納米二氧化鈦與磷互作對萊茵衣藻砷累積與生物轉(zhuǎn)化的影響

張鑫，楊帆，于子悅，顏昌宙*

1.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實驗室

2.中國科學(xué)院大學(xué)

砷（As）是一種廣泛存在于水、大氣、土壤、巖石和生物體的有毒類金屬，被世界衛(wèi)生組織（WHO）國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）定級為一類致癌物質(zhì)。As 在天然水體中的濃度范圍很大，從小于0.5 μg/L到大于5 000 μg/L 不等，在地表富氧水體中主要以砷酸鹽〔As(Ⅴ)〕的形態(tài)存在[1]。越來越多的證據(jù)表明，即使是在較低的As 暴露水平（10 μg/L）下也會對人體健康產(chǎn)生影響[2]。藻類修復(fù)是一種綠色、低成本、可持續(xù)的水環(huán)境污染原位生物修復(fù)方法。浮游藻類細(xì)胞壁具有較大的表面積與黏性，可提供多種官能團(tuán)與As 結(jié)合，使其可有效地吸附和富集As 等離子[3]。李妍麗[4]研究了5 種淡水綠藻對As 污染水體的生物修復(fù)，發(fā)現(xiàn)1.0×107個/mL 藻細(xì)胞作用24 h后As(Ⅴ)（1 mg/L）的去除率為68.35%～85.45%，該研究還指出微藻在As(Ⅴ)修復(fù)過程主要涉及細(xì)胞表面官能團(tuán)，如羧基、氨基、羥基、磺酸基等。此外，微藻還能通過甲基化等途徑對As 進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化[5]，甲基化的As 還可以繼續(xù)轉(zhuǎn)化成為毒性相對較低的有機(jī)砷，如砷糖和砷脂等[6]，因而微藻在水體As 污染修復(fù)中具有很大的潛力。然而，自然水環(huán)境是一個非常復(fù)雜的體系，大部分As 與環(huán)境中的各種顆粒物（納米顆粒、腐殖酸等）共存。由于環(huán)境物質(zhì)可能會通過與As 競爭在微藻表面的結(jié)合位點(diǎn)[7]、影響細(xì)胞膜的滲透性[8]等方式改變As 在藻-液界面的物理化學(xué)行為，進(jìn)而調(diào)控As 在藻細(xì)胞中的吸附、吸收與形態(tài)轉(zhuǎn)化過程。因此，探究環(huán)境物質(zhì)包括納米顆粒對微藻As 吸收轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用，對于系統(tǒng)了解微藻對As 的代謝機(jī)制及其生態(tài)修復(fù)功能，具有十分重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

納米二氧化鈦（nano-TiO2）因其獨(dú)特的理化性質(zhì)在水處理、造紙、紡織等行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。預(yù)計到2025年，nano-TiO2的年產(chǎn)量約為250 萬t[9]，這將使其不可避免地暴露于水環(huán)境中。根據(jù)預(yù)測調(diào)查，地表水和廢水中nano-TiO2濃度為15 ng/L～16 μg/L，高暴露情境下地表水中nano-TiO2濃度可以達(dá)到mg/L 級別[10-12]。nano-TiO2因其較大的比表面積與吸附能力，能作為載體促進(jìn)As 在水生生物（鯉魚[13]、大型蚤[14]、豐年蝦[15]）中的攝入，并調(diào)控生物對As 的排泄與利用。針對浮游藻類的研究也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，如Luo 等[5]的研究表明，添加nano-TiO2后銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）對As 的累積和甲基化作用顯著增加。Yang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，nano-TiO2與As(Ⅴ)共暴露24 h 后，As 在擬微綠球藻（N. maritima）細(xì)胞碎屑組分中的分布顯著增加，而在細(xì)胞器組分中的占比卻顯著降低，該研究認(rèn)為細(xì)胞壁對納米顆粒的攔截效應(yīng)降低了As 對微藻的毒性作用。但是，目前關(guān)于nano-TiO2如何影響微藻As 累積與生物利用方面的研究仍相對較少，尤其是As 的代謝轉(zhuǎn)化方面，相關(guān)調(diào)控機(jī)理的揭示仍比較零散，缺乏系統(tǒng)性，有待開展深入研究。

