm，變異系數(shù)為19.0%，說明這些品種的低氧萌發(fā)能力具有廣泛的遺傳多樣性（圖4）；其中處于40～45 mm 范圍內(nèi)的品種最多，達(dá)到35份，占比25.0%，其次是45～50 mm 和35～40 mm 范圍，分別為29 個和23 個，三者合計占總數(shù)的62.1%。參試品種中達(dá)到強(qiáng)萌發(fā)耐淹性的品種有6 份（胚芽鞘長≥55 mm），分別為二郎早、九月黃、穞稻、山紫糯、紅殼糯和興國，可作為親本資源進(jìn)行強(qiáng)萌發(fā)耐淹性水稻新品種的培育。

圖4 140 份種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性頻率分布直方圖

3 討論與結(jié)論

在淹水脅迫下，“拿住苗”是直播水稻生產(chǎn)的關(guān)鍵問題，因此，選用低氧發(fā)芽能力強(qiáng)的水稻品種對直播水稻的安全生產(chǎn)十分重要。相對于其他谷類作物，水稻具有較強(qiáng)的低氧發(fā)芽能力，但是品種間仍存在較大差異，如何高效、準(zhǔn)確評價水稻種質(zhì)的萌發(fā)耐淹性成為培育適宜直播水稻新品種和開展水稻低氧萌發(fā)遺傳機(jī)理研究的限制性因素[19]。利用水層隔絕空氣營造低氧環(huán)境，以淹水后的胚芽鞘長度作為指標(biāo)被認(rèn)為是水稻萌發(fā)耐淹性鑒定簡便、可靠的方法，為大規(guī)模種質(zhì)資源篩選、定位群體的表型鑒定奠定了重要的方法基礎(chǔ)。

本研究利用梯度試驗(yàn)的方法，運(yùn)用四分位差法分析，確定了水稻萌發(fā)耐淹性鑒定的臨界淹水深度、最適溫度和最佳調(diào)查時期，為水稻萌發(fā)耐淹性研究提供了有據(jù)可依的鑒定方法。利用本研究確立的方法，穞稻、南粳46 的胚芽鞘長分別為56.3 mm 和49.5 mm，表現(xiàn)出較強(qiáng)的萌發(fā)耐淹性，與前人研究結(jié)果一致[20-21]。ANGAJI 等[22]利用強(qiáng)萌發(fā)耐淹性水稻品種Khao Hlan On的BC2F2群體定位到5 個萌發(fā)耐淹性QTL，在該研究中，來自國際水稻研究所的2 個秈稻品種IR42 和IR64被列為感性對照；在本研究種質(zhì)資源篩選中，R42、IR64的胚芽鞘長分別為28.6 mm 和32.0 mm，表現(xiàn)為低氧敏感，這與ANGAJI 等的研究結(jié)果一致。侯名語等[16]利用耐水淹品種Kinmaze 的重組自交系進(jìn)行萌發(fā)耐淹性QTL 定位，在水稻第1、2、5 和7 染色體上共檢測到5個QTL，低氧敏感秈稻品種DV85 淹水5 d 后的胚芽鞘長僅為3 mm，表現(xiàn)為極感。利用本研究確立的方法，DV85 淹水11 d 后的胚芽鞘長為13.6 mm，在所有參試種質(zhì)中最短，同樣表現(xiàn)為極感。以上這些結(jié)果證明了本研究確立的萌發(fā)耐淹性鑒定方法是可靠的。

由于淹水后的氧氣含量急劇下降，碳水化合物的分解代謝從有氧途徑轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬跬緩?，這一過程中，ATP的產(chǎn)生效率比有氧呼吸低18 倍，因此強(qiáng)萌發(fā)耐淹性水稻種質(zhì)需要更多的能量儲存來滿足胚芽鞘的伸長[23-25]。由此我們推測籽粒性狀可能與水稻種質(zhì)的萌發(fā)耐淹能力存在一定關(guān)聯(lián)，因此，本研究對供試材料的籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性進(jìn)行了相關(guān)性分析，探討萌發(fā)耐淹性與籽粒性狀的關(guān)系，以期為強(qiáng)萌發(fā)耐淹性水稻新品種選育提供參考。經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，粳稻淹水后的胚芽鞘長度與籽粒的千粒重呈顯著的正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.65），而秈稻的籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性不相關(guān)，因此育種家在選育適宜輕簡栽培的粳稻新品種過程中，應(yīng)注意加強(qiáng)對大粒重單株的選擇。