基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討EGFR/JAK1/STAT3通路在片仔癀抗肝纖維化中的作用

林春鳳，熊清，寧瀟雨，洪文謙，林凡，張玉琴，鄭海音*

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由于病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎和膽汁淤積性肝病等病變長期慢性刺激肝臟，引起損傷和修復反應失調(diào)，使細胞外基質(zhì)的合成大于降解，沉積異常，最終改變肝臟結(jié)構(gòu)和/或功能［1］。肝纖維化會進一步導致為肝硬化，嚴重者會導致肝癌和肝衰竭等。針對肝纖維化的有效治療可以預防和延緩其向肝硬化進展，但是由于早期抗病毒治療效果較差、抗炎時間長及戒酒難度大，晚期肝移植的供體來源困難及術(shù)后風險等原因，臨床上亟須更有效的防治手段［2］。

片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）是主要由三七、麝香、牛黃和蛇膽等組成的中成藥，具有解毒清熱、消腫散結(jié)、活血化瘀的作用，臨床上可用于抗炎［3］、抗自身免疫性疾?。?-5］、抗腦損傷［6］、保肝［7］、抗肝纖維化［8］及抗腫瘤［9-11］等。片仔癀的臨床研究已取得較大進展，但其抗肝纖維化的藥理作用機制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是建立在藥物、靶點以及疾病之間相互作用關(guān)系網(wǎng)基礎(chǔ)之上，通過網(wǎng)絡(luò)分析手段，從整體上去探索中藥的基本特征，觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的影響以及藥物之間的相互作用關(guān)系［12］，其在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應用日趨成熟。本研究在片仔癀前期工作的基礎(chǔ)上［8，13-14］，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，結(jié)合體內(nèi)實驗驗證，探究片仔癀治療肝纖維化的作用靶點及可能機制，為臨床應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCM-ID（http：//bidd.group/TCMID/）、Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、中國知網(wǎng)（https：//www.cnki.net）等數(shù)據(jù)庫對片仔癀組方主要藥物三七、牛黃、蛇膽、麝香進行活性成分檢索。通過口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）進行篩選，選取同時滿足OB≥30%、DL≥0.18的化學成分作為候選活性成分，導入UniProt數(shù)據(jù)庫獲取靶點基因名稱，獲得片仔癀活性成分的潛在靶點。將篩選出的活性成分及對應潛在靶點上傳至Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 肝纖維化疾病靶點的預測 以“l(fā)iver fibrosis”、“hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）疾病靶點數(shù)據(jù)庫中檢索與肝纖維化相關(guān)的靶點，刪除重復項目。

1.3 片仔癀-肝纖維化靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點分析 將片仔癀靶點與肝纖維化交集得到共同靶點，并繪制韋恩圖。隨后將共同靶點在STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中構(gòu)建PPI（Protein-Protein Interaction Networks）網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape 3.7.2軟件中進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析獲得核心靶點。

1.4 GO富集分析和KEGG信號通路分析 將篩選得到的靶點，通過BioMart（http：//www.biomart.org）轉(zhuǎn)換成Gene Stable ID，再利用OmicShare（https：//www.omicshare.com）平臺進行GO和KEGG動態(tài)富集分析。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗動物 選擇6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量（20±2）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房，適應性喂養(yǎng)1周后用于實驗。該動物實驗方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（倫理審批號：FJTCM-IACUC-2022019）。

1.5.2 實驗藥物及試劑 片仔癀（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，貨號：Z35020243）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：C009-2-1、C010-2-1）；EGFR一抗（英國abcam公司，批號：ab52894）；JAK1一抗（英國abcam公司，批號：ab133666）；STAT3一抗（美國CST公司，批號：D3Z2G）；p-JAK1一抗（美國CST公司，批號：D7N4Z）；p-STAT3一抗（英國abcam公司，批號：ab76315）；GAPDH一抗（美國CST公司，批號：D16H11）。

1.5.3 實驗儀器 高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：5417R）；光學顯微鏡（日本尼康公司，型號：ECLIPSE511）；化學發(fā)光成像儀（美國Bio-Rad公司，型號：Universal Hood）；酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司，型號：352型）；石蠟包埋機（中國亞光醫(yī)用公司，型號YB-7LF）。

1.5.4 造模、給藥及取材 小鼠采用隨機數(shù)字法分為正常對照組、模型組和片仔癀組，每組8只。除正常對照組外，余均予CCl4∶花生油（1∶9）溶液5 mL/kg腹腔注射誘導HF模型［14］，每周2次，連續(xù)給藥4周，以肝組織病理形態(tài)具有炎癥浸潤及纖維化特點為造模成功標準。片仔癀溶于0.9%氯化鈉溶液，配制成0.023 4 g/mL溶液。在造模同時，片仔癀干預組每日以0.234 g/kg片仔癀藥液灌胃。除正常對照組外，均予高脂飼料。取材前，每只小鼠腹腔注射20%烏拉坦溶液（0.5 mL/kg）麻醉后摘眼球取血，隨后取出肝臟，稱取肝臟質(zhì)量，計算肝指數(shù)。