筆者以模式生物——萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）為研究對象，以PO43-為限制性條件，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）和高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-ICP-MS）分析藻細(xì)胞中As 的累積量以及培養(yǎng)基和藻細(xì)胞中As 形態(tài)，研究nano-TiO2存在與否條件下，萊茵衣藻對As(Ⅴ) 累積代謝差異，探究nano-TiO2對萊茵衣藻As(Ⅴ)累積和生物轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用，以期為應(yīng)用微藻修復(fù)As 污染水體提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究用nano-TiO2為銳鈦礦晶型，其粒徑小于25 nm，純度大于99.7%，購于Sigma-Aldrich 公司。將nano-TiO2粉末分散于超純水中，配制成1 g/L 的儲備液，冰浴超聲30 min 后于4 ℃避光保存。試驗前，將儲備液稀釋至2 和20 mg/L，冰浴超聲30 min后待用。

采用Na3AsO4·12H2O (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制1 mmol/L 的As(Ⅴ)儲備液，試驗前稀釋至10 μmol/L。

1.2 藻種及培養(yǎng)條件

萊茵衣藻購于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，在TAP 培養(yǎng)基（pH=7.0）中懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光暗比為12 h∶12 h。藻種擴(kuò)增及培養(yǎng)過程中均采用無菌操作。

1.3 nano-TiO2沉降動力學(xué)及對As(Ⅴ)的吸附

采用紫外-可見光分光光度法監(jiān)測nano-TiO2在不同PO43-濃度TAP 培養(yǎng)基中的動力沉降過程[17]：在nano-TiO2濃度為2 和20 mg/L 納米混懸液冰浴超聲后的0、1、2、4、6、12、24、36、48 h，吸取適量樣品在370.5 nm 處測定樣品吸光度，以吸光度的變化表征nano-TiO2在不同PO43-濃度TAP 培養(yǎng)基中的動力沉降過程。

將As(Ⅴ)和冰浴超聲分散后的nano-TiO2添加到不同PO43-濃度的滅菌TAP 培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中As(Ⅴ) 終濃度為10 μmol/L，nano-TiO2終濃度為2 和20 mg/L，體系pH 調(diào)至7.0 后密閉置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（25 ℃、175 r/min）中，于0、1、2、4、6、12、24、48 h 取適量樣品，12 000 g 離心10 min，稀釋、過濾后，使用ICP-MS 測定上清液中As 濃度，通過其變化特征分析計算不同PO43-濃度下nano-TiO2在TAP 培養(yǎng)基中對As(Ⅴ)的吸附。

nano-TiO2在不同PO43-濃度TAP 培養(yǎng)基中對As(Ⅴ)的吸附率和吸附量計算公式如下：

式中：A為吸附率，%；B為吸附量，μg/mg；V為溶液體積，L；C0為As(Ⅴ) 初始濃度，μg/L；Ce為吸附后As(Ⅴ)濃度，μg/L；m為nano-TiO2質(zhì)量，mg。

1.4 萊茵衣藻試驗設(shè)置

分別設(shè)置了1 個As(Ⅴ) 濃度（10 μmol/L），3 個nano-TiO2濃度（0、2、20 mg/L）和4 個磷酸鹽（PO43-）濃度（0.013、0.1、0.5、1.0 mmol/L）進(jìn)行交叉試驗（表1）。PO43-濃度梯度設(shè)置，主要參考Zhang 等[18]的研究以及地表Ⅴ類水中PO43-濃度。通過高濃度的PO43-限制藻細(xì)胞對游離態(tài)As(Ⅴ)的吸收，比較萊茵衣藻對nano-TiO2結(jié)合態(tài)As(Ⅴ)、游離態(tài)As(Ⅴ)吸收與代謝的差異。

表1 試驗分組設(shè)計Table 1 Experimental group design

將預(yù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期的萊茵衣藻在4 ℃下于2 500 r/min 離心15 min，棄去上清液，用滅菌的無磷TAP 培養(yǎng)基清洗3 次，去除細(xì)胞表面吸附的PO43-。將藻細(xì)胞重新分散于無磷TAP 培養(yǎng)基中缺磷馴化3 d，以耗盡藻細(xì)胞內(nèi)儲存的PO43-，確保試驗不受藻細(xì)胞內(nèi)PO43-的干擾。將達(dá)到對數(shù)生長期的缺磷萊茵衣藻重懸于200 mL 滅菌TAP 培養(yǎng)基中，接種初始OD680為0.06（藻細(xì)胞密度約為1×105個/mL）。各試驗組設(shè)置3 個重復(fù)，培養(yǎng)條件與預(yù)培養(yǎng)一致，每天手搖3 次以保證氣體交換以及nano-TiO2顆粒與藻細(xì)胞充分接觸。暴露周期為8 d，每天定時測定藻細(xì)胞生長密度，并于第1、4、8 天收集一定量的藻液，測定不同處理條件下生長初期、對數(shù)生長期和靜止期萊茵衣藻對As 的累積，以及暴露結(jié)束時（第8 天）培養(yǎng)基和藻細(xì)胞中的As 形態(tài)。

