從lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1信號(hào)通路探討透骨消痛膠囊改善膝骨關(guān)節(jié)炎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究

付長(zhǎng)龍，梅陽陽，謝新宇，涂海水，葉錦霞，鄭春松，馬德尊*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101）

關(guān)節(jié)軟骨退行性變是膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）的主要病理特點(diǎn)［1-2］。關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可顯著加劇KOA病情［3］，其中跨膜蛋白肌醇激酶1α（IRE1α）/X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）途徑是導(dǎo)致KOA關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生ERS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，KOA關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生ERS與長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的調(diào)控密切相關(guān)，尤其lncRNA NEAT1功能的發(fā)揮將影響KOA病理進(jìn)程［6］。

KOA的核心病機(jī)是“本痿標(biāo)痹”，因此對(duì)KOA的治則宜行補(bǔ)肝腎祛風(fēng)濕之法［7］。透骨消痛膠囊（由巴戟天、白芍、川芎、腫節(jié)風(fēng)組成）作為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有補(bǔ)腎柔肝、活血祛風(fēng)的功效，臨床治療KOA療效顯著［8］。但lncRNA NEAT1與IRE1α/XBP1的調(diào)控關(guān)系在KOA的作用及透骨消痛膠囊的效用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 8周雄性C57BL/6小鼠（SPF級(jí)）48只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以分籠飼養(yǎng)，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007，實(shí)驗(yàn)過程及方法均符合福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求（倫理審批號(hào)FJTCMIACUC-2022120）。透骨消痛膠囊（閩藥制備字Z20190010000，福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，生產(chǎn)批號(hào)：202205005）；?；切苋パ跄懰幔ㄒ獯罄愃沟洗笏帍S，批號(hào)：1918）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 XBP1、ER伴侶蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、GAPDH（美國SAB公司，批號(hào)：9N29，9N29，4612，9306）；IRE1α（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：00101005）；Superkine超敏型ECL發(fā)光液（Abbkine生物公司，批號(hào)：ATVAP 2501）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)：027E2201 CA）；lncRNA NEAT1（Forward：GCAGGTGGCACTA CTTTGAG；Reverse：GTGACAACCATCTATTGAGCA ACT）、GAPDH（Forward：ACGGCAAGTTCAACGGCA CAG，Reverse：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）引物均由福州尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 微量紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組、造模與干預(yù) 48只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組12只、造模組36只。造模組動(dòng)物經(jīng)5%異氟醚吸入麻醉后，采用Hulth法誘導(dǎo)KOA模型［9］，待KOA模型建立后，再用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組12只、對(duì)照組12只、透骨消痛膠囊組12只。對(duì)照組予以牛磺熊去氧膽酸500 mg/kg進(jìn)行灌胃［10］；透骨消痛膠囊組選擇透骨消痛膠囊臨床等效劑量368 mg/kg進(jìn)行灌胃［11］；空白組和模型組給予等量生理鹽水灌服，灌胃劑量依據(jù)小鼠體質(zhì)量按周計(jì)算調(diào)整，4組均連續(xù)灌注胃4周。

2.2 組織取材與處理 于末次灌胃結(jié)束后，經(jīng)5%異氟醚吸入麻醉后處死。收集其余小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織，置于液氮中轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱冷凍保存。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 軟骨組織病理改變 將待測(cè)小鼠膝關(guān)節(jié)固定于小動(dòng)物Micro-CT的檢查槽中，開始掃描，設(shè)置的條件為：電壓60 kV，電流666 μA，分辨率為50 μm，掃描時(shí)間為30 min，獲得不同斷面的圖片，經(jīng)圖像二值化，對(duì)膝關(guān)節(jié)的掃描圖片進(jìn)行三維圖像重構(gòu)。

2.3.2 軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況 提取各組軟骨組織總蛋白，BCA進(jìn)行蛋白定量，配制12%分離膠和5%濃縮膠，上樣后進(jìn)行電泳，后經(jīng)轉(zhuǎn)膜（半干式），封閉2 h后洗膜，再將各條膜放入預(yù)先配置好的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP的一抗后置于4 ℃冰箱搖床過夜進(jìn)行充分震蕩反應(yīng)，待二抗反應(yīng)處理后，使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，于凝膠成像儀下進(jìn)行曝光成像，后分析儲(chǔ)存。