肝指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

1.5.5 肝組織HE染色及Masson染色 各小鼠肝大葉，切成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，4%多聚甲醛浸泡，固定24 h，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟至水，分別進行HE染色和Masson染色（操作步驟按試劑說明書），中性樹膠封固鏡檢。

1.5.6 指標檢測 用高速離心機離心后取上清即為血清，用ALT、AST檢測試劑盒參照使用手冊進行測定。取小鼠肝組織，液氮研磨后加入裂解液，冰上靜置30 min，12 000 r/min，離心15 min，取上清液，測定濃度后，4∶1加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min后，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，TBST清洗3次×5 min，孵育一抗［EGFR（1∶1 000）；JAK1（1∶1 000）；STAT3（1∶1 000）；p-JAK1（1∶1 000）；p-STAT3（1∶1 000）；GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃搖床過夜；TBST清洗，孵育二抗（1∶10 000）1 h，TBST清洗，顯影液1∶1配置后顯影。

1.5.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料服從正態(tài)分布以（）表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 片仔癀的活性成分與藥物靶點篩選 通過TCMSP等數(shù)據(jù)庫檢索并篩選，獲得片仔癀的有效化學成分共31種，刪去重復項后共24種，見表1。根據(jù)度值和中介中心性排序獲得主要活性成分有槲皮素、熊果酸、β-谷甾醇等。篩選出片仔癀活性成分的不重復作用靶點共有217個。將中藥、化合物和對應靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，獲得片仔癀藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。

圖1 片仔癀藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表1 片仔癀主要化學成分表

2.2 藥物-疾病的共同靶點 通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫查詢獲得肝纖維化相關(guān)靶點7 043個。將片仔癀的靶點與肝纖維化的靶點做韋恩圖取交集，得到共同靶點196個，即片仔癀治療肝纖維的潛在靶點。見圖2。

圖2 片仔癀靶點和肝纖維化靶點交集韋恩圖

2.3 共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點分析 經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫獲取片仔癀治療肝纖維化潛在作用靶點的互相作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape 3.7.2軟件分析篩選核心靶點。其中以中介中心性和度值聯(lián)合篩選出排名前20位的核心靶點分別為：Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、JUN、IL-1β、EGFR、CASP3、PTGS2、MYC、ESR1、STAT3、HIF1A、MMP9、EGF、PPARG、FOS、CXCL8和CCND1。見圖3。

圖3 片仔癀治療肝纖維化的核心靶點

2.4 核心靶點GO和KEGG通路富集分析 對片仔癀-肝纖維化的196個共同靶點進行GO富集分析，得到7 651個條目，其中生物過程（BP）6 206條，細胞組成（CC）537條，分子功能（MF）908條，取各前10個條目。圖中藍色代表生物過程，橙色代表分子功能、綠色代表細胞組分，其中免疫系統(tǒng)過程、細胞增殖、抗氧化活性與肝纖維化有關(guān)。見圖4。

圖4 片仔癀治療肝纖維化靶點的GO富集分析

經(jīng)Omicshare網(wǎng)站進行KEGG通路分析，獲得片仔癀-肝纖維化兩者共關(guān)聯(lián)信號通路175條（P＜0.05）。主要涉及到癌癥、糖代謝、乙型肝炎、細胞因子（TNF、IL-17）等信號通路，其中片仔癀治療肝纖維化的核心靶點中表皮生長因子（EGF）、表皮生長因子受體（EGFR）、信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）均富集在癌癥信號通路上。見圖5。

圖5 片仔癀治療肝纖維化靶點的KEGG富集分析

2.5 3組小鼠肝組織形態(tài)比較 肉眼觀察發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠肝臟顏色紅潤，表面光滑；模型組小鼠肝臟略顯黃褐色，表面粗糙有顆粒感；片仔癀組小鼠與模型組相比，表面光滑，顏色較紅潤。

病理組織切片HE染色結(jié)果顯示：正常對照組小鼠肝組織形態(tài)正常；模型組小鼠肝細胞嚴重水腫，胞漿疏松淡染，以及炎性細胞浸潤，纖維結(jié)締組織大量增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；片仔癀組肝細胞脂肪變性明顯減少，炎性細胞浸潤減少。

Masson染色結(jié)果顯示：模型組肝組織內(nèi)膠原纖維比正常對照組明顯增多（藍色區(qū)域），肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；片仔癀組小鼠肝纖維化程度明顯減輕。見圖6。

圖6 各組小鼠肝及組織形態(tài)（HE染色、Masson染色，×200）

2.6 3組小鼠肝指數(shù)的影響 見圖7。

圖7 3組小鼠肝指數(shù)比較

2.7 3組小鼠血清ALT、AST的含量比較 見圖8。

圖8 3組小鼠血清ALT、AST含量比較

2.8 3組小鼠肝組織EGFR、JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3蛋白量表達的影響 見圖9。