1.5 總As 和As 形態(tài)分析測定

1.5.1 藻體總As 的測定

取一定量藻液于4 000 r/min、4 ℃下離心15 min 后收集藻細(xì)胞，用適量磷酸鹽緩沖液〔1 mmol/L K2HPO4、0.5 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O 和5 mmol/L MES，pH 為6.0〕和超純水清洗3 遍以去除萊茵衣藻細(xì)胞表面吸附的As。藻細(xì)胞冷凍干燥至恒質(zhì)量后，取5 mg 左右凍干藻樣加入純HNO3-HF 混合液（二者比例為5∶1）共1.2 mL 于微波消解（程序為600 W、2 min；0 W、2 min；450 W、45 min），用2%HNO3定容，經(jīng)0.22 μm水系過濾器過濾后，采用ICP-MS 測定樣品中As 濃度。

1.5.2 培養(yǎng)基與藻細(xì)胞中水溶性As 形態(tài)的提取與測定

萊茵衣藻暴露8 d 后取一定量的藻液離心，上清液經(jīng)0.22 μm 水系過濾器過濾后于-80 ℃保存，待測。藻細(xì)胞中As 形態(tài)的提取參照文獻(xiàn)[19-20]的方法：稱取一定量冷凍干燥后的藻樣，加入2 mL 超純水為萃取劑，冰浴超聲萃取10 min（100 W、40 Hz）后4 000 r/min 離心5 min；重復(fù)提取3 次，將離心的上清液合并后定容，提取液經(jīng)0.22 μm 水系過濾器過濾后于-80 ℃保存，待測。

培養(yǎng)基和萊茵衣藻藻細(xì)胞中的As 形態(tài)采用HPLC-ICP-MS 測定。將前置保護(hù)柱（11.2 mm，12～20 μm）與陰離子交換柱（Hamilton PRP-X100）串聯(lián)，使用流動相〔10 mmol/L (NH4)2HPO4，10 mmol/L NH4NO3，pH 為6.25〕對各As 形態(tài)進(jìn)行分離，同時配置不同濃度的As(Ⅲ)、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）和As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對樣品中As 的形態(tài)與濃度進(jìn)行鑒定與分析。檢測條件：進(jìn)樣體積50μL，流速1.0 mL/min，運(yùn)行時間10 min。

1.6 質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

在總As 和As 形態(tài)的測定過程中，以45Sc、72Ge和103Rh 為內(nèi)標(biāo)元素，以As 的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。分析過程中每10 個樣品對5.0 和20.0 μg/L As 標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行回測，確保測試信號的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性?？侫s、As(Ⅲ)、MMA、DMA 和As(Ⅴ) 的檢出限分別為0.01、0.07、0.12、0.07 和0.20 μg/L。使用紫菜標(biāo)準(zhǔn)品（GBW08521，中國國家標(biāo)準(zhǔn)材料研究中心）進(jìn)行質(zhì)量控制，總As 提取回收率為107.18%±0.43%。

采用Origin 2021b 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗PO43-和nano-TiO2共同作用下藻細(xì)胞密度、As 的累積和As 形態(tài)的差異，差異顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 nano-TiO2在TAP 培養(yǎng)基中的沉降及對As(Ⅴ)的吸附

