基于氣相指紋圖譜及網(wǎng)絡藥理學探討微生物菌肥對太子參脂肪酸組成的影響及抗炎作用

劉瑩瑩，闞永軍，胡娟，周美蘭*

（1.福建省中醫(yī)藥科學院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

太子參是石竹科的植物孩兒參Pseudostellaria heterophyllaMiq.Pax ex Pax etHoffm的干燥塊根，性甘、味微苦；太子參有益氣健脾、生津和潤肺的功效［1］。太子參在我國具有悠久的用藥歷史，在福建省柘榮、江蘇省句容、貴州省施秉和安徽省宣城等地均有種植，因其具有豐富的藥用和營養(yǎng)價值，現(xiàn)已被列入“可用于保健食品的中藥材名單”。隨著太子參種植面積的日益擴大，連作障礙問題越發(fā)突出，導致品質退化、產(chǎn)量下降，嚴重影響了太子參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［2-3］。有研究表明太子參連作障礙的發(fā)生與太子參根系分泌物介導根圍微生物差異變異有關［4-5］。課題組前期分別采用哈茨木霉菌、芽孢桿菌、磷細菌等3種微生物菌肥進行試驗，研究發(fā)現(xiàn)太子參整個生長周期噴灑農藥次數(shù)減少，太子參單粒重顯著增加。張卓旻等［6］利用GC-MS對不同產(chǎn)地的太子參揮發(fā)性成分研究中發(fā)現(xiàn)太子參富含亞油酸、十八烷酸、棕櫚酸等多種脂肪酸類成分。為了進一步評價微生物菌肥對太子參中脂肪酸組成的影響，本研究首先采用氣相色譜法建立太子參脂肪酸指紋圖譜，對指紋圖譜中的共有峰進行GCMS定性鑒別，最后通過網(wǎng)絡藥理學方法探討太子參脂肪酸抗炎活性的潛在作用靶點，為太子參的質量控制標準研究和抗炎作用機制研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 太子參品種為“柘參2號”，種植于福建省柘榮縣英山鄉(xiāng)福建西岸生物科技有限公司的太子參GAP種植基地（S1和S2為對照種植太子參，S3～S5為哈茨木霉菌菌肥種植太子參，S6～S8為芽孢桿菌菌肥種植太子參，S9和S10為磷細菌菌肥種植太子參）。乙醇（批號：181111），石油醚（批號：2008051），甲醇（批號：1810251）均購自西隴科學股份有限公司；乙醚（江蘇強盛功能化學股份有限公司，批號：20150616）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160428）；氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160509）；三氯化硼-甲醇溶液（上海麥克林生化科技有限公司，批號：201424）；正己烷（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180424）。

1.2 儀器 氣相色譜儀（型號：GC-2014，配AOC-20i自動進樣器，F(xiàn)ID檢測器，日本島津公司）；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（型號：GC-MS QP-2020NX，日本島津公司）；氣相色譜柱（型號：HP-INNOWAX，30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國安捷倫公司）；超純水機（型號：GZY-P20-W，湖南科爾頓水務有限公司）；高速萬能粉碎機（型號：FW100，蘇州江東精密儀器有限公司）；分析天平［型號：AE240S，梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；旋轉蒸發(fā)儀（型號：R-100，瑞士BUCHI公司）；超聲儀（型號：KQ-500DV，昆山市超聲儀器有限公司）；離心機（型號：ST16R，賽默飛世爾科技公司）。

2 方法與結果

2.1 供試品前處理方法的選擇

2.1.1 甲酯化處理 精密稱取5.00 g太子參樣品粉末（過二號篩）于150 mL具塞三角瓶，加入100 mL石油醚，超聲（250 W，40 kHz）30 min，取出冷卻至室溫，過濾，濾液減壓蒸干，殘渣中加入5 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，置于60 ℃水浴鍋加熱30 min，取出冷卻至室溫，加2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，置于60 ℃水浴鍋加熱5 min，取出冷卻至室溫，精密加入2 mL正己烷，然后加入2 mL飽和氯化鈉溶液，振搖至反應完全，轉移至15 mL離心管，1 500 r/min離心5 min，正己烷層經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得太子參脂肪酸甲酯供試品溶液。

