土茯苓和白土茯苓總黃酮的優(yōu)化提取及抗氧活性的比較

張光林，肖敏，鄭毓安，胡宗禮

韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院（韶關(guān) 512005）

土茯苓為光葉菝葜科植物Smilax glabraRoxb.的根莖，具有清熱利濕、健脾益胃、補益肝腎等功效，常用于中醫(yī)臨床治療肝腎虧虛、脾胃虛弱、水腫等癥狀[1-2]。此外，土茯苓是一種常見的食材，含有豐富的總黃酮、維生素和礦物質(zhì)，如維生素B1、維生素B2、維生素C、鈣、鐵等，具有促進消化、增進食欲、有利于水腫患者的康復(fù)、延緩衰老、保持皮膚彈性和光澤等多種保健作用，因此在食品中有著廣泛的應(yīng)用前景[3]。

一直以來，在食品藥品質(zhì)量檢查中常有土茯苓的混淆品，如薯蕷科植物粉萆薢Dioscorea hypoglaucaPalibin的根莖，百合科植物菝葜Smilax chinaL的根莖，百合科植物百合科肖菝葜Heterosmilax japonicaKunth的根莖[4]。不同土茯苓來源、生長環(huán)境、采收時間等因素可能會對土茯苓中總黃酮含量和成分產(chǎn)生影響，甚至一些混淆品可能會對患者的健康產(chǎn)生不良影響，因此正確區(qū)分土茯苓的混淆品具有重要意義。

試驗采用超聲輔助-響應(yīng)面法提取土茯苓、白土茯苓根莖總黃酮，并從料液比、提取溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取所需時間3個因素優(yōu)化2種土茯苓根莖總黃酮提取工藝，進一步比較最優(yōu)提取條件下2種土茯苓提取物總黃酮的抗氧化活性。正確區(qū)分土茯苓的混淆品對于消費者的健康有重要保障作用，旨在為土茯苓、白土茯苓總黃酮的提取提供技術(shù)指導(dǎo)，為土茯苓綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

土茯苓和白土茯苓藥材片（安徽省毫州市福碩堂生物有限公司），經(jīng)鑒定為百合科（Liliaceae）菝葜屬（Smilax）土茯苓（Smilax glabraRoxb.）和百合科（Liliaceae）肖菝葜屬（Heterosmilax）白土茯苓（Heterosmilax japonicaKunth）。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸、鄰苯三酚（均為Solarbio）；福林酚試劑（北京天恩澤基因科技有限公司）；抗壞血酸（韶關(guān)市天安科技有限公司）；1-二苯-2-苦基肼（DPPH，APExBIO）。

紫外分光光度計（T-UV1810，上海佑科儀器儀表有限公司）；精密天平（GL8201i-1SCN，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；離心機（JIDI-16R，廣州吉迪儀器有限公司）；精密型電子天平（ME203，梅特勒托利多科技有限公司）；恒溫水浴鍋（HWS-12，沙鷹科學(xué)儀器有限公司）；超聲清洗儀（SK2200B，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；多功能粉碎機（800Y，永康市鉑歐五金制品有限公司）。

1.2 土茯苓總黃酮的提取

土茯苓總黃酮的提取采用超聲波輔助乙醇提取法。取一定量干燥的土茯苓樣品，攪拌機打成粉末，用孔徑0.230 mm（65目）過濾篩過濾得到干燥的土茯苓粉，備用。準(zhǔn)確稱取1.0 g土茯苓粉末，用乙醇溶液溶解，進行超聲輔助提取，分別以料液比、提取溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時間進行單因素試驗，最終得到土茯苓提取液。

1.3 NaNO2-Al(NO3)3比色法測定土茯苓總黃酮含量

總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，波長510 nm處測吸光度，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=13.36x-0.011 4，R2=0.995 1。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品總黃酮含量，通過式（1）計算提取物總黃酮得率。

式中：c為經(jīng)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的土茯苓提取液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為稱取的土茯苓粉質(zhì)量，mg。

1.4 超聲波輔助提取土茯苓化學(xué)成分的工藝優(yōu)化

以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間進行單因素試驗[5-6]，通過單因素試驗優(yōu)化提取土茯苓總黃酮的條件，應(yīng)用Design-Expert 12.0軟件，分別設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，利用響應(yīng)面試驗結(jié)果，確定土茯苓中各化學(xué)成分的最佳提取條件。響應(yīng)面試驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表