納米顆粒在水體中存在團(tuán)聚、沉降等環(huán)境行為，會影響其對水生生物的毒性效應(yīng)。nano-TiO2在培養(yǎng)基中的保持率為吸光度與初始吸光度的比值。nano-TiO2的濃度對其在TAP 培養(yǎng)基中的沉降性能有著顯著的影響。由圖1 可知，試驗結(jié)束時（48 h），20 mg/L 的nano-TiO2在TAP 培養(yǎng)基中的保持率（9.65%±0.87%～13.53%±1.69%）顯著低于2 mg/L nano-TiO2（29.60%±0.71%～57.76%±1.14%），這與Brunelli等[21]的研究結(jié)果中初始濃度是影響nano-TiO2沉降的主要因素相符。由圖1(a) 可知，隨著PO43-濃度的增高，2mg/Lnano-TiO2在培養(yǎng)基中的保持率逐漸降低，Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)nano-TiO2在淡水中的沉降速率與PO43-濃度呈正相關(guān)，說明PO43-會降低nano-TiO2在TAP 培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性，從而降低nano-TiO2與萊茵衣藻之間的接觸機(jī)會。當(dāng)nano-TiO2濃度為20 mg/L 時〔圖1(b)〕，不同PO43-濃度對nano-TiO2在TAP 培養(yǎng)基中的保持率無明顯影響，這也說明與溶液中的PO43-濃度相比，nano-TiO2的初始濃度是其沉降的主要影響因素。

圖1 nano-TiO2在TAP 培養(yǎng)基中的保持率Fig.1 Retention rate of nano-TiO2in TAP medium

研究表明，nano-TiO2不僅對As 具有很強(qiáng)的吸附能力，還可能通過改變細(xì)胞表面特性影響藻類對As 的攝取以及影響微藻對As 后續(xù)的生物代謝[23-24]。nano-TiO2在不同PO43-濃度的TAP 培養(yǎng)基中對As(Ⅴ)的吸附如圖2 所示。nano-TiO2對As(Ⅴ)的吸附分為快速吸附和吸附平衡2 個階段。nano-TiO2濃度相同時，由于PO43-與As(Ⅴ) 的相似性，PO43-會與As(Ⅴ) 競爭nano-TiO2上的結(jié)合位點(diǎn)，nano-TiO2對As(Ⅴ)的吸附率隨PO43-濃度的升高而降低。當(dāng)達(dá)到吸附平衡時，2 mg/L nano-TiO2在不同PO43-濃度TAP 培養(yǎng)基中對As(Ⅴ) 的吸附率為6.92%±0.60%～18.10%±2.27% ， 吸附量為(2.60±0.22)～(7.04±0.88) μg/mg ； 20 mg/L nano-TiO2對As(Ⅴ)的吸附率顯著高于2 mg/L，吸附率為19.25%±1.28%～35.31%±1.08%，吸附量為(0.69±0.05)～(1.23±0.04) μg/mg。采用準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程來預(yù)測吸附過程的機(jī)理，公式如下：

圖2 nano-TiO2在TAP 培養(yǎng)基中對As(Ⅴ)的吸附率及吸附量Fig.2 Adsorption rate and adsorption capacity of As(Ⅴ) of nano-TiO2in TAP medium

準(zhǔn)一級動力學(xué)方程

準(zhǔn)二級動力學(xué)方程

式中：t為吸附時間，min；qt為t時刻nano-TiO2對As(Ⅴ)的吸附量，mg/g；qe為吸附平衡時，nano-TiO2對As(Ⅴ) 的吸附量，mg/g；k1為準(zhǔn)一級動力學(xué)方程速率常數(shù)，g/(mg·min)；k2為準(zhǔn)二級動力學(xué)方程速率常數(shù)，g/(mg·min)。

從表2 可知，準(zhǔn)一級動力學(xué)與準(zhǔn)二級動力學(xué)均能較好地擬合nano-TiO2在不同PO43-濃度的TAP培養(yǎng)基中對As(Ⅴ)的吸附過程，但是準(zhǔn)二級動力學(xué)的R2大于準(zhǔn)一級動力學(xué)，對該過程的描述相對更為精準(zhǔn)，這說明，nano-TiO2對As(Ⅴ)的吸附速率受化學(xué)吸附控制，Wagle 等[25-26]的研究也得到類似的結(jié)果。

表2 不同條件下的吸附動力學(xué)參數(shù)Table 2 Adsorption kinetic parameters under different conditions