2.1.2 未甲酯化處理 精密稱取5.00 g太子參樣品粉末（過二號篩）于150 mL具塞三角瓶，加入100 mL石油醚，超聲（250 W，40 kHz）30 min，取出冷卻至室溫，過濾，濾液減壓蒸干，加2 mL正己烷溶解殘渣，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得太子參脂肪酸供試品溶液。分別將太子參脂肪酸甲酯供試品溶液和太子參脂肪酸供試品溶液注入氣相色譜儀并采集氣相色譜圖。見圖1。

太子參脂肪酸甲酯供試品溶液的氣相色譜圖中色譜峰的數(shù)量較為豐富，且峰面積顯著高于未甲酯化供試品溶液。提示對太子參脂肪酸進行甲酯化處理有利于太子參脂肪酸的檢出，故本研究過程中太子參脂肪酸均經(jīng)甲酯化處理后用于氣相色譜分析。見圖1A。

2.2 氣相色譜條件的優(yōu)化 本研究進一步對太子參脂肪酸氣相色譜檢測過程中的進樣方式、進樣口溫度、柱溫箱升溫程序等色譜參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)選的氣相色譜參數(shù)，色譜柱：HP-INNOWAX毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；檢測器：FID檢測器；燃燒氣：氫氣；載氣：高純氮氣；載氣流速：10.4 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：280 ℃；分流比：20∶1；進樣量：1 μL；柱溫箱升溫程序：200 ℃保持1 min，然后以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃，再以20 ℃/min的速率升溫至260 ℃，保持10 min。

2.3 色譜柱的選擇 按照“2.1”項下方法制備太子參脂肪酸甲酯供試品溶液，分別采用HP-INNOWAX毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）和HP-5毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）進行氣相色譜分離并采集氣相色譜圖。采用HP-5毛細管柱采集的太子參脂肪酸氣相色譜圖，在10 min左右出現(xiàn)明顯的色譜峰堆積，分離效果不佳，并且出現(xiàn)較大幅度的基線漂移；采用HP-INNOWAX毛細管柱采集的太子參脂肪酸氣相色譜圖，色譜峰數(shù)量較為豐富，且各主要色譜峰均能得到較好的分離，故本研究選擇HP-INNOWAX毛細管柱用于太子參脂肪酸的分析。見圖1B。

2.4 提取溶劑的選擇 分別采用乙醚、石油醚和乙醇提取太子參中的脂肪酸成分，經(jīng)甲酯化處理后注入氣相色譜儀并采集氣相色譜圖，以考察不同提取溶劑對太子參中的脂肪酸提取效率的影響。太子參乙醇提取供試品溶液的氣相色譜圖中幾乎未檢測到色譜峰，表明乙醇不適合太子參中脂肪酸的提取。太子參乙醚和石油醚供試品溶液的氣相色譜圖中均具有較為豐富的色譜峰，但考慮到乙醚極易揮發(fā)，且具有一定毒副作用，故本研究選擇石油醚作為太子參中脂肪酸的提取溶劑。見圖1C。

2.5 提取時間的考察 以石油醚為提取溶劑，分別提取15、30、60、90 min的太子參脂肪酸供試品溶液，以選擇太子參脂肪酸成分的最佳提取時間。提取時間15～60 min，所得太子參脂肪酸色譜圖中各主要色譜峰的峰面積逐漸增加；當提取時間增加至90 min時，各主要色譜峰的峰面積與60 min相比差異無統(tǒng)計學意義，因此，本研究選擇太子參中脂肪酸的提取時間為60 min。見圖1D。

2.6 方法學考察

2.6.1 精密度試驗 取同一太子參供試品（S1）溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄采集的色譜圖，以9號峰為參照，測得各共有峰的相對保留時間RSD均＜1.00%，相對峰面積RSD均＜4.48%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗 取同一太子參供試品（S1）溶液，按“2.2”項下色譜條件分別于0、6、12、24、48 h進樣，記錄采集的色譜圖，以9號峰為參照，測得各共有峰的相對保留時間RSD均＜3.98%，相對峰面積RSD均＜4.68%，表明太子參供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.6.3 重復性試驗 取同一太子參樣品（S1）平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件采集色譜圖，以9號峰為參照，測得各共有峰的相對保留時間RSD均＜2.99%，相對峰面積RSD均＜4.66%，表明該方法重復性良好。

