利用汞膜修飾電極對培養(yǎng)基環(huán)境下成肌細胞吸收Cu2+的定量分析研究

朱曉璐*，程 浩，趙文杰，尹 曦，盧勝波

（1.河海大學 機電工程學院，江蘇 常州；2.康達斯（南京）科技有限公司，江蘇 南京）

銅是生物體必須的微量元素，成年人每天正常的銅攝入量約為1.5～3 mg[1]。生物體銅離子濃度需維持在一個相對穩(wěn)定的水平(如，血清銅10～20 μmol/L)，濃度過高或過低會造成嚴重生理問題，甚至危及生命[2-3]。銅對細胞代謝具有重要作用[4]，銅代謝障礙會引起Menkes 氏綜合征和Wilson 氏綜合征。

為了實現(xiàn)對細胞的非破壞式的金屬離子吸收度的高靈敏度且滿足生物學研究需求的高精度定量檢測，本文提出針對細胞培養(yǎng)基的特性，優(yōu)化基于汞膜修飾工作電極的電化學測量設置，在對細胞完全培養(yǎng)基內(nèi)銅離子濃度標定的基礎上，通過檢測細胞培養(yǎng)液中剩余銅離子濃度，推導出細胞在生長過程對銅離子的吸收量。最后討論了汞膜修飾電極特點、培養(yǎng)基內(nèi)銅離子溶出峰的特點及C2C12 細胞對銅離子的吸收機制。

1 試驗材料與方法

1.1 儀器和試劑

試驗儀器：恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置生物顯微鏡、實驗室超純水機、FA1004 電子分析天平、RST5060F 電化學工作站、SN-MS-1D 磁力攪拌器、電化學三電極系統(tǒng)，修飾的玻碳電極為工作電極(3 mm GCE)，AgCl/Ag 電極為參比電極，鉑片電極為對電極。

試驗試劑材料與細胞培養(yǎng)方法：濃度120 mg/L Hg2+溶液；濃度0.1 g/L Cu2+溶液；濃度0.1 g/L Pb2+溶液；醋酸- 醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L）；Dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基；完全培養(yǎng)基是包含10% 胎牛血清和1% 青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM 溶液。實驗所用C2C12 細胞，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，約每48 h 傳代一次。

1.2 玻碳電極預處理

先將裸玻碳（Glassy Carbon，GC）電極用去離子水沖洗，然后在麂皮上用2 μm、200 nm 和30 nm 的Al2O3漿連續(xù)拋光，之后用去離子水沖洗，緊接著放入硝酸(20%)、乙醇(75%)和去離子水中分別超聲1 min，并在室溫下干燥，得到表面清潔且呈鏡面的玻碳電極。

1.3 修飾電極的制備

在工作電極上涂覆汞膜對于檢測銅離子具有靈敏度提高，穩(wěn)定性更好等特點[5]。取50 mL 濃度為120 mg/L 的Hg2+溶液于電解池中，加入攪拌子，置入三電極并接入電化學工作站，打開磁力攪拌器，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為300 rpm，選擇“恒電位電解i-t 曲線”，在-0.2 V 電壓下富集240 s，得到汞膜修飾的玻碳電極，備用。圖1 是裸玻碳電極和汞膜修飾電極在Cu2+和Pb2+濃度為50 ng/mL 的DMEM 培養(yǎng)基（不含血清）中的溶出伏安曲線對比。由圖1 可知，汞膜修飾電極上電子傳遞效率優(yōu)于裸電極。

圖1 汞膜修飾的玻碳電極（Hg/GCE）與裸玻碳電極(GCE)對銅離子的檢測對比曲線

1.4 電化學測量方法與步驟

完全培養(yǎng)基內(nèi)Cu2+含量標定：完全培養(yǎng)基中含有Cu2+，主要因為其含有的胎牛血清中含Cu2+，所以，需要用去離子水對其中的Cu2+含量進行標定：（1）首先將去離子水對照組的用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋5倍，最終pH 3.75, 體積為50 mL；（2）然后滴加2.5 μL 濃度10 mg/L 的CuCl2溶液，攪拌均勻后得到Cu2+濃度為0.5 ng/mL；（3）將汞膜修飾電極置入培養(yǎng)基中，設置參數(shù)如下：富集電位-1.2 V，富集時間480 s，起始電位-0.6 V，終止電位0 V，電位增量1mV，脈沖幅度0.1V，脈沖周期0.08 s，脈沖寬度0.01 s，采樣寬度0.002 s，得0.5 ng/mL 時的差分脈沖溶出伏安曲線；（4）繼續(xù)滴加CuCl2溶液，重復步驟3，最終得到0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 ng/mL 條件下的差分脈沖溶出伏安曲線（以下簡稱曲線）。