2.2 nano-TiO2和PO43-互作對萊茵衣藻生長的影響

不同濃度PO43-對萊茵衣藻藻密度影響隨時間變化如圖3 所示。從圖3 可知，在8 d 的培養(yǎng)期內(nèi)，P0.5T0和P1.0T0處理組藻密度沒有明顯差異，但是隨著PO43-濃度的降低（P0.1T0和P0.013T0處理組）萊茵衣藻生長受到顯著抑制。試驗后期（5 ～8 d），P0.1T0和P0.013T0處理組藻密度僅有P1.0T0處理組的77.01%～84.00% 和17.00%～20.86%。這可能是因為PO43-為微藻生長必需的營養(yǎng)鹽，充足的PO43-有利于藻細(xì)胞的生長。在PO43-濃度為0.1、0.5 mmol/L時，與無nano-TiO2添加組相比，2 mg/L nano-TiO2暴露對萊茵衣藻生長沒有顯著影響，2 個處理組藻密度沒有顯著性差異（P＞0.05）；但隨著nano-TiO2濃度增至20 mg/L，P0.1T20和P0.5T20處理組生長受到顯著抑制〔圖3(b)、圖3(c)〕，其藻密度僅是無nano-TiO2添加組的81.96% 和74.27%。研究表明[23,27]，nano-TiO2團(tuán)聚物會附著在藻細(xì)胞表面，這可能會減少被包裹的藻細(xì)胞所能獲得的光和養(yǎng)分，從而抑制其生長。Chen 等[23]還發(fā)現(xiàn)nano-TiO2在萊茵衣藻藻細(xì)胞表面的團(tuán)聚作用呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，濃度越高團(tuán)聚體數(shù)量越多。這也在一定程度上解釋了本研究中nano-TiO2濃度與藻生長所受抑制之間的關(guān)系。而對P0.013T20組而言，高濃度nano-TiO2（20 mg/L）與相對低PO43-濃度（0.013 mmol/L）共同作用，使得萊茵衣藻在試驗初期就停止了生長，因此圖表中無P0.013T20試驗組數(shù)據(jù)。但P1.0T20處理組藻細(xì)胞的生長并未受到nano-TiO2濃度升高的影響〔圖3(d)〕，這可能是因為充足的PO43-促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長，減輕nano-TiO2對藻細(xì)胞抑制作用。

圖3 不同PO43-及nano-TiO2濃度下萊茵衣藻的藻密度變化Fig.3 Density changes of Chlamydomonas reinhardtii under different concentrations of PO43- and nano-TiO2

2.3 nano-TiO2與PO43 -互作對萊茵衣藻As 累積效果的影響

不同處理下萊茵衣藻細(xì)胞不同生長階段對As 的累積如圖4 所示。由圖4 可知，暴露初期（第1 天），P0.013T0、P0.1T0處理組萊茵衣藻As 累積量為分別為（40.34±6.68）和（50.21±2.94）μg/g，顯著高于P0.5T0和P1.0T0處理組〔（12.89±0.98）和（21.61±5.56）μg/g〕（P＜0.05）。經(jīng)饑餓處理的微藻恢復(fù)到適宜生長的條件后，由于超補(bǔ)償效應(yīng)會顯著增加對營養(yǎng)鹽的吸收[28]，且砷酸鹽與磷酸鹽有著相同的內(nèi)化機(jī)制，能通過多種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入藻體[29]，因此在0.013 和0.1 mmol/L PO43-處理條件下，As(Ⅴ) 在與PO43-的競爭轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中占優(yōu)勢，同時藻細(xì)胞傾向于合成更多的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以減輕磷限制[30-31]，進(jìn)而促進(jìn)了As 的累積。Wang 等[32]研究了不同PO43-濃度下杜氏鹽藻對砷酸鹽的累積動力學(xué)，亦發(fā)生類似的現(xiàn)象。而在第4、8 天，P0.013T0、P0.1T0處理組As的累積水平和變化規(guī)律與P0.5T0和P1.0T0處理組規(guī)律基本一致，這可能和微藻的超補(bǔ)償作用隨培養(yǎng)時間的延長而降低有一定的關(guān)系[33]。

圖4 不同處理下萊茵衣藻細(xì)胞不同生長階段對As 的累積Fig.4 As accumulation in Chlamydomonas reinhardtii cells at different growth stages in different treatments