2.7 GC指紋圖譜的建立及共有峰標定 取不同微生物菌肥種植的太子參樣品制備供試品溶液，按“2.5”項下色譜條件采集色譜圖。將不同批次太子參脂肪酸的氣相色譜數(shù)據(jù)導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A）中，以S1樣品圖譜為參照色譜進行Marker峰匹配，選取“時間窗”為0.1 min，采用多點矯正法生成太子參脂肪酸氣相色譜共有模式色譜圖。不同微生物菌肥種植所得太子參氣相色譜指紋圖譜（S1～S10）與對照圖譜相比相似度依次為：0.96、0.95、0.99、0.98、0.98、0.91、0.92、0.94、0.96、0.99，均＞0.91，提示不同微生物菌肥種植不影響太子參中脂肪酸類成分的組成，太子參脂肪酸氣相色譜共有模式色譜圖共識別獲得19個共有峰。見圖2、圖3。

圖2 不同菌肥太子參脂肪酸氣相色譜圖疊加圖

圖3 太子參脂肪酸氣相色譜圖共有模式

2.8 指紋圖譜中各共有峰的GC-MS定性分析 采用GC-MS技術對指紋圖譜中各共有峰進行定性鑒別。分別取S1、S3和S5號太子參供試品溶液進行GC-MS測定，其中GC色譜條件同“2.5”項下方法；MS條件：采用島津QP-2020NX型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行分析，離子源為電子轟擊（EI）源；離子源溫度為200 ℃；接口溫度為250 ℃；溶劑延遲時間為4.00 min；檢測器增益為0.73 kV；采集模式為Q1 Scan；采集間隔為0.3 s；采集速度為：2 000 amu/s；質量掃描范圍為45～600 m/z。采集獲得的質譜碎片信息分別采用NIST 2017和Wiley 9標準譜庫進行檢索。

分別對太子參脂肪酸指紋圖譜中19個共有峰進行譜庫檢索，檢索結果根據(jù)匹配度進行排序（且≥80%），選擇匹配度較高的化合物并結合文獻對各共有峰進行定性分析，共檢索獲得19個化合物，各共有峰的質譜檢測結果見表1。對各共有峰的相對百分含量采用峰面積歸一化法進行計算，結果顯示太子參脂肪酸主要由多種不飽和脂肪酸組成，如油酸、亞油酸、亞麻酸、順式-15-二十四烯酸、10-順-十七碳烯酸、順-11-二十烯酸、順-11，14-二十碳二烯酸等，其相對占比分別為7.50%、8.06%、0.98%、0.59%、0.20%、0.67%和0.29%；同時還含有飽和脂肪酸成分，如棕櫚酸、硬脂酸、十五烷酸、二十二烷酸、木蠟酸等，各成分相對占比分別為8.89%、1.01%、0.52%、0.91%和0.80%。

表1 太子參脂肪酸指紋圖譜共有峰GC-MS分析結果

2.9 抗炎潛在靶點預測 將GC-MS分析獲得的太子參脂肪酸獲取的化學成分分別導入TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/；物種信息選擇：Homo sapiens）數(shù)據(jù)庫篩選潛在靶點，所得靶點經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫的標準化，合并2個數(shù)據(jù)庫得到的靶點，刪除重復，從而獲得太子參脂肪酸的潛在作用靶點。疾病靶點通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）以“inflammation”為關鍵詞檢索獲取。將成分靶點和疾病靶點取交集，獲得太子參脂肪酸抗炎的潛在靶點。將太子參脂肪酸與共同靶點基因導入Cytoscape 3.9.1，構建太子參脂肪酸免疫調節(jié)的“成分-靶點”網(wǎng)絡，利用CytoNCA插件計算其網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，并篩選出與疾病靶點相互作用的化學成分。利用Metascape平臺（http：//metascape.org）針對太子參脂肪酸抗炎的潛在作用靶點進行GO富集分析，見圖4A。GO富集分析包括生物過程、分子功能和細胞組成，運用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對富集獲得的基因條目進行可視化處理，見圖4B。