1.5 土茯苓和白土茯苓總黃酮對DPPH自由基的清除能力測定

取不同質(zhì)量濃度（15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL）的VC、土茯苓和白土茯苓樣品溶液，溶液中加入等體積DPPH溶液（0.1 mg/mL），混勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定反應(yīng)體系的吸光度。等體積無水乙醇替代DPPH溶液制備溶劑空白組和等體積無水乙醇替代樣品溶液制備樣品空白組，VC作為陽性對照組。重復(fù)3次，根據(jù)式（2）計算提取液對DPPH清除率。

式中：A0為相同條件下，等體積DPPH和無水乙醇的吸光度；As為相同條件下，等體積DPPH和樣品溶液的吸光度；Ac為相同條件下，等體積無水乙醇和樣品溶液的吸光度。

1.6 土茯苓和白土茯苓總黃酮對超氧陰離子自由基清除能力的測定

準(zhǔn)確量取配制0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），在25 ℃恒溫水浴鍋中保溫20 min，加入不同濃度的土茯苓和白土茯苓樣品（質(zhì)量濃度15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL），混勻后加入0.3 mL 25 ℃水浴中預(yù)熱后的50 mmol/L鄰苯三酚試液。振蕩搖勻，置于25 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)4 min，反應(yīng)結(jié)束后，向試管中加入0.2 mL 6.0 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。在325 nm波長處測吸光度，記錄數(shù)據(jù)。以VC作為陽性對照。根據(jù)式（3）計算O2-清除率。

式中：A1為相同條件下，鄰苯三酚和樣品的吸光度；A2為相同條件下，鄰苯三酚和蒸餾水的吸光度；A0為相同條件下，蒸餾水和樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 土茯苓和白土茯苓的鑒別

如圖1所示，所購買的土茯苓（Smilax glabraRoxb.）藥材為干燥切片，表面呈淡紅褐色，粗糙，質(zhì)地較白土茯苓（Heterosmilax japonicaKunth）更加堅硬，難折斷，粉末較少，水濕潤后有黏滑感。白土茯苓藥材為干燥切片，表面呈黃褐色，粗糙，質(zhì)地堅硬，有較多粉末，加水濕潤無黏滑感。

圖1 土茯苓和白土茯苓藥材片的直觀圖

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時間對提取土茯苓總黃酮的影響

2.2 單因素試驗對土茯苓總黃酮得率的影響

通過比較乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時間單因素試驗優(yōu)化土茯苓總黃酮的提取，得到適宜提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1︰30（g/mL）和提取時間30 min，此時總黃酮得率達12.30%~12.86%。

2.3 響應(yīng)面法分析土茯苓總黃酮的提取

通過響應(yīng)面法對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間單因素分析，得到提取土茯苓總黃酮試驗方案及結(jié)果，見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

通過Design-Expert 12.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，料液比和提取時間（P＜0.05）對總黃酮提取影響顯著。以土茯苓中總黃酮得率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程（4）。

表3 方差分析

據(jù)方差分析結(jié)果，回歸方程描述與響應(yīng)面值之間的關(guān)系時因其模型的P＜0.01（顯著），差擬項檢驗的P=0.224 7（不顯著），R2=0.939 2，表明模型充分?jǐn)M合試驗數(shù)據(jù)[5]，該方程是土茯苓中總黃酮得率與提取工藝各參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，所以，可以利用此回歸方程確定土茯苓中總黃酮的最佳提取工藝。

響應(yīng)面圖是三維空間中各試驗因子（A乙醇體積分?jǐn)?shù)、B料液比、C提取時間）對響應(yīng)值的曲面圖，直觀顯示最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。圖3展示回歸分析結(jié)果，提取時間和料液比對總黃酮得率影響較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)次之?；貧w分析結(jié)果與等高線圖所顯示的圓心處的極值條件一致[5]。表3回歸分析結(jié)果也顯示提取時間和料液比對總黃酮的得率影響顯著（P＜0.05）。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時間對提取白土茯苓總黃酮的影響

通過軟件分析確定最佳黃酮提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、料液比1︰34（g/mL）、提取時間33 min，在此條件下由回歸方程（4）算出的理論值為12.80%。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進行2組驗證試驗，總黃酮平均得率為12.94%，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