Nano-TiO2的加入顯著促進(jìn)了第1 天0.013、0.1 和0.5 mmol/L PO43-處理條件下藻細(xì)胞對As 的累積，且隨著nano-TiO2濃度的升高，藻細(xì)胞對As 的累積量也隨之增加。尤其是0.013、0.1 mmol/L PO43-濃度下，P0.013T2處理組〔（99.62±14.57）μg/g〕的藻細(xì)胞As 累積量是P0.013T0處理組〔（40.34±6.68）μg/g〕的246.95%，P0.1T2〔（105.70±7.58）μg/g〕和P0.1T20〔（155.01±13.93）μg/g〕處理組的藻細(xì)胞As 累積量分別是P0.1T0處理組〔（50.21±2.94）μg/g〕的210.52%和308.72%。nano-TiO2對As 很強(qiáng)的吸附能力[26]，可作為載體促進(jìn)藻細(xì)胞對As 的累積。Luo 等[34]在研究nano-TiO2對銅綠微囊藻和斜生柵藻As 生物利用和轉(zhuǎn)化的影響中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。與PO43-濃度為0.013、0.1 和0.5 mmol/L 的處理組不同，1.0 mmol/L PO43-處理條件下nano-TiO2的載體效應(yīng)暴露初期較低，這可能是因為高濃度 PO43-(1.0 mmol/L)條件下nano-TiO2對As 的吸附率較低（圖2）、載體效應(yīng)不明顯所致。同時，研究表明，As(Ⅴ)、PO43-與nano-TiO2在藻細(xì)胞表面有著相同的結(jié)合位點(diǎn)（—COOH和—NH2）[35-38]。高濃度的PO43-（1.0 mmol/L）在一定程度上抑制了As(Ⅴ)、nano-TiO2在萊茵衣藻上的吸附，進(jìn)而降低了納米的載體效應(yīng)，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞對As 的累積量不高。

對數(shù)生長期（暴露第4 天），培養(yǎng)基中PO43-濃度為0.013 和0.1 mmol/L 時，P0.013T2處理組藻細(xì)胞中As 累積量〔（22.21±3.72）μg/g〕僅有第1 天累積量的22.29%，P0.1T2處理組藻細(xì)胞中As 累積量〔（26.02±3.95）μg/g〕僅有第1 天累積量的24.62%。這可能是因為隨著培養(yǎng)時間的延長，nano-TiO2的載體效應(yīng)呈降低趨勢。李金麗等[39]的研究表明，nano-TiO2在SM7 培養(yǎng)基中迅速團(tuán)聚成大顆粒并發(fā)生沉降。本試驗結(jié)果也表明，48 h 后2、20 mg/L nano-TiO2在培養(yǎng)基中的保持率分別僅有29.60%～57.76%和9.65%～13.53%，這將不利于nano-TiO2顆粒攜帶As 進(jìn)入藻細(xì)胞。微藻因其較大的比表面積及較多的官能團(tuán)，可以吸附、吸收水環(huán)境中的金屬離子和納米顆粒而被廣泛應(yīng)用于水處理中。從本試驗的結(jié)果來看，在0.013、0.1 mmol/L PO43-濃度下，nano-TiO2持續(xù)暴露1 d 均能有效促進(jìn)藻細(xì)胞對As 的吸收與吸附。其中，0.1 mmol/L PO43-條件下微藻能耐受更高濃度的nano-TiO2（20 mg/L），且獲得更高的累積量。但是，0.1 mmol/L PO43-顯著高于自然環(huán)境下PO43-濃度，在去除As 污染的同時可能會增加水體磷負(fù)荷。因此，在應(yīng)用微藻和納米材料處理As 污染水體時，應(yīng)合理設(shè)置PO43-濃度以及藻細(xì)胞、納米材料和As 作用時間，以獲得最佳的As 去除率。

2.4 nano-TiO2與PO43-互作對萊茵衣藻As 生物轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用

不同處理下萊茵衣藻細(xì)胞中各As 形態(tài)占比如圖5 所示。由圖5 可知，培養(yǎng)8 d 后，P0.1T0、P0.5T0和P1.0T0處理組藻細(xì)胞內(nèi)檢測到的水溶性As 有As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和DMA，但是P0.013T0處理組僅檢測到As(Ⅴ)，這可能是因為缺磷條件下藻細(xì)胞膜的完整性水平降低[40]，As(Ⅴ)還原生成的As(Ⅲ)更易排出藻細(xì)胞所致。Wang 等[41]研究了不同PO43-濃度下銅綠微囊藻對As 的吸收和凈化，也發(fā)現(xiàn)低磷條件下藻細(xì)胞中As 的外排速率顯著高于富磷條件。

圖5 不同處理下萊茵衣藻細(xì)胞中各As 形態(tài)占比（第8 天）Fig.5 Percentage of As speciation in Chlamydomonas reinhardtii cells in different treatments (Day 8)