2.3.3 軟骨組織lncRNA NEAT1表達(dá)情況 按Trizol操作說明提取軟骨中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（）表示，多組間比較采用方差分析，若方差齊，多組間兩兩比較采用LSD-t法；若方差不齊，多組間兩兩比較則采用Games-Howell法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況 本次實(shí)驗(yàn)過程入組動(dòng)物無出現(xiàn)意外死亡。

3.2 軟骨組織影像學(xué)改變情況 拍攝Micro-CT觀察膝關(guān)節(jié)的形態(tài)變化，結(jié)果顯示與空白組比較，模型組半月板結(jié)構(gòu)缺失，脛骨平臺(tái)軟骨面欠光滑，呈現(xiàn)凹凸不平狀，并伴有明顯的骨贅增生；對(duì)照組、透骨消痛膠囊組小鼠內(nèi)側(cè)半月板結(jié)構(gòu)缺失，與模型組比較，其關(guān)節(jié)軟骨退變程度明顯減輕。見圖1。

圖1 膝骨關(guān)節(jié)炎模型Micro-CT鑒定結(jié)果

3.3 軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 Western blot結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，透骨消痛膠囊組與對(duì)照組的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1 4組軟骨組織中IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)量情況（）

表1 4組軟骨組織中IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)量情況（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

CHOP/GADPH 0.49±0.09 1.09±0.041）0.77±0.121）2）0.91±0.091）2）組別空白組模型組對(duì)照組透骨消痛膠囊組IRE1α/GADPH 0.54±0.06 1.06±0.011）0.76±0.031）2）0.83±0.021）2）XBP1/GADPH 0.49±0.01 1.21±0.011）0.83±0.071）2）0.94±0.041）2）GRP78/GADPH 0.50±0.04 1.07±0.051）0.74±0.011）2）0.87±0.011）2）

圖2 4組小鼠關(guān)節(jié)軟骨中相關(guān)蛋白條帶圖

3.4 小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平比較 qPCR結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，透骨消痛膠囊與對(duì)照組中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1水平比較（）

表2 小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1水平比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

lncRNA NEAT1 1.00±0.00 3.21±0.321）2.34±0.162）2.09±0.182）組別空白組模型組對(duì)照組透骨消痛膠囊組

4 討 論

研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可加劇OA軟骨退變［12］。ERS發(fā)生時(shí)，未折疊蛋白的異常堆積可促使GRP78從膜蛋白上解離，與結(jié)合未折疊蛋白結(jié)合，而IRE1α發(fā)生磷酸化后，可剪接并激活轉(zhuǎn)錄因子XBP1，XBP1的持續(xù)活化又可上調(diào)CHOP基因表達(dá)，而后者又可促使半胱天冬酶3（Caspase-3）表達(dá)，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡［13-14］。此外，GRP78也是XBP1靶點(diǎn)，受XBP1激活后發(fā)揮調(diào)控ERS作用［15-16］。?；切苋パ跄懰嶙鳛橐环NERS抑制劑，本研究結(jié)果亦證實(shí)，其可抑制KOA軟骨的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善軟骨退變程度。

lncRNA NEAT1作為一種與KOA發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的非編碼長(zhǎng)鏈RNA，在調(diào)控軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面充當(dāng)了重要的角色［17］。研究表明，在KOA軟骨和軟骨細(xì)胞中，lncRNA NEAT1含量表達(dá)顯著增高［18］；有研究證實(shí)，過表達(dá)lncRNA NEAT1可顯著上調(diào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)蛋白的XBP-1S/XBP-1U比值與GRP78表達(dá)［19］。而NEAT1下調(diào)可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控的細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示，在KOA模型小鼠軟骨組織中，lncRNA NEAT1基因水平較空白組顯著升高，IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白含量顯著升高，而經(jīng)透骨消痛膠囊干預(yù)后，小鼠軟骨組織中上述指標(biāo)表達(dá)呈顯著下降趨勢(shì)，進(jìn)而可以有效延緩KOA小鼠軟骨退變，這亦與本研究Micro-CT結(jié)果相一致。

綜上，本研究結(jié)果表明，透骨消痛膠囊可以有效延緩KOA小鼠軟骨退變，其機(jī)制與下調(diào)KOA小鼠軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1水平及IRE1α/XBP1信號(hào)通路相關(guān)蛋白含量表達(dá)，進(jìn)而緩解ERS密切有關(guān)。同時(shí)，本研究仍存在一定的局限性，即透骨消痛膠囊與lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1的內(nèi)在靶向調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。