2.4 單因素試驗白土茯苓總黃酮得率的影響

同理通過比較乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時間單因素試驗優(yōu)化白土茯苓總黃酮的提取，獲得最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1︰40（g/mL）、提取時間40 min，此時總黃酮得率為1.70%~1.92%。

2.5 響應(yīng)面法分析白土茯苓總黃酮的提取

通過響應(yīng)面法對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間單因素分析，得到提取白土茯苓總黃酮試驗方案及結(jié)果，見表4。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

通過Design-Expert 12.0軟件對表4的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果如表5所示。料液比和提取時間（P＜0.05）對總黃酮提取影響顯著。以土茯苓中總黃酮得率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程（5）。

表5 方差分析

據(jù)方差分析結(jié)果，回歸方程描述與響應(yīng)面值之間的關(guān)系時因其模型的P＜0.000 1（顯著），差擬項檢驗的P=0.474 0（不顯著），R2=0.977 7，表明模型充分?jǐn)M合試驗數(shù)據(jù)[5]，該方程是白土茯苓中總黃酮得率與提取工藝各參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，所以，可以利用此回歸方程確定白土茯苓中總黃酮的最佳提取工藝。

根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等值線圖結(jié)果，見圖5。乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間對總黃酮得率影響較大，料液比次之，表5回歸分析結(jié)果也與此相吻合，提取時間、料液比二者對應(yīng)的P值小于0.05，均達到顯著水平。

圖5 兩因素交互作用對白土茯苓總黃酮得率的響應(yīng)面圖和等高線圖

通過軟件分析確定最佳白土茯苓黃酮提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)74%、料液比1︰39（g/mL）、提取時間43 min，此條件下由回歸方程（5）算出的理論值為1.92%。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進行兩組驗證試驗，總黃酮平均得率為1.95%，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

2.6 土茯苓和白土茯苓提取物對DPPH和超氧陰離子自由基的清除作用

通過檢測DPPH和超氧陰離子自由基的清除作用以評價土茯苓和白土茯苓的抗氧活性。標(biāo)準(zhǔn)品抗壞血酸具有較高的清除DPPH和O2-的能力（圖6）。通過計算，樣品質(zhì)量濃度為15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL時，土茯苓總黃酮含量為2，4，8，16，32和64 μg/mL，而白土茯苓總黃酮含量為0.3，0.6，1.2，2.4，4.9和9.8 μg/mL。土茯苓清除DPPH自由基的能力大于白土茯苓，總黃酮含量達到8 μg/ml以上時，其對DPPH自由基的清除作用趨于穩(wěn)定，達到84%以上（圖6 A）。土茯苓對O-2清除能力大于白土茯苓，總黃酮含量達到32 μg/mL以上時，O2-自由基的清除率穩(wěn)定在80%以上。結(jié)果表明土茯苓和白土茯苓的抗氧活性與總黃酮的含量呈正相關(guān)關(guān)系。

圖6 土茯苓和白土茯苓提取物對DPPH和O2-自由基的清除作用

3 討論與結(jié)論

土茯苓與白土茯苓被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥和保健食品中，具有較大的市場需求。已報道研究對土茯苓、白土茯苓及易混淆品種從藥材性狀、粉末特征、顯微特征等多個方面進行鑒別[7-12]。以土茯苓、白土茯苓總黃酮含量及抗氧活性為研究對象，探索得到的土茯苓總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、料液比1︰34（g/mL）、提取時間33 min，總黃酮提取率為12.94%；白土茯苓總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)74%、料液比1︰39（g/mL）、提取時間43 min，總黃酮提取率為1.95%。李保利等[13]比較普通回流法、索氏提取法和浸漬法提取土茯苓總黃酮，存在過程繁瑣、耗費時間長等情況，總黃酮的最佳得率在10%~12%。喬蕾等[14]以70%的乙醇為提取溶劑，采用加熱回流提取白土茯苓總黃酮，得率為1.19%，相比于加熱回流的方法，試驗采用的超聲輔助法提取白土茯苓的提取效率更高?？寡趸钚栽囼灡砻?，總黃酮含量越高抗氧化能力越強，土茯苓比白土茯苓具有更好的抗氧化活性。試驗結(jié)果為土茯苓、白土茯苓市場上的鑒別及應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。