值得注意的是，添加nano-TiO2后，PO43-濃度為0.1、0.5 和1.0 mmol/L 的處理組中藻細(xì)胞內(nèi)除As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和DMA 外還檢測到一種未知As 形態(tài)(圖5)。根據(jù)張金羽等[19,42]的研究，該未知的As 形態(tài)是含氧砷糖的一種——磷酸砷糖（phosphate arsenosugar）（圖6）。這表明nano-TiO2的存在，使得As(Ⅴ)在萊茵衣藻細(xì)胞中的生物轉(zhuǎn)化途徑發(fā)生了轉(zhuǎn)變。Miyashita 等[43]研究發(fā)現(xiàn)脂溶態(tài)砷化物——磷脂酰砷糖的基本結(jié)構(gòu)中包括甘油砷糖和磷酸砷糖，并指出砷糖可能是合成砷脂的前體化合物。Ender 等[44]認(rèn)為砷糖能實現(xiàn)某些基本的細(xì)胞功能，比如結(jié)合到細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中。納米顆粒能夠通過大量積累活性氧（ROS）、物理化學(xué)作用或酶活性調(diào)節(jié)破壞細(xì)胞磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)[45]，導(dǎo)致磷脂降解，降低細(xì)胞膜的完整性、流動性和選擇性。nano-TiO2與細(xì)胞膜相互作用可能會促進(jìn)某些酶的表達(dá)（arsM 等[46]），進(jìn)而促進(jìn)萊茵衣藻砷糖的生物合成。而且在nano-TiO2濃度相同時，隨著PO43-濃度的降低，藻細(xì)胞內(nèi)砷糖所占的比例逐漸增加(圖5)。Glabonjat 等[47]的研究也得到類似的結(jié)果，富磷條件導(dǎo)致PicocystisML 菌株砷糖下調(diào)，反之上調(diào)。這在一定程度上印證了nano-TiO2和磷限制處理可以促進(jìn)藻細(xì)胞合成含氧砷糖等化合物來代替實現(xiàn)PO43-的功能這一推測。與PO43-濃度為0.1、0.5 和1.0 mmol/L 的處理組不同，P0.013T2組藻細(xì)胞內(nèi)僅檢測到As(Ⅴ) 和As(Ⅲ)，這可能是因為nano-TiO2和缺磷共處理使萊茵衣藻生長受到抑制，無法進(jìn)行無機(jī)As 的甲基化。

圖6 不同形態(tài)As 的HPLC-ICP-MS 譜圖Fig.6 HPLC-ICP-MS spectra of As species

2.5 nano-TiO2與PO43 -互作對萊茵衣藻As 外排的調(diào)控作用

萊茵衣藻可以對As(Ⅴ)進(jìn)行吸收、轉(zhuǎn)化以及外排。經(jīng)過8 d 的暴露，培養(yǎng)基中主要檢測到的As 形態(tài)為As(Ⅴ)和As(Ⅲ)，0.1和0.5 mmol/LPO43-處理組中還有少量DMA（圖7）。Guo 等[48]的研究也發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻在磷有限和富磷條件下培養(yǎng)基中僅觀察到DMA 和無機(jī)砷。筆者認(rèn)為這可能是因為MMA只是作為As(Ⅴ) 生物轉(zhuǎn)化的中間體被迅速轉(zhuǎn)化為DMA[49]，也說明DMA 這種甲基砷形態(tài)在As 的生物轉(zhuǎn)化中的優(yōu)勢。

圖7 不同處理下培養(yǎng)基中各As 形態(tài)占比（第8 天）Fig.7 Percentage of As species in culture medium of different treatments (Day 8)

PO43-濃度對培養(yǎng)基中As 的形態(tài)有很大影響。隨著PO43-濃度從0.013 mmol/L 增至1.0 mmol/L，培養(yǎng)8 d 后單獨(dú)的PO43-處理組培養(yǎng)基中As(Ⅲ)的濃度分別為（744.24±3.42）、（710.38±8.60）、（577.04±13.95）、（33.56±3.30）μg/L，分別占培養(yǎng)基中總As 濃度的99.19%、96.66%、87.10%和5.38%，呈顯著下降趨勢（圖7）。Zhang 等[18]在研究不同PO43-濃度下藍(lán)藻對As 的氧化還原時也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。由于PO43-與As(Ⅴ)的結(jié)構(gòu)類似，在微藻對As(Ⅴ)的吸收與吸附過程中存在競爭效應(yīng)。隨著PO43-濃度降低，藻細(xì)胞對As(Ⅴ)的吸收增加[18]，進(jìn)而促進(jìn)了As(Ⅲ)的還原與外排。研究表明[30]，萊茵衣藻對As(Ⅲ)的耐受性（EC50為132.2 mg/L）[50]高于As(Ⅴ)（33.5 mg/L）。因此，在0.013 和0.1 mmol/L PO43-濃度下，雖然培養(yǎng)基中As(Ⅲ)的濃度和占比顯著提高，但是對萊茵衣藻生長沒有顯著影響。

與單獨(dú)的PO43-處理組相比，nano-TiO2和PO43-共處理組培養(yǎng)基中As(Ⅲ) 占比和濃度隨著nano-TiO2濃度的增加而降低，尤其是0.5 mmol/L PO43-濃度下，2 和20 mg/L nano-TiO2添加組培養(yǎng)基中As(Ⅲ)占比分別為44.99% 和30.76%，顯著低于PO43-單獨(dú)處理組（87.10%）。微藻能夠?qū)s(Ⅴ)在細(xì)胞內(nèi)還原為As(Ⅲ)并進(jìn)行甲基化，Xue 等[42]研究利用Synechocystissp. PCC6803 證明了DMA 參與砷糖的生物合成。細(xì)胞內(nèi)的As 形態(tài)結(jié)果表明，nano-TiO2添加組砷糖為主要形態(tài)的As，這可能是由于其暴露細(xì)胞內(nèi)還原的As(Ⅲ)作為底物參與砷糖的生物合成，而不是簡單的外排。此外，Chen 等[51]將斜生柵藻暴露在2 mg/L的nC60 中，發(fā)現(xiàn)在各亞細(xì)胞組分中納米顆粒在藻細(xì)胞壁（細(xì)胞碎屑中的一部分）中占比最高；Geitner 等[52]做了類似的研究，也觀察到金納米粒子主要分布于小球藻細(xì)胞壁組分中。這些研究結(jié)果均表明細(xì)胞壁是藻細(xì)胞阻擋納米顆粒的主要屏障，進(jìn)而抑制藻細(xì)胞對納米結(jié)合態(tài)As(Ⅴ) 的吸收、還原與外排。而且，細(xì)胞壁對納米材料的攔截作用在一定程度上也可以解釋以下現(xiàn)象，即相同PO43-濃度下培養(yǎng)基中As(Ⅲ)占比隨著nano-TiO2濃度的增加而降低，因為nano-TiO2對As(Ⅴ) 的吸附隨納米顆粒濃度的增加而增加。

3 結(jié)論

（1）萊茵衣藻生長受PO43-和nano-TiO2共同影響，0.013 mmol/L 的PO43-和20 mg/L 的nano-TiO2均能顯著抑制藻細(xì)胞的生長。

（2）暴露初期（1 d），nano-TiO2的添加顯著促進(jìn)了PO43-濃度為0.013、0.1 和0.5 mmol/L 時藻細(xì)胞對As 的累積，且隨著nano-TiO2濃度的升高，藻細(xì)胞對As 的累積量也隨之增加。但是隨著培養(yǎng)時間的延長，nano-TiO2的載體效應(yīng)逐漸降低。因此，在應(yīng)用微藻和納米材料處理含As 廢水時，應(yīng)合理設(shè)置微藻、nano-TiO2和As 作用時間以獲得最佳的去除率。

（3）當(dāng)nano-TiO2存在時，進(jìn)入藻細(xì)胞的As(Ⅴ)除了還原成As(Ⅲ)并甲基化生成DMA 外，還能轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、毒性更低的砷糖；且隨著PO43-濃度的降低，藻細(xì)胞內(nèi)砷糖所占的比例逐漸增加，這可能會抑制As(Ⅲ)的外排。此外，nano-TiO2對As(Ⅴ)的吸附作用以及藻細(xì)胞壁對nano-TiO2的攔截作用也可能會抑制微藻對As(Ⅴ)的吸收，進(jìn)而降低培養(yǎng)基中As(Ⅲ)的濃度。

（4）研究表明，納米顆粒改變了As(Ⅴ)在萊茵衣藻藻細(xì)胞中的生物轉(zhuǎn)化途徑，但nano-TiO2介導(dǎo)下微藻As 吸收轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。