圖9 3組小鼠肝組織EGFR、JAK1、p-JAK1、STAT3及p-STAT3蛋白相對表達量

3 討 論

肝纖維化表現(xiàn)出乏力納差、惡心嘔吐、腹脹不適、脅肋部隱痛等癥狀，該病歸屬為“肝積”“鼓脹”“黃疸”等［15］。大多數(shù)醫(yī)家均認為由濕熱疫毒之邪侵擾機體，正邪交爭而損傷機體，從而導致血瘀痰毒蘊結(jié)，臟腑氣血陰陽失調(diào)而發(fā)病［16］。病位涉及肝、脾、腎三臟，可影響到氣、血、水的運行。因此治療上需清熱解毒、活血化瘀［17］。片仔癀是主要由三七、麝香、牛黃、蛇膽等組成，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀、扶正祛邪的功效，其組方配伍與肝纖維化中醫(yī)辨證論治中清熱、化瘀、散結(jié)等治法相吻合。臨床上可用于多種原因所致急慢性肝炎、肝損傷等疾患。

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析表明，片仔癀抗肝纖維的關(guān)鍵靶點可能為Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、JUN、IL1B、EGFR、CASP3、PTGS2、MYC、ESR1、STAT3等。進而通過GO、KEGG通路富集分析顯示，主要調(diào)控的信號通路有癌癥、糖代謝、乙型肝炎、TNF、IL-17等信號通路。其中，片仔癀與肝纖維化的核心靶點EGFR、STAT3富集在EGFR/JAK1/STAT3信號軸上。

癌癥信號通路中的EGFR/JAK1/STAT3信號軸參與細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等很多重要生物學過程。EGFR近膜端有能與非受體型酪氨酸蛋白激酶（JAKs）相互作用的區(qū)域，而其遠膜端能被活化的JAK磷酸化。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化在控制JAK/STAT通路中起核心作用。此類受體是借助JAKs激活信號轉(zhuǎn)導子和STAT而最終作用于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。因此，活化的EGFR可激活JAK/STAT信號發(fā)揮作用［18］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ和IL-6等炎癥因子可促進JAK/STAT信號激活，進而發(fā)揮其免疫調(diào)控功能。IL-6是機體免疫應答的重要炎癥介質(zhì)，IL-6結(jié)合受體后可活化JAK1，并促使STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活，最終調(diào)控炎癥反應［19-20］。

肝纖維化是肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過程，是慢性肝臟疾病向肝硬化甚至肝癌等病變的起因［21］。片仔癀臨床上可用于多種原因所致急慢性肝炎、肝損傷等疾患［22-23］。ALT、AST是反映肝臟正常代謝功能的重要生化指標，當肝臟受損時，ALT及AST含量將升高。與正常對照組比，模型組小鼠血液中ALT、AST含量升高，表明模型組小鼠的肝功能受損；經(jīng)片仔癀治療后，這2種指標的含量均明顯降低，表示肝臟功能有明顯恢復。HE染色結(jié)果表明，模型組小鼠肝臟病理切片出現(xiàn)嚴重細胞水腫和炎癥，纖維結(jié)締組織增生，相比模型組，片仔癀干預后均明顯減少；Masson染色結(jié)果顯示，模型組肝組織內(nèi)膠原纖維明顯比正常對照組增多，而片仔癀干預后肝纖維化程度明顯減輕。已有各種證據(jù)表明，JAK1/STAT3信號通路密切參與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展，抑制JAK1/STAT3信號通路，可抑制肝星狀細胞的活化和促進其凋亡，從而起到抑制肝纖維化的作用［23-24］。本研究結(jié)果表明，CCl4誘導的肝纖維化模型組，EGFR、JAK1和STAT3這3個蛋白水平表達均比正常對照組明顯升高，且JAK1和STAT3磷酸化水平升高；片仔癀干預組可明顯下調(diào)以上3種關(guān)鍵蛋白。提示經(jīng)CCl4誘導的肝纖維化進展可能與EGFR/JAK1/STAT3信號軸的激活有關(guān)，片仔癀能夠明顯減輕CCl4誘導的小鼠肝纖維化狀態(tài)，其抗肝纖維化作用機制可能與EGFR/JAK1/STAT3信號軸有關(guān)。

綜上所述，片仔癀可以明顯降低肝損傷指標的血清含量，改善肝臟纖維化的病理改變，并通過調(diào)節(jié)EGFR/JAK1/STAT3信號軸起到抑制肝纖維化進程的作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法，闡述了片仔癀治療肝纖維化的相關(guān)機制，并進行了一定的實驗驗證。這為該方治療肝纖維化的應用提供實驗支持，可為后續(xù)深入研究提供線索。今后實驗可應用片仔癀作用于有關(guān)肝纖維化的細胞如肝星狀細胞、肝巨噬細胞等的體外實驗研究，進一步探索其機制。