1.5 樣品標準濃度曲線的測定步驟

以檢測10 ng/mL Cu2+為例，（1）首先將空白對照組（不含胎牛血清的DMEM, 未加銅離子）的培養(yǎng)基用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋5 倍，體積為50 mL；（2）然后滴加5 μL 濃度10 mg/L 的CuCl2溶液，攪拌均勻；（3）將汞膜修飾電極置入培養(yǎng)基中，設置參數(shù)同上；（4）繼續(xù)滴加CuCl2溶液，重復步驟（3），最終得到濃度為1，2，3，4，5，6 ng/mL 條件下曲線；(5) 將培養(yǎng)C2C12 細胞3 天后回收的10 mL 完全培養(yǎng)基按步驟(1)稀釋5 倍，按照步驟(3)，得到外加 10 ng/mL Cu2+的曲線；(6) 計算得到外加10 ng/mL 完全培養(yǎng)基中剩余Cu2+的含量。同理，對外加50 ng/mL 和500 ng/mL 銅離子的情況進行測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 完全培養(yǎng)基內(nèi)所含Cu2+的濃度的測定結(jié)果

由于牛血清中的銅藍蛋白和胺氧化酶都含有銅，所以完全培養(yǎng)基本身就含有一定量的銅[6]，只是并非全部以離子形式存在。根據(jù)此測量，得到稀釋5 倍后的完全培養(yǎng)基中Cu2+濃度為3.14 ng/mL，故原完全培養(yǎng)基中的銅離子濃度近似為3.14×5=15.7 ng/mL。

2.2 Cu2+對C2C12 生長增殖的影響

圖2 表示加入梯度濃度Cu2+72 h 后對C2C12 細胞生長和增殖的影響。圖2(a)表示對照組和初始添加10，50，500 ng/mL Cu2+的完全培養(yǎng)基實驗組以初始細胞數(shù)為300 k 培養(yǎng)72 h 后的細胞生長形貌（10 cm培養(yǎng)皿），圖2(b)表示細胞數(shù)量（10 cm 培養(yǎng)皿）。10 ng/mL Cu2+對細胞增殖具有促進作用。50 ng/mL Cu2+對細胞增殖具有促進作用且增殖率相對于10 ng/mL條件下更大。500 ng/mL Cu2+對細胞增殖具有抑制作用且作用很明顯。

圖2 加入不同濃度的Cu2+ 72 h 后對C2C12 細胞生長和增殖后數(shù)量的影響。第三天的細胞數(shù)量為平均值±標準差。

2.3 C2C12 成肌細胞對Cu2+吸收度的測量結(jié)果及討論

在空白對照組培養(yǎng)基（DMEM）中添加預設定量的銅離子，進而測量出不同標準濃度對應的峰電流，進而確定標準曲線；接著利用峰電流與濃度之間的線性關系，確定實驗組培養(yǎng)基中剩余Cu2+濃度。圖3(a)中，用醋酸-醋酸鈉緩沖液，將目標培養(yǎng)液稀釋為原來體積的5 倍, 測得紅線條峰值對應濃度約為2.1 ng/mL，故3 天后銅離子濃度接近10.5 ng/ml，即相對初始Cu2+濃度(25.7 ng/ml), 細胞約吸收了15.2 ng/ml 銅離子。同理，根據(jù)圖3(b)，50 ng/mL 實驗組培養(yǎng)72 h 后，培養(yǎng)基中剩余Cu2+濃度為7.214 ng/mL × 5 = 36.07 ng/mL，表明細胞對Cu2+吸收量為50+15.7-36.07=29.63 ng/ml。根據(jù)圖3(c)，得到500 ng/mL 實驗組培養(yǎng)72 h 后，細胞吸收Cu2+的量為129.44 ng/ml。

圖3 加入不同濃度的Cu2+ 溶液72 h 后培養(yǎng)基中剩余Cu2+濃度的差分脈沖溶出伏安曲線及相應范圍的濃度標定曲線

上述試驗結(jié)果表明了本三電極體系及相關的參數(shù)配置能夠定量檢測培養(yǎng)基中的銅離子(最小可檢測濃度變化量為0.5 ng/mL)，且試驗結(jié)果高度可重復。對于本體系中采用的汞膜修飾工作電極利于捕獲銅離子的機制方面的解釋如下：Cu2+在一定的預電解電位下富集后在汞膜上形成汞齊，靜止一段時間后，再反掃到初始電位，使汞齊中已經(jīng)被還原的銅單質(zhì)氧化，變成銅離子后進入溶液。當測量時的溶液是醋酸鹽緩沖液（不含培養(yǎng)基）時，Cu2+在-0.05 V 附近出現(xiàn)溶出峰，當介質(zhì)溶液為細胞培養(yǎng)基時，銅溶出峰左移。其內(nèi)在機制可能是培養(yǎng)基中的氨基酸、谷氨酰胺和多種維生素等使得銅離子在工作電極的沉積時受到干擾，銅汞之間的微觀作用力相對減小，所以銅在培養(yǎng)基溶液中更容易溶出(溶出峰偏左）。

3 結(jié)論

本研究能夠檢測培養(yǎng)基內(nèi)銅離子最低0.5 ng/mL的變化量，線性測量范圍：1-150 ng/mL。當介質(zhì)溶液為細胞培養(yǎng)基時，銅溶出峰左移。外加銅離子濃度達到50 ng/mL 時成肌細胞依然保持增殖，但外加銅離子濃度達到500 ng/mL 時成肌細胞數(shù)量下降，且細胞對銅離子的吸收度隨初始添加的銅離子濃度變化而變化。