圖4 太子參脂肪酸抗炎的潛在靶點網(wǎng)絡

通過TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫共篩選獲得太子參脂肪酸的作用靶點基因212個，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索炎癥相關基因，選擇相關系數(shù)較高的前400個靶點基因（相關系數(shù)不小于6.2），共獲得交集靶點27個潛在靶點基因，分別為IL-6、PTGS2、PLG、ICAM1、ALB、PPARG、RELA、ITGB2、NOS2、ALOX5、ABCB1、MAPK14、MMP3、PTGS1、PPARA、MMP2、NCF1、CTSG、NR3C1、VDR、NR1H4、MMP8、MAPK1、ADAM17、LTB4R、RBP4、PTGDR2。通過對太子參脂肪酸與潛在靶點基因的互作網(wǎng)絡進行拓撲分析，篩選獲得太子參脂肪酸抗炎的核心靶點為：PPARA、PTGS1、NR1H4、PTGS2、PPARG、ALOX5等；其中貢獻度較高的成分依次為α-亞麻酸、亞油酸、十六烷酸、γ亞麻酸、10-順-十七碳烯酸、順-11，14-二十碳二烯酸等。

3 討 論

本研究通過對樣品前處理方法、提取溶劑、提取時間、色譜柱等參數(shù)進行考察，建立的太子參中脂肪酸的GC指紋圖譜的測定方法，該方法所得到的色譜峰較為豐富，峰形對稱且分離度良好，采用該方法檢測哈茨木霉菌、芽孢桿菌、磷細菌等3種微生物菌肥對太子參中脂肪酸組成的影響，研究發(fā)現(xiàn)上述3種微生物菌肥種植不影響太子參中脂肪酸類成分的組成，進一步通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)篩選獲得了19個共有峰。

采用GC-MS技術實現(xiàn)了對太子參脂肪酸指紋圖譜中各共有峰進行定性鑒別，發(fā)現(xiàn)太子參脂肪酸主要由多種不飽和脂肪酸組成，如油酸、亞油酸、亞麻酸、順式-15-二十四烯酸、10-順-十七碳烯酸、順-11-二十烯酸、順-11，14-二十碳二烯酸等。亞油酸乙酯已廣泛應用于在抗炎、抗菌等方面，其可顯著抑制炎癥因子的釋放［7］。亞麻酸是機體必需的脂肪酸，在降血脂、抗血栓、抑制炎癥反應、抑制癌癥轉移等方面具有重要的生理學功能［8］。十六烷酸乙酯被報道為炎癥細胞抑制劑，降低炎癥滲出物中前列腺素E2的水平，并減輕角卡拉膠誘導的大鼠足腫脹，降低LPS誘導的內毒素血癥大鼠血漿中TNF-α和IL-6［9］。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法對太子參脂肪酸的抗炎機制進行初步探討，共篩選獲得27個潛在作用靶點。進一步篩選獲得太子參脂肪酸抗炎的核心靶點，依次為：PPARA、PTGS1、NR1H4、PTGS2、PPARG、ALOX5等；太子參脂肪酸中抗炎活性貢獻度較高的成分依次為α-亞麻酸、亞油酸、十六烷酸、γ亞麻酸、10-順-十七碳烯酸、順-11，14-二十碳二烯酸等。通過“成分-靶基因”互作網(wǎng)絡拓撲分析，得出太子參脂肪酸抗炎的活性成分及潛在的核心靶點。

綜上，本研究中建立了太子參脂肪酸成分的GC指紋圖譜的測定方法，發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌、芽孢桿菌、磷細菌等微生物菌肥種植不影響太子參中脂肪酸類成分的組成，并篩選獲得了19個共有峰，進一步采用GC-MS技術對各共有峰進行定性鑒別；采用網(wǎng)絡藥理學方法初步篩選了太子參脂肪酸抗炎的27個潛在作用靶點。為太子參藥材的質量控制標準研究和抗炎作用機制研究